LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER PENGENALAN SITUS BIOINFORMATIKA NCBI DAN PENGGUNAANNYA DALAM MEMAHAMI PROSES EKSPRESI GEN Oleh: Nabila Fatin Aisiah M0614026 S1 Farmasi 2014 Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta 2016
LAPORAN BIOLOGI MOLEKULER PERCOBAAN 2 PENGENALAN SITUS BIOINFORMATIKA NCBI DAN PENGGUNAANNYA DALAM MEMAHAMI PROSES EKSPRESI GEN I. Tujuan 1. Dapat menelusuri identitas suatu gen berdasarkan sekuen nukleotida menggunakan gene bank database. 2. Dapat memahami prinsip ekspresi gen yang meliputi transkripsi dan translasi serta regulasinya. 3. Dapat mengidentifikasi bagian gen yang berperan sebagai promoter, coding sequence (CDS), intron dan ekson, start dan stop kodon, serta regulating element. 4. Dapat memahami bagaimana suatu gen yang sama dapat menghasilkan protein yang berbeda. II. Dasar Teori Semua makhluk hidup memiliki materi genetik untuk mempertahankan kelangsungan struktur, sifat, fungsi dan aktivitas-aktivitas kimia dalam selnya. DNA merupakan salah satu jenis asam nukleat yang berperan sebagai materi genetic yang menurunkan sifat tertentu dari satu generasi ke generasi turunannya. Materi ini mengarahkan pembentukan protein dan RNA tertentu yang penting dalam sel makhluk hidup. DNA juga mengatur pertumbuhan dan pembelahan sel, termasuk informasi untuk diferensiasi sel sehingga terbentuk tumbuhan, hewan, manusia dan mikroorganisme lainnya. Begitu pentingnya DNA ini sehingga disebut sebagai molekul utama kehidupan (Wirahadikusumah, 1985). DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu. DNA alami terdiri dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks ganda. Basa A-T dan G-T
yang saling komplementer tersusun berpasangan melalui ikatan hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982). DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan phospat. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. Ikatan-ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat ( PO4-) sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga diberi nama asamnukleat (Goodenough. 1988). DNA akan mengalami denaturasi dan renaturasi. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau diberi alkali kuat, maka hubungan hydrogen menjadi labil dan putus. Dua pita spiral dari molekul DNA itu membuka. Proses ini disebut denaturasi DNA. Jika larutan tersebut kemudian didinginkan kembali atau dinetralisis secara perlahan-lahan maka terbentuklah pasangan-pasangan basa itu kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi (Jack, 1995). NCBI (National Centre for Biotechnology Information) adalah institusi yang konsen dalam sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat database yang dapat diakses secara umum, merangsang riset biologi terkomputasi, mengembangkan software penganalisis data genome dan menyebarkan informasi biomedical yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya. Adapun situs akses NCBI adalah : www.ncbi.nlm.nih.gov (Artanti, 2016). Bioinformatika merupakan kajian yang memadukan disiplin biologi molekul, matematika dan teknik informasi (TI). Ilmu ini didefinisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologi molekul. Biologi molekul sendiri juga merupakan bidang interdisipliner, mempelajari kehidupan dalam level molekul. Mula-mula bidang kajian ini muncul atas inisiatif para ahli biologi molekul dan ahli statistik, berdasarkan pola pikir bahwa semua gejala yang ada di alam ini bisa dibuat secara artificial melalui simulasi dari data-data yang ada. Pada bidang Bioinformatika, data-data atau tindak-tanduk gejala genetika menjadi inti
pembentukan simulasi. Pada saat ini, Bioinformatika ini mempunyai peranan yang sangat penting, diantaranya adalah untuk manajemen data-data biologi molekul, terutama sekuen DNA dan informasi genetika. Perangkat utama Bioinformatika adalah software dan didukung oleh kesediaan internet (Jordan, 1999). III. Alat dan Bahan 1. Alat Komputer Jaringan internet Kabel olor Charger 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 2. Bahan a. Sekuen DNA Atgaaggaaactgttcaagttcgtggacttcagtctcctgctctacttcccgtctgaggacttaaagaagcat ggtgccaccgtgctcaccgcgcagactcctgaatttcttcgtaccacggtggcacgagtggcgcctgggtg gcatccttaagaagaaggggcatcatgaggcagagggacccaccgtaggaattcttcttccccgtagtact ccgtctcattaagcccctggcacagtcgcatgccaccaagcacaagatcctaattcggggaccgtgtcagc gtacggtggttcgtgttctaggccgtgaagtacctggagttcatctcggaatgcatcatccaggtggcacttc atggacctcaagtagagccttacgtagtaggtccatctgcagagcaagcatcccggggactttggtgctgat gcccagagacgtctcgttcgtagggcccctgaaaccacgactacgggtcggggccatgaacaaggccct ggagctgttccggaaggacatggccccggtacttgttccgggacctcgacaaggccttcctgtacccctcc aactacaaggagctgggcttccagggctagggaggttgatgttcctcgacccgaaggtcccgatc b. Accession NM_005368.2
IV. Cara Kerja 1. Di buka situs NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov hingga tampil laman seperti ini, kemudian di klik pada menu BLAST. 2. Muncul tampilan pilihan program BLAST. Dipilih blastn (Nucleotide blast) untuk mencari gen suatu sekuen nukleotida dari database nukleotida. 3. Setelah tampilan muncul, dimasukkan sekuen nukleotida query yang dicari, kemudian dipilih setting data base Others, kemudian dipilih program megablast dan di klik tombol BLAST
4. Akan muncul hasil dengan lebih dari satu sekuen yang bersesuaian dengan sekuen yang dimasukkan. 5. Dipilih accession yang sesuai yaitu NM_005368.2
6. Muncul hasil blastn yang terdiri dari informasi-informasi seperti locus, definition, summary, features, CDS, mrna, exon dan nukleotid origin. V. Hasil dan Pembahasan a. Hasil 1. Locus: NM_005368 2. Definisi: Homo Sapiens myoglobin (MB), transcript variant 1, mrna 3. Summary: Gen ini mengkodekan anggota dari superfamili globin dan diekspresikan dalam otot rangka dan jantung. Kode protein ini merupakan haemoprotein yang berperan dalam penyimpanan oksigen intraseluler dan difusi oksigen transeluler terfasilitasi. Setidaknya terdapat 3 varian transkrip alternatif yang dilaporkan mengkodekan protein yang sama. 4. Features CDS: 81.. 545 Exon: 1.. 175 176.. 398 399.. 1078
Origin: Promoter: GACA 141 Start kodon: ATG 154 Stop kodon: TAG 543 61 tgtcttcttc agactgcgcc atggggctca gcgacgggga atggcagttg gtgctgaacg 121 tctgggggaa ggtggaggct gacatcccag gccatgggca ggaagtcctc atcaggctct 181 ttaagggtca cccagagact ctggagaagt ttgacaagtt caagcacctg aagtcagagg 241 acgagatgaa ggcgtctgag gacttaaaga agcatggtgc caccgtgctc accgccctgg 301 gtggcatcct taagaagaag gggcatcatg aggcagagat taagcccctg gcacagtcgc 361 atgccaccaa gcacaagatc cccgtgaagt acctggagtt catctcggaa tgcatcatcc 421 aggttctgca gagcaagcat cccggggact ttggtgctga tgcccagggg gccatgaaca 481 aggccctgga gctgttccgg aaggacatgg cctccaacta caaggagctg ggcttccagg 541 gctaggcccc tgccgctccc acccccaccc atctgggccc cgggttcaag agagagcggg 601 gtctgatctc gtgtagccat atagagtttg cttctgagtg tctgctttgt ttagtagagg b. Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan pengenalan terhadap situs bioinformatika NCBI dan penggunaannya dalam memahami proses ekspresi gen. Prinsip kerja dari praktikum ini ialah dengan membandingkan sekuen nukleotida yang dimiliki dengan database sekuen nukleotida untuk didapatkan identitas dari nukleotida yang kita ragukan tersebut baik nama gen dan spesies penghasil dari sekuen lengkapnya. Pada praktikum ini, digunakan situs bioinformatika NCBI. NCBI (National Centre for Biotechnology Information) merupakan institusi yang konsen terhadap sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI merupakan server yang memuat data base tentang informasi kesehatan dan bioteknologi. Database terus menerus diperbarui sesuai dengan penemuan-penemuan terkini yang menyangkut DNA, protein, senyawa aktif dan taksonomi. Di samping database, NCBI juga menyediakan berbagai macam software untuk analisis DNA, protein 3D, pencarian conserve domain dan lain sebagainya. NCBI merupakan salah satu bank data gen, protein dan literatur khususnya di bidang kesehatan. Pada NCBI, terdapat program BLAST (Basic Local Alignment Tool) yang merupakan suatu alat pencari untuk
menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang dimiliki melalui perbandingan sekuen pada gen bank DNA. Terdapat 5 program utama dari BLAST yaitu: 1. Nucleotide blast (blastn) Program untuk membandingkan sekuen nukleotida yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida. 2. Protein blast (blastp) Membandingkan suatu sekuen asam amino yang dimiliki dengan database sekuen protein 3. Blastx Membandingkan produk translasi konsep 6-frame protein nukleotida (translated nucleotide) yang dimiliki dengan database sekuen protein 4. Tblastn Membandingkan sekuen protein yang dimiliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame. 5. Tblastx Membandingkan suatu trnaslasi 6 frame dari nukleotida. Ekspresi gen merupakan proses penerjemahan informasi genetik menjadi protein. Pada proses ekspresi gen terjadi perubahan gen menjadi mrna yang disebut transkripsi dan perubahan mrna menjadi protein yang disebut translasi. (Chen, 1999).
(Orphanides, 2002). Transkripsi merupakan tahap awal proses sintesis protein dimana molekul RNA disintesi pada DNA template. Proses ini terjadi di kromosom. Proses ini membutuhkan enzim DNA polimerase yang menempel pada daerah promoter. Terdapat 3 tahapan proses transkripsi yaitu dimulai dari inisiasi. Inisiasi dimulai setelah enzim RNA polimerase menduduki daerah promoter dimana dimulai dengan pembentukan kompleks promoter terbuka, terjadi penggabungan beberapa nukleotida awal dan perubahan konformasi RNA polimerase karen sturktur sigma lepas dari kompleks holoenzim. Dilanjutkan dengan proses elongasi atau perpanjangan nukleotida dimana setelah RNA polimerase menempel pada promoter maka enzim tersebut akan bergerak sepanjang rantai DNA dan membuka ikatan heliks. Tahapan selanjutnya
ialah terminasi dimana proses transkripsi akan berhenti apabila telah menemui stop kodon. RNA selanjutnya akan terlepas dari DNA template menuju ribosom. Tahapan lanjutan ialah translasi yaitu penerjemahan mrna menjadi protein. Setelah sampai pada ribosom, mrna akan menempel pada subunit kecil ribosom (30s) lewat ujung 5. Pada saat bersamaan, trna menempel pada subunit besar ribosom (50s). Pada proses tersebut akan dimulai penerjemahan dari daerah start kodon yaitu AUG. Kodon start merupakan kode untuk proses perangkaian asam amino dimulai. Tahapan ini merupakan tahap inisiasi dari proses translasi. Setelah tahap inisiasi selesai, dilanjutkan dengan penerjemahan kodon triplet dan penempelan asam amino sehingga membentuk rantai. Penerjemahan kode ini diikuti pengikatan asam amino sesuai kodon oleh trna yang kemudian dibawa ke kompleks ribosom dan digabungkan dengan asam amino yang telah ada sebelumnya. Proses ini dinamakan elongasi, dimana akan berlangsung sampai munculnya kodon stop. Proses elongasi akan berakhir setelah mencapai stop kodon yaitu UAA, UAG dan UGA dimana stop kodon berfungsi sebagai kode untuk proses penghentian perangkaian asam amino. Faktor pelepas akan menempel pada ribosom dan menyebabkan terlepasnya mrna dari ribosom yang selanjutnya diikuti pemisahan subunit besar dan kecil dari ribosom. Dihasilakan suatu rantai polipeptida yang belum fungsional dimana untuk mengaktifkannya harus dimodifikasi terlebih dahulu di badan golgi. Pada praktikum, sekuen DNA yang didapatkan memiliki ekspresi gen salah satunya sebagai myoglobin pada manusia. Sturktur dari mioglobin ialah: Mioglobin terdiri dari 8 α-helikal (biru) yang membungkus bagian tengah yang mengandung heme (merah) yang mampu mengikat berbagai ligan termasuk oksigen, karbon monoksida dan oksida nitrat (Ordway, 2004).
Pada praktikum didapatkan gen Homo Sapiens myoglobin dari hasil input data sekuen dan perbandingannya dengan database dimana nilai query nya sebesar 50%. Nilai query coverage menunjukkan presentasi dari panjang nukleotida yang selaras dengan database yang terdapat pada BLAST. Data yang didapatkan dari hasil terdiri dari Locus yang menunjukkan informasi mengenai nama sekuen pada genbank yang terdiri dari nama sekuen, panjang sekuen molekul dan bentuk molekulnya. Didapatkan pula hasil berupa definition yang menunjukkan deskripsi dari sekuen tersebut dimana pada praktikum ini didapat gen Homo Sapiens myoglobin (MB), transcript variant 1, mrna. Selanjutnya terdapat features yang menunjukkan catatan mengenai ciriciri/karakter sekuen. Pada feature terdapat informasi CDS yaitu daerah locus sequence untuk mencari promotor, start kodon dan stop kodon. Promotor pada sekuen ini ialah GACA yang terdapat pada 141. Start kodon ATG berada pada posisi 154 dan stop kodon TAG pada posisi 543. Didapat pula informasi exon yang menunjukkan urutan nukleotida yang diekspresikan yang berada di sisi intron dimana pada gen ini terdapat 3 daerah exon yaitu 1.. 175; 176.. 398; 399.. 1078. Intron sendiri merupakan bagian pada gen yang membedakan gen manusia dan gen bakteri dimana saat ekspresi berlangsung, intron harus dihilangkan terlebih dahulu. Intron adalah urutan nukleotida yang terdapat dalam gen antara ekson dan urutan ini tidak mengkode untuk protein. Pada informasi summary, menjelaskan secara singkat mengenai gen yang didapat dimana gen ini merupakan gen pengkode superfamili globin dan diekspresikan di otot rangka dan jantung. Merupakan haemoprotein yang berperan dalam penyimpanan oksigen intrasel dan difusi oksigen transeluler terfasilitasi dimana setidaknya terdapat 3 varian transkrip yang mengkodekan protein yang sama.
VI. Kesimpulan Dapat dilakukan penelusuran identitas gen berdasarkan sekuen nukleotida menggunakan gen bank database dimana didapatkan gen Homo Sapiens myoglobin dengan nilai query cover sebesar 50%. Pada daerah CDS, didapatkan promoter GACA pada urutan basa nitrogen 141, start kodon ATG pada daerah 154 dan stop kodon TAG pada urutan basa nitrogen 543. Exon merupakan urutan nukleotida yang diekspresikan yang berada di sisi intron sedangkan intron merupakan nukleotida yang tidak dapat diekspresikan sehingga harus di hilangkan selama proses ekspresi gen manusia. Pada proses ekspresi gen terjadi proses transkripsi yaitu perubahan gen menjadi mrna dengn bantuan enzim DNA polimerase dan dilanjutkan dengan perubahan mrna menjadi protein yang disebut dengan proses translasi dimana masing-masing proses terdiri dari tahap inisiasi dari promoter, elongasi yang dimulai setelah menemukan start kodon dan terminasi bila telah mencapai stop kodon.
VII. Daftar Pustaka Artanti, Anif. 2016. Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler. Surakarta: Universitas Sebelas Maret Chen, T., Hongyu, George M. 1999. Modeling Gene Expression With Differential Equations. Pacific Symposium of Biocomputing. Goodenough, Ursula. 1988. Genetics. Jakarta : Erlangga Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. New York: Oxford University Press. Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. Ordway, G., Daniel J. 2004. Myoglobin: an Essential Hemoprotein in Straited Muscle. The Journal of Experimental Biology. No. 207: 3441-3446 Orphanides, G., Danny R. 2002. A Unified Theory of Gene Expression. Cell Press. Vol. 108 : 439-451 Wirahadikusumah, M. 1985. Biokimia, Protein, Enzim dan Asam Nukleat. Mengetahui, Asisten Praktikum Bandung: Penerbit ITB. Surakarta, 5 April 2016 Praktikan ( ) (Nabila Fatin A)