TESIS UPAYA PENGENDALIAN PENYEBAB PENYAKIT BUSUK HITAM PADA TANAMAN BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) DENGAN ANTAGONISNYA NADYA TREESNA WULANSARI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
TESIS UPAYA PENGENDALIAN PENYEBAB PENYAKIT BUSUK HITAM PADA TANAMAN BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) DENGAN ANTAGONISNYA NADYA TREESNA WULANSARI NIM 1392261008 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
UPAYA PENGENDALIAN PENYEBAB PENYAKIT BUSUK HITAM PADA TANAMAN BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) DENGAN ANTAGONISNYA Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Biologi, Program Pascasarjana Universitas Udayana NADYA TREESNA WULANSARI NIM 1392261008 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOLOGI PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA TANGGAL 29 MEI 2015
PENETAPAN PANITIA PENGUJI Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 11 Mei 2015 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana No. : 1331/UN14.4/HK/2015, Tanggal 5 Mei 2015 Ketua : Drs. Yan Ramona, M. App.Sc., Ph.D. Anggota : 1. Dr. Dra. Meitini Wahyuni Proborini, M.Sc.St. 2. Dr. Dra. Ni Putu Adriani Astiti, M.Si. 3. Dr. Ir. Made Ria Defiani, M.Sc. (Hons) 4. Drs. Ida Bagus Gede Darmayasa, M.Si.
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena berkat kasih dan karunianya, penulis dapat menyelesaikan Penelitian Tesis yang berjudul Upaya Pengendalian Penyebab Penyakit Busuk Hitam pada Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica) dengan Antagonisnya. Pada kesempatan ini, penulis ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Drs. Yan Ramona, M.App.Sc., Ph.D. selaku pembimbing I dan Pembimbing Akademik yang dengan sabar dan teliti memberikan bimbingan, semangat, serta dukungan moral selama penulis melakukan penyusunan penelitian tesis ini. Terima kasih sebesar-besarnya pula penulis sampaikan kepada Dr. Dra. Meitini Wahyuni Proborini, M.Sc.St selaku pembimbing II yang dengan sabar dan teliti memberikan bimbingan, semangat, serta dukungan moral kepada penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. Dr. I Ketut Suastika, Sp. PD-KEMD, Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengemban ilmu di Pascasarjana Universitas Udayana. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Ketua Program Studi Magister Biologi, Program Pascasarjana Universitas Udayana Ir. Ida Ayu Astarini, M.Sc., Ph.D yang telah memberikan bimbingan, dukungan, dan pesanpesan yang menjadikan penulis lebih baik. Ungkapan terima kasih penulis ucapkan juga kepada dosen penguji tesis, yaitu Dr. Dra. Ni Putu Adriani Astiti, M.Si., Dr. Ir. Made Ria Defiani, M.Sc (Hons) dan Drs. Ida Bagus Gede Darmayasa, M.Si selaku penguji yang telah memberikan masukan, saran,
sanggahan, dan dukungan sehingga tesis ini dapat menjadi seperti ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu dan Bapak Dosen beserta staf pegawai di Program Studi Magister Biologi Pascasarjana Udayana yang telah memberikan dukungan, semangat dan fasilitasnya. Pada kesempatan ini pula penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada orang tua dan seluruh keluarga atas doa, semangat, dan dukungannya selama pelaksanaan dan penyusunan penelitian ini. Kepada seluruh staf pegawai di UPT. Balai Benih Induk Tanaman Pangan Provinsi Bali di Kembang Merta, Tabanan penulis ucapkan terima kasih sebesar-besarnya karena telah membantu dalam melaksanakan penelitian ini. Selain itu Bapak Nyoman Dana yang telah mengijinkan mengambil sampel tanaman brokoli yang terserang penyakit busuk hitam dan memberikan bantuan dengan tulus selama pengambilan sampel. Penulis ucapkan terima kasih kepada rekan-rekan Magister Biologi Universitas Udayana angkatan 2013 atas bantuan dan dukungannya selama penyusunan penelitian tesis ini dan semua pihak yang namanya tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-nya kepada penulis sekeluarga dan semua pihak yang telah membantu pelaksanaan serta penyelesaian tesis ini. Denpasar, Mei 2015 Penulis
ABSTRAK UPAYA PENGENDALIAN PENYEBAB PENYAKIT BUSUK HITAM PADA TANAMAN BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) DENGAN ANTAGONISNYA Penelitian untuk mengendalikan agen penyebab penyakit busuk hitam pada tanaman brokoli dengan menggunakan antagonisnya dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Universitas Udayana dan di UPT. Balai Benih Induk Tanaman Pangan Provinsi Bali pada bulan Oktober 2014 hingga Februari 2015. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk meneliti penyebab patogen dan efektivitas dari beberapa mikroba antagonis untuk mengendalikan patogen ini secara in vitro dan penelitian skala rumah kaca. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Xanthomonas campestris merupakan patogen utama penyebab penyakit busuk hitam pada tanaman brokoli di daerah Kembang Merta, Tabanan, Bali. Dua jamur (Trichoderma harzianum dan Trichoderma viride) dan dua bakteri (Bacillus sp. dan Pseudomonas sp.) antagonis berhasil diisolasi dari lahan tersebut. Pada penelitian in vitro, keempat antagonis menghambat pertumbuhan X. campestris dengan persentase 41.11 ± 5.84% (Trichoderma harzianum), 24.07 ± 3.76% (Trichoderma viride), 16.11 ± 5.61% (Bacillus sp.) dan 30.92 ± 3.17% (Pseudomonas sp.) relatif terhadap kontrol. Hasil ini konsisten ketika diterapkan pada penelitian skala rumah kaca, dengan keberhasilan persentase sebesar 80.00 ± 18,26% (Trichoderma harzianum) dan 73,34 ± 14,91% (Pseudomonas sp.). Kata kunci : Xanthomonas campestris, tanaman brokoli, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, Bacillus sp., dan Pseudomonas sp.
ABSTRACT AN EFFORT TO CONTROL THE CAUSATIVE AGENT OF BLACK ROT DISEASE IN Brassica oleracea var. italica BY ITS ANTAGONISTS A research to control the causative agent of black rot disease in broccoli plants using its antagonists was conducted at the Laboratory Microbiology, School of Biology, Udayana University and at The UPT. Balai Benih Induk Tanaman Pangan Provinsi Bali in the period of October 2014 to Februari 2015. The main objectives of this research were to investigate the causative pathogen and to investigate the effectiveness of some antagonists to control this pathogen in vitro and in a glasshouse scale experiment. The results showed that Xanthomonas campestris was the main pathogen causing the black rot disease in broccoli plants cultivated in Tabanan, Bali. Two fungal (Trichoderma harzianum and Trichoderma viride) and two bacterial (Bacillus sp. and Pseudomonas sp.) antagonists were successfully isolated from the site. In the in vitro experiment, these four antagonists inhibited the growth of X. campestris with percentages of 41.11 ± 5.84% (Trichoderma harzianum), 24.07 ± 3.76% (Trichoderma viride), 16.11 ± 5.61% (Bacillus sp.) dan 30.92 ± 3.17% (Pseudomonas sp.) relative to nil control. These results were found to be consistent when applied in the glasshouse scale experiment, with percentage efficacy of 80.00 ± 18,26% (Trichoderma harzianum) and 73,34 ± 14,91% (Pseudomonas sp.) Keywords : Xanthomonas campestris, broccoli, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, Bacillus sp., dan Pseudomonas sp.
RINGKASAN UPAYA PENGENDALIAN PENYEBAB PENYAKIT BUSUK HITAM PADA TANAMAN BROKOLI (Brassica oleracea var. italica) DENGAN ANTAGONISNYA Brokoli merupakan salah satu tanaman hortikultura yang memiliki banyak manfaat bagi kesehatan. Namun menurut Badan Pusat Statistik dan Direktorat Jenderal Hortikultura (2013) produksi brokoli di Bali tercatat mengalami sedikit penurunan dari 33,22 ton pada tahun 2011 menjadi 32,69 ton pada tahun 2012. Salah satu penyebabnya adalah meningkatnya serangan penyakit seperti penyakit busuk hitam yang disebabkan oleh bakteri Xanthomonas campestris. Infeksi tanaman oleh bakteri ini menyebabkan terjadinya bercak cokelat kehitam-hitaman pada daun, batang, tangkai bunga dan kemudian mengering. Batang atau massa bunga yang terserang menjadi busuk berwarna hitam atau coklat sehingga tanaman tidak dapat dipanen. Selama ini, petani setempat hanya menggunakan pestisida kimia dalam memberantas hama dan penyakit pada tanaman brokoli. Penggunaan pestisida kimia yang berlebihan dalam jangka waktu lama akan berdampak buruk bagi kesehatan dan lingkungan. Salah satu metoda alternatif yang dikembangkan adalah pemanfaatan antagonis dari patogen tanaman yang dikenal dengan biokontrol. Penelitian dalam mengendalikan agen penyebab penyakit busuk hitam pada tanaman brokoli dengan menggunakan antagonisnya dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Universitas Udayana dan di UPT. Balai Benih Induk Tanaman Pangan Provinsi Bali pada bulan Oktober 2014 hingga Februari 2015. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk meneliti penyebab patogen dan efektivitas dari beberapa mikroba antagonis untuk mengendalikan patogen ini secara in vitro dan penelitian skala rumah kaca. Penelitian ini diawali dengan mengisolasi patogen dari daun yang terinfeksi bakteri busuk hitam pada tanaman brokoli pada media khusus Glucose Yeast Extract Agar sampai diperoleh koloni tunggal bakteri yang diduga sebagai penyebab penyakit busuk hitam (berdasarkan warna koloni dan pigmentasi). Isolat-isolat yang diduga sebagai penyebab penyakit busuk hitam kemudian dikonfirmasi berdasarkan pada Postulat Koch dan diidentifikasi dengan pengujian mikroskopis (pewarnaan gram dan spora) dan biokimia (katalase, pergerakan di media SIM, indol dan fermentasi gula). Isolasi jamur dan bakteri antagonis diperoleh dari rhizosphere tanaman brokoli. Identifikasi jamur antagonis yang diperoleh dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloni, struktur spora dan hifa. Karakteristik yang diperoleh akan dicocokkan dengan buku Fungi and Food Spoilage. Sedangkan identifikasi bakteri antagonis dilakukan dengan pengujian pengujian mikroskopis (pewarnaan gram dan spora) dan biokimia (katalase, pergerakan di media SIM, indol dan fermentasi gula). Selanjutnya dilakukan dual culture assay dengan rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Jamur dan bakteri yang memiliki daya hambat terbesar digunakan sebagai acuan dalam percobaan skala rumah kaca. Rancangan yang digunakan dalam pengujian secara in vivo adalah rancangan acak
lengkap (RAL). Pada penelitian ini diamati persentase tanaman brokoli yang infeksi selama 8 minggu setelah diberikan perlakuan. Analisis data yang diperoleh dalam penelitian ini akan dianalisis dengan analisis sidik ragam (ANOVA) menggunakan software SPSS versi 20. Apabila terdapat perbedaan pada p < 0,05, maka uji akan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan s Multiple Range Test (DMRT) pada taraf nyata 5%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Xanthomonas campestris merupakan patogen utama penyebab penyakit busuk hitam pada tanaman brokoli di daerah Kembang Merta, Tabanan, Bali. Bakteri X. campestris penyebab penyakit busuk hitam ini tergolong bakteri phytopathogenic yang sulit karena menginfeksi tanaman brokoli pada level biji maka disebut seed borne disease. Penyebaran bakteri X. campestris dapat terjadi melalui percikan hujan, irigasi sprinkler, serangga, atau peralatan tanam. Xanthomonas campestris dapat bertahan hidup di dalam tanah karena bakteri ini mampu menghasilkan senyawa polisakarida ekstra selular yang berperan penting bagi kelangsungan hidupnya di dalam tanah (Lopes et al., 1999). Dua jamur (Trichoderma harzianum dan Trichoderma viride) dan dua bakteri (Bacillus sp. and Pseudomonas sp.) antagonis berhasil diisolasi dari lahan tersebut. Trichoderma spp. merupakan jamur hiperparasit yang sudah banyak dipakai sebagai isolat biokontrol dalam bidang pertanian. Jamur ini mampu menghasilkan enzim hidrolisis yaitu β-glukanase, selulase, kitinase dan proteinase yang berperan sangat aktif dalam memparasitasi inangnya (Steyaert et al., 2003). Kelompok Bacillus dan Pseudomonas merupakan bakteri antagonis yang sangat mudah diisolasi dari filosfer (permukaan daun), rhizoplane (permukaan akar tanaman), rhizosphere (tanah yang dekat perakaran tanaman), karena keduanya cenderung predominan pada daerah-daerah tersebut Bakteri yang hidup pada daerah rhizosphere memiliki kemampuan dalam mengendalikan patogen yang menginfeksi daun tanaman (Addy, 2008). Pada penelitian in vitro, keempat antagonis menghambat pertumbuhan X. campestris dengan persentase 41.11 ± 5.84% (Trichoderma harzianum), 24.07 ± 3.76% (Trichoderma viride), 16.11 ± 5.61% (Bacillus sp.) dan 30.92 ± 3.17% (Pseudomonas sp.) relatif terhadap kontrol. Dalam penelitian ini, tidak dilakukan elusidasi mengenai mekanisme penghambatan antagonis terhadap patogen. Walaupun demikian, zona hambatan yang terbentuk ini kemungkinan disebabkan oleh enzim-enzim hidrolitik, seperti selulase, kitinase, dan proteinase yang dihasilkan oleh isolat Trichoderma spp. Dalam mengontrol patogen bakteri Pseudomonas sp. dapat menggunakan berbagai mekanisme seperti menghasilkan antibiotika, enzim litik (protease, selulose, glukanase) atau siderofor. Hasil ini konsisten ketika diterapkan pada penelitian skala rumah kaca, dengan keberhasilan persentase sebesar 80.00 ± 18,26% (Trichoderma harzianum) dan 73,34 ± 14,91% (Pseudomonas sp.). Efektivitas semua isolat antagonis dalam mengontrol Xanthomonas campestris yang secara statistik kompatibel dengan pestisida berbasis bahan kimia yang umumnya dipakai di areal pertanian Kembang Merta, sehingga memberikan harapan yang besar untuk dikembangkan secara komersial dimasa yang akan datang.
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PRASYARAT GELAR... ii LEMBAR PENGESAHAN... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi ABSTRAK... viii ASBTRACT... ix RINGKASAN... x DAFTAR ISI... xii DAFTAR TABEL... xv DAFTAR GAMBAR... xvi BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Rumusan Masalah... 3 1.3 Tujuan Penelitian... 4 1.4 Manfaat Penelitian... 5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 6 2.1 Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica)... 6 2.2 Penyakit Tanaman Brokoli (Brassica oleracea var. italica)... 9 2.3 Bakteri Xanthomonas sp.... 10 2.4 Rizosfer Perakaran Tanaman... 11 2.5 Mekanisme Biokontrol... 12 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, HIPOTESIS PENELITIAN 15 3.1 Kerangka Berpikir... 15 3.2 Konsep Penelitian... 16
3.3 Hipotesis Penelitian... 17 BAB IV METODE PENELITIAN... 18 4.1 Rancangan Penelitian... 18 4.2 Waktu dan Tempat Penelitian... 18 4.3 Ruang Lingkup Penelitian... 18 4.4 Penentuan Sumber Data... 19 4.5 Variabel Penelitian... 19 4.5.1 Variabel Bebas... 19 4.5.2 Variabel Terikat... 19 4.6 Bahan Penelitian... 20 4.7 Instrumen Penelitian... 20 4.8 Prosedur Penelitian... 21 4.8.1 Isolasi dan Identifikasi Patogen Busuk Hitam... 21 4.8.2 Uji Patogenitas (Postulat Koch)... 22 4.8.3 Isolasi dan Identifikasi Jamur dan Bakteri Antagonis... 23 4.8.4 Uji Antagonis (In Vitro) Jamur dan Bakteri terhadap Penyebab Busuk Hitam... 26 4.8.5 Persiapan Inokulum Jamur dan Bakteri untuk Pengujian Skala Rumah Kaca... 27 4.8.6 Persiapan Media dan Pembibitan untuk Pengujian Skala Rumah kaca... 28 4.8.7 Uji Efikasi Isolat Antagonis terhadap Penyebab Busuk Hitam 28 4.9 Analisis Data... 30 BAB V HASIL PENELITIAN... 31 5.1 Isolasi dan Identifikasi Bakteri Patogen Busuk Hitam pada Tanaman Brokoli... 31 5.2 Isolasi dan Identifikasi Jamur dan Bakteri Antagonis yang diisolasi dari Rhizospere Tanaman Brokoli di Kembang Merta, Tabanan, Bali 33 5.3 Dual Culture Assay Antara Jamur dan Bakteri Antagonis terhadap Bakteri Patogen Xanthomonas campestris... 37
5.4 Uji Efektivitas Jamur dan Bakteri Antagonis dalam Memproteksi Tanaman Brokoli dari Infeksi Xanthomonas campestris pada Skala Rumah Kaca... 39 BAB VI PEMBAHASAN... 43 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN... 51 7.1 Simpulan... 51 7.2 Saran... 52 DAFTAR PUSTAKA... 53 LAMPIRAN... 64
DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Kandungan Gizi dalam 100 g Brokoli Segar... 6 4.1 Skema Lokasi Polybag di Glasshouse... 30 5.1 Karakteristik Isolat Bakteri Busuk Hitam pada Tanaman Brokoli... 32 5.2 Karakteristik Isolat Jamur Antagonis yang Diisolasi dari Rhizosphere Tanaman Brokoli di Kembang Merta, Tabanan, Bali... 34 5.3 Karakteristik Isolat Bakteri Antagonis yang Diisolasi dari Rhizosphere Tanaman Brokoli di Kembang Merta, Tabanan, Bali... 36 5.4 Persentase Hambatan Jamur dan Bakteri Antagonis terhadap Bakteri Xanthomonas campestris... 37 5.5 Rata-rata ph Tanah Campuran Setelah Proses Sterilisasi... 39 5.6 Efektivitas Jamur dan Bakteri Antagonis dalam Memproteksi Tanaman Brokoli dari Infeksi Xanthomonas campestris pada Skala Rumah Kaca... 40
DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Tanaman Brokoli... 8 3.1 Konsep Penelitian... 17 4.1 Prosedur Penelitian... 21 4.2 Skema Uji Antagonisme (Dual Culture Assay)... 27 5.1 Koloni Bakteri Penyebab Busuk Hitam pada Brokoli... 31 5.2 Bentuk Sel Bakteri Penyebab Busuk Hitam pada Tanaman Brokoli yang divisualisasi dengan Perbesaran 1000x... 31 5.3 Hasil Uji Postulat Koch pada Tanaman Brokoli... 32 5.4 Isolat Jamur Antagonis... 33 5.5 Mikroskopis Jamur Antagonis... 35 5.6 Bentuk Mikroskopis Bakteri Antagonis... 37 5.7 Dual Culture Assay antara Jamur dan Bakteri Antagonis dengan Patogen Xanthomonas campestris... 38 5.8 Hasil Percobaan Skala Glass house Tanaman Brokoli yang diberi Perlakuan... 42 6.1 Siklus Penyebaran Penyakit Xanthomonas campestris pada tanaman Brassica... 45