3 Percobaan Garis Besar Pengerjaan Rangkaian proses isolasi pertama-tama dimulai dengan proses pengumpulan sampel. Karena area sampling adalah area yang hanya ditemukan pada musim hujan, sampel alga baru dapat diperoleh sekitar akhir bulan November 2007 (akhir semester ganjil 2007/2008). Oleh karenanya, awalnya diputuskan untuk mengujicobakan metode yang diperoleh dari jurnal utama (Schertz F.M., 1938) pada tumbuhan lain yang tersedia (bayam). Hal ini sekaligus dilakukan untuk melatih diri agar terbiasa dengan metode tersebut, melakukan berbagai penyesuaian, dan efisiensi tahapan pengerjaan. Salah satu penyesuaian yang dilakukan dipicu oleh mahalnya pelarut utama dalam jurnal, yakni petroleum eter. Dari serangkaian studi literatur yang dilakukan, ditemukan bahwa tidak hanya mahal, pelarut ini cenderung agak berbahaya (dengan titik didih yang tidak jelas antara 35-60 C) (MSDS petroleum eter terlampir). Oleh karena itu, diputuskan untuk mengganti petroleum eter dengan n-heksan yang diketahui merupakan komponen utama dalam pelarut petroleum eter. Keputusan ini juga didukung oleh sebuah literatur yang menyatakan bahwa senyawa karoten terdegradasi dengan lebih lambat dalam n-heksan daripada dalam diklorometan, etil eter, atau aseton (Rodroguez-Amaya, 2001). Uji coba ini, tidak dilakukan dengan sampel skala besar, sehingga tidak keseluruhan tahapan pengerjaan dalam jurnal dapat dilakukan dan monitoring hasil ekstraksi hanya dilakukan dengan menggunakan KLT. Setelah sampel tersedia, dilakukan variasi perlakuan awal terhadap sampel dalam jumlah kecil guna mencari langkah optimum yang dapat dilakukan agar ekstraksi berlangsung secara optimal, dalam artian bahwa pigmen-pigmen terekstrak secara maksimum ke dalam berbagai pelarut yang digunakan. Selanjutnya, sesuai dengan hasil percobaan variasi perlakuan awal sampel, sejumlah besar sampel diberi perlakuan awal dan serangkaian tahap isolasi ketiga jenis pigmen dilakukan. Kristal-kristal pigmen yang diperoleh disimpan dan diuji kemurnian serta keabsahan identifikasinya dengan beberapa metode pengujian sederhana. Keseluruhan rangkaian percobaan ini dilakukan tiga kali (triplo), dengan menitikberatkan pada siklus percobaan, pengkajian ulang, perbaikan, dan percobaan kembali agar dihasilkan suatu metode sederhana (tidak memerlukan aparatus yang mahal atau rumit, hemat bahan kimia, hemat energi, dan lain-lain) namun tetap dengan hasil yang optimum. Semua reagen kimia yang digunakan adalah reagen teknis, kecuali reagen-reagen untuk keperluan 13
karakterisasi. Reagen untuk KLT dan pengukuran UV-vis adalah reagen hasil destilasi atau reagen p.a. Diagram alir keseluruhan rangkaian tahapan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 3.1. Gambar 3.1 Diagram alir penelitian 14
3.1 Uji Coba dengan Bayam Untuk uji coba metode dengan sampel bayam, pertama-tama ± 10 g sampel bayam (yang telah disimpan selama sekitar satu minggu dalam lemari es) dikeringkan dengan oven hingga kering, lalu digunting kecil-kecil dan digerus dengan mortar. Bubuk daun yang diperoleh ditempatkan dalam gelas kimia 50 ml, dan direndam dengan n-heksan 17 ml selama 40 menit. Campuran ini lalu disaring, dan residunya disimpan untuk proses ekstraksi dengan aseton:air 8:2. Filtrat n-heksan dipindahkan ke dalam botol fial 50 ml dan di-klt sebagai KLT-bayam I sebelum kemudian diekstrak dengan sekitar 7 tetes metanol jenuh KOH dan dikocok dengan kuat. Setelah didiamkan, campuran ini disaring dan filtrat hasil penyaringan di-klt sebagai KLT-bayam II. Sementara itu, residu bubuk daun diekstrak lagi dengan aseton:air 8:2 hingga filtrat berwarna hijau dan kemudian disaring. Filtrat ini di-klt sebagai KLT-bayam III. Filtrat lalu dipindahkan ke corong pisah, ditambahkan dengan 8,5 ml n-heksan, akuades, lalu dikocok dan dipisahkan. Lapisan n-heksan ini diekstrak kembali dengan akuades, dikocok dan dipisahkan kembali. Lapisan n-heksan selanjutnya ditempatkan dalam corong pisah dan diekstrak dengan metanol 85%. Hasil ekstraksi ini, lapisan n-heksannya diuji dengan kromatografi lapis tipis sebagai KLT-bayam IV. 3.2 Variasi Perlakuan Awal Variasi perlakuan awal sampel dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh cara pemanasan/pengeringan sampel yang paling sederhana dan hemat energi, tetapi juga efektif dan efisien dalam mendukung proses ekstraksi berikutnya. Variasi utama yang dilakukan adalah variasi lamanya proses pengeringan dengan oven bersuhu 45-50 C. Metode pengerjaan yang dilakukan adalah pertama-tama, pada kaca arloji atau cawan petri kering yang kosong dan telah ditempel dengan penanda ditempatkan sejumlah ±10 gram sampel bersih basah, dicatat massanya, lalu dikeringkan dalam oven bersuhu 45-50 C dengan berbagai variasi lama pemanasan (15 menit; 1,5 jam; 2,5 jam; 4 jam; dan 5 jam). Selanjutnya wadah beserta isinya ditimbang kembali dan % berat-hilang dihitung. Masingmasing sampel hasil pengeringan ini lalu dipindahkan ke gelas kimia, dan direndam dalam 17 ml n-heksan selama 40 menit. Sampel lalu dipisahkan dari larutan n-heksan melalui penyaringan dengan kertas saring dan warna filtrat dibandingkan terhadap berbagai lama pemanasan. Selanjutnya residu sampel hasil penyaringan direndam kembali dengan pelarut 15
aseton:air 8:2 sebanyak 30 ml selama 15 menit. Campuran kembali disaring dan warna filtrat kembali dibandingkan terhadap lama waktu pemanasan. Tiap filtrat yang dihasilkan dicampur dengan sesamanya, dipekatkan dalam rotary evaporator, dan di-klt untuk memonitor keberadaan berbagai pigmen yang ingin diisolasi. 3.3 Isolasi Karoten Untuk ekstraksi dan isolasi karoten, pertama-tama sekitar 100 gram bubuk sampel alga kering dalam gelas kimia 250 ml direndam dalam n-heksan hingga terendam semua selama ±40 menit. Hasil perendaman kemudian disaring dengan penyaring vakum, dan selama penyaringan, residu kembali dicuci dengan n-heksan hingga warna filtrat yang mengalir keluar tepat kuning pucat. Selanjutnya 200 gram bubuk sampel kedua menjalani proses yang sama, hanya saja, saat penyaringan dengan penyaring vakum, filtrat dari penyaringan 100 gram bubuk sampel pertama juga ikut dilewatkan kembali. Proses ini lalu diulang kembali hingga 500 gram sampel bubuk alga terproses. Maksimum n-heksan yang digunakan untuk keseluruhan proses ini adalah sekitar 1,3 L. Residu selanjutnya disimpan untuk proses isolasi klorofil dan xantofil (dijelaskan pada Subbab 3.4), sementara filtrat mengalami berbagai langkah lanjutan untuk memurnikan karoten terekstrak. Pertama-tama seluruh filtrat gabungan disaring dengan penyaring vakum untuk menghilangkan berbagai padatan yang tidak larut. Selanjutnya, filtrat ini dipindahkan ke corong pisah 1L, ditambahkan sekitar 15 ml metanol jenuh KOH, dikocok kuat beberapa menit, didiamkan, dan kemudian dipisahkan. Di fasa bawah, diperoleh endapan klorofil tersaponifikasi, sementara filtrat n-heksan di fasa atas terlihat menjadi lebih jernih. Proses ekstraksi dengan metanol jenuh KOH ini dilakukan beberapa kali hingga larutan n-heksan menjadi berwarna jingga jernih. Sementara itu, gabungan fasa bawah dipindahkan ke corong pisah kecil, diekstrak dengan 150 ml n-heksan baru, didiamkan, dan lapisan n-heksan yang diperoleh digabungkan dengan lapisan n-heksan di corong pisah 1L. Larutan jingga jernih yang masih tetap tinggal di corong pisah 1L ini lalu dicuci dengan air hingga air hasil mencucinya ber-ph netral. ph dicek dengan menggunakan indikator universal terhadap lapisan air yang cenderung berwarna kuning. Pencucian dilakukan dengan 150 ml air sekali cuci, dan saat ph telah netral, fasa air yang terbentuk akan kembali putih bening. Ekstrak n-heksan yang telah jernih dan netral selanjutnya ditambahkan dengan sedikit Nasulfat anhidrat untuk menarik air yang tertinggal (kira-kira hingga tampak Na-sulfat anhidrat yang mengendap ke bawah corong), dikocok, dibiarkan 1-2 jam, dan selanjutnya Na-sulfat terhidrat dipisahkan dari larutan n-heksan yang kini telah bebas air. Larutan n-heksan ini 16
dipekatkan dalam rotary evaporator dengan water bath bersuhu 35-40 C hingga tersisa 8-16 ml, dipindahkan ke erlenmeyer 100 ml, ditambahkan metanol absolut hingga volume dua kalinya, ditutup dengan aluminium foil yang dilubangi kecil-kecil dan dibiarkan pada suhu ruang hingga terbentuk kristal. Kristal ini disaring dengan penyaring vakum, dan dicuci dengan n-heksan:metanol 50:50. Kristal yang tersisa direkristalisasi dalam n-heksan, disaring dari pengotor yang tidak larut dengan penyaring vakum, dipekatkan kembali, ditambahkan dengan metanol absolut kembali dan dibiarkan dalam erlenmeyer 100 ml pada suhu ruang hingga terbentuk kristal karoten. Endapan kristal ini disaring dan dicuci dengan n-heksan:metanol 50:50, dan direkristalisasi kembali dengan n-heksan. Langkah ini dapat diulang berkali-kali untuk memastikan kemurnian karoten. Pada langkah terakhir, kristal karoten yang telah dilarutkan kembali dalam n-heksan didiamkan saja pada temperatur ruang hingga seluruh pelarut menguap. Kristal selanjutnya ditimbang, dan disimpan dalam botol gelap bertutup. Diagram alir tahapan ekstraksi dan isolasi karoten dapat dilihat pada Gambar 3.2. 17
Filtrat gabungan Tempatkan dalam corong pisah 1 L Tabahkan 15 ml metanol jenuh KOH Kocok kuat beberapa menit Diamkan Saring Endapan tersaponifikasi Lapisan n- heksan Ulangi ekstraksi dengan metanol jenuh KOH hingga larutan n-heksan oranye jernih Endapan tersaponifikasi Larutan oranye jernih Campuran endapan tersaponifikasi Ekstrak dengan 150 ml n-heksan Saring Endapan Larutan oranye jernih Buang Campuran larutan oranye jernih Cuci dengan air hingga netral Pisahkan Air Larutan oranye jernih Buang Tambahkan Na-sulfat anhidrat kocok Biarkan 1-2 jam Saring 18
Gambar 3.2 Diagram alir proses isolasi karoten 19
3.4 Isolasi Klorofil dan Xantofil 3.4.1 Ekstraksi klorofil dan xantofil Pertama-tama, residu bubuk sampel yang telah diekstrak dengan n-heksan direndam kembali, kali ini dalam pelarut aseton:air 8:2 dengan cara yang sama dengan perendaman oleh n-heksan (waktu perendaman 15 menit untuk tiap 100 gram sampel, dan pencucian residu dilakukan hingga warna filtrat yang keluar hijau muda). Selanjutnya volume filtrat total diukur, dan dibagi dalam lima bagian sama besar. Bagian pertama lalu dimasukkan ke corong pisah 1L yang telah mengandung 400 ml n-heksan, dan ke dalam campuran ini ditambahkan air sebanyak 1/3 volume filtrat aseton:air yang dimasukkan. Corong lalu dikocok, dan dua fasa yang terbentuk dipisahkan. Kedua fasa ini hanya dapat dipisahkan berdasarkan warna larutan yang mengalir dari keran corong pisah. Aliran larutan dari lapisan bawah (lapisan air, aseton, dan emulsi) berwarna hijau muda bening, sementara aliran larutan dari fasa atas (n-heksan) berwarna hijau pekat. Fasa bawah dibiarkan memisah dalam corong pisah kecil, dan lapisan atasnya kembali disatukan dengan lapisan n-heksan di corong pisah 1L. Ke dalam lapisan n-heksan ini, ditambahkan kembali bagian kedua filtrat aseton:air, sejumlah air yang sama, dikocok, dipisahkan, dan seterusnya hingga semua filtrat aseton:air terproses. Selanjutnya, lapisan n-heksan yang dibiarkan tetap berada dalam corong pisah ditambahkan dengan 100 ml metanol 85%, dikocok, didiamkan, dipisahkan kembali berdasarkan warna aliran yang keluar (lapisan metanol 85% di bawah cenderung kuning) dan kembali ditambahkan metanol 85% hingga warna aliran fasa metanol cenderung kuning pucat (maksimal 830 ml). Warna aliran fasa n-heksan (atas) adalah hijau, dan larutan ini disimpan untuk tahap pemekatan ekstrak klorofil (dijelaskan pada Subbab 3.4.2). Gabungan lapisan metanol 85% lalu dipindahkan ke corong pisah satu Liter, ditambahkan air hingga volume dua kali lipatnya, ditambahkan sedikit NaCl, dikocok, dan dibiarkan semalam. Setelah dibiarkan semalam, lapisan atas (endapan klorofil tersaponifikasi dan xantofil yang berwarna hitam) dipisahkan dari larutan metanol 85%, ditambahkan dengan 80 ml aseton, 28 ml metanol jenuh KOH, dikocok beberapa kali selama satu jam, ditambahkan dengan 800 ml air dan garam NaCl, dan dibiarkan kembali beberapa hari hingga terbentuk kristal xantofil. Kristal xantofil disaring dengan penyaring vakum, residunya dicuci dengan aquades, kemudian direkristalisasi dengan metanol absolut, disaring, dan pelarutnya diuapkan dalam rotary evaporator. Kristal yang tertinggal dalam botol fial lalu ditimbang beratnya, dan ditempatkan dalam botol gelap bertutup. 20
Diagram alir tahapan ekstraksi klorofil dan xantofil dapat dilihat pada Gambar 3.3. 21
Lapisan metanol 85% Lapisan n- heksan Pindahkan ke corong pisah 1 L Tambahkan air hingga volumenya 2 kali lipat Tambahkan NaCl Lanjutkan ke tahap Pemekatan Ekstrak Klorofil Kocok Diamkan semalam Lapisan bawah (metanol) Lapisan atas (endapan klorofil dan xantofil) Tempatkan dalam corong pisah 1 L Tambahkan 80 ml aseton Tambahkan 28 ml metanol jenuh KOH Selama satu jam, kocok beberapa kali Tambahkan 800 ml air Tambahkan garam Biarkan semalam Saring dengan Buchner Endapan xantofil Klorofil tersaponifikasi (larut) Cuci dengan air Rekristalisasi dengan metanol absolut Saring Uapkan pelarut dengan rotary evaporator Kristal xantofil Gambar 3.3 Diagram alir proses ekstraksi klorofil dan xantofil 3.4.2 Pemekatan ekstrak klorofil Lapisan n-heksan yang telah dipisahkan dari xantofil pada prosedur sebelumnya ditempatkan pada corong pisah 1 L kemudian dicuci dengan mengalirkan aquades perlahan-lahan melalui dinding corong pisah. Air pencuci dibuang, dan selanjutnya proses pencucian dengan 22
aquades kembali diulangi hingga 3 4 jam. Sistem dua fasa ini lalu diuapkan n-heksannya dengan menggunakan rotary evaporator hingga terbentuk padatan klorofil yang tidak larut dlm air. Padatan ini disuspensikan dalam n-heksan, dan fasa air dan n-heksan yang terbentuk dipisahkan dengan menggunakan corong pisah. Fasa n-heksan lalu dihilangkan pelarutnya dengan rotary evaporator dan padatan klorofil yang tertinggal dalam botol fial ditimbang massanya, dan disimpan dalam botol gelap bertutup. Diagram alir tahapan pemekatan klorofil dapat dilihat pada Gambar 3.4. Klorofil dalam n-heksan Tambah air perlahan-lahan melalui dinding corong Pisahkan dua fasa Fasa air Fasa n- heksan Buang Cuci lagi dengan air Uapkan campuran air n-heksan dengan rotary evaporator Padatan klorofil dalam air Tambah n-heksan secukupnya Pisahkan dua fasa Fasa Air Fasa n- heksan Buang Pindahkan ke botol fial Uapkan dalam rotary evaporator Padatan klorofil Gambar 3.4 Diagram alir proses pemekatan ekstrak klorofil 23
3.5 Uji Kemurnian & Karakterisasi 3.5.1 Uji kemurnian KLT tiga eluen Uji kemurnian ketiga pigmen hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) di mana setiap pigmen dilarutkan sedikit dalam aseton, lalu ditotolkan pada plat silika dengan bantuan pipa kapiler. Plat yang telah ditotolkan dengan sampel lalu dimasukkan dalam chamber yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan sistem eluen tertentu. Untuk menjamin kemurnian pigmen yang berhasil diisolasi, tiap pigmen harus dielusi dengan menggunakan tiga eluen di mana masing-masing eluen ini membawa spot pigmen yang diharapkan pada nilai Rf yang rendah, tinggi, dan sedang. Melalui uji ini, kemurnian pigmen dinilai melalui ada tidaknya spot pengotor pada ketiga proses elusi yang dilakukan. Elusi dilakukan tiga kali dengan rentang Rf yang berbeda agar tiap pengotor dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda dapat terpisah dari pigmen yang menjadi target isolasi dan dideteksi keberadaannya. Semua reagen kimia yang digunakan untuk uji ini adalah reagen p.a atau hasil destilasi. 3.5.2 Spektroskopi UV-vis Spektroskopi UV-vis dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-vis Shimadzu 210λ. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan kuvet kuarsa yang tidak menyerap pada panjang gelombang daerah UV (di bawah 350 nm). Pelarut yang digunakan untuk tiap pigmen hasil isolasi adalah pelarut metanol p.a, demikian pula untuk pengambilan data blanko. 3.5.3 Spektroskopi FTIR Spektroskopi FTIR dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer FTIR-8501 Shimadzu. Untuk sampel hasil isolasi dalam bentuk kristal (karoten & xantofil), penyiapan sampel dilakukan dalam bentuk padatan dengan menggunakan plat KBr yang sebelum digunakan selalu disimpan dalam oven sebagai usaha untuk menghilangkan gangguan dari air. Sementara itu, untuk klorofil yang wujudnya mirip minyak, pengambilan spektrum dilakukan dengan menggunakan jendela NaCl, di mana sampel langsung dioleskan pada salah satu permukaan jendela NaCl sebelum diambil spektrumnya. Untuk meyakinkan hasil, sebelum pengukuran dilakukan, diambil pula data blanko untuk KBr kosong dan NaCl tanpa klorofil. Selama uji, tidak dilakukan eliminasi gas CO 2 dengan gas innert sehingga puncak CO 2 dapat dipastikan ada. 24
3.6 Daftar Alat & Bahan Alat-alat gelas dan instrumen serta daftar bahan kimia yang dipergunakan selama penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.1 dan Tabel 3.2. Tabel 3.1 Daftar peralatan dan instrumen yang digunakan Alat Ukuran/keterangan Jumlah Oven 45-50 C 1 Mortar opsional 1 Kaleng timah bertutup utk 1,5 kg tanaman sampel 1 Corong Buchner 1 Erlenmeyer Buchner 1 L 1 Kertas saring - 18 Corong pisah 1 L, 250 ml 2, 1 Rotary evaporator 1 Erlenmeyer 250 ml 1 Water pump 1 Aluminium foil 1 gulung Gelas Kimia 250 ml, 2 L 6, 2 Desikator vakum 1 Botol kaca gelap 3 Timbangan analitis 1 Spatula 1 Pipet tetes 2 Plat KLT silika 1 Spektrofotometer UV-vis Shimadzu 210λ 1 Spektrofotometer FTIR 8501 Shimadzu 1 Tabel 3.2 Daftar bahan kimia yang digunakan Bahan Tanaman sampel n-heksan Metanol absolut KOH Aquades Na-sulfat anhidrat Aseton NaCl Metanol p.a Kloroform Etil asetat Jumlah 1,5 kg (kering) 7,5 L 4,5 L 200 g 20 L 20 g 4,5 L 100 g 100 ml 50 ml 50 ml 25