Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001 TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT HISTOPATOLOGI DARI JARINGAN HEWAN DENGAN PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSIN (H&E) MOHAMAD MUNTIHA Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E Martadinata 30, BOGOR RINGKASAN Untuk pembuatan preparat histopatologi dibutuhkan bahan utama berupa jaringan segar, yang difiksasi dalam larutan formalin (BNF) 10%. Jaringan dipotong clan diatur dalam tissue cassetes, didehidrasi secara otomatis dengan mesin dehidrasi, dikeringkan dengan mesin vaccum, clan diblok dengan cairan parafin, selanjutnya blok tersebut dipotong 3-5 ~tm dengan mesin mikrotom clan potongan tersebut dilekatkan pada kaca obyek. Setelah itu kaca obyek diwarnai secara manual dengan hematoksilin clan eosin. Pewarnaan tersebut akan memberikan keseimbangan warna biru clan merah dengan jelas padajaringan, sehingga komponen sel dapat diidentifikasi denganjelas. PENDAHULUAN Dengan beberapa pengecualian, kebanyakan jaringan tak berwarna sehingga sulit untuk memeriksa jaringan yang ticlak diwarnai di bawah mikroskop. Oleh karena itu telah ditemukan metode-metode pewarnaan jaringan yang ticlak hanya membuat berbagai komponen jaringan menjadi menyolok, tetapi memungkinkan pula diidentifikasi komponen-komponennya. Pewamaan Hematoksilin clan Eosin (H&E) adalah jems pewarnaan rutin yang paling umum dipakai. Prosedur ini digunakan dalam proses pembuatan preparat histopatologi dari berbagai spesies hewan sakit atau mati clan memerlukan pemeriksaan histopatologi untuk peneguhan diagnosis hewan yang bersangkutan. Tulisan ini ticlak dimaksudkan untuk menggambarkan perubahan dari kerusakan tiap-tiap jaringan yang diperiksa, tetapi untuk menjelaskan teknik pembuatan preparat histopatologi dengan prosedur pemrosesan jaringan clan teknik pewarnaan yang baku untuk mendapatkan keseimbangan warna antara hematoksilin (biru) clan eosin (merah) pada preparat. Prosedur ini digunakan di laboratorium patologi Balai Penelitian Veteriner Bogor.
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001 BAHAN DAN CARA KERJA Bahan Bahan utama berupa potongan jaringan hewan yang telah difiksasi dengan Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Larutan yang diperlukan adalah, ethanol absolute, xylol, parafin, glyserin 99,5 %, ewit (albumin), larutan hematoksilin, lithium carbonat, larutan eosin, DPX, dan larutan dekalsifikasi (untuk jaringan tulang). Alat Talenan, pisau scalpel, pinset, saringan, tissue casset, mesin processor otomatis, mesin vaccum, mesin bloking, freezer (-20 C), mesin microtome, pisau microtome, water bath 46 C, kaca obyek, kaca penutup, rak khusus untuk pewarnaan, oven 60 C. CARA KERJA Persaratan dalam Melakukan Pengambilan Sampel 1. Sampel untuk pemeriksaan histopatologi harus segar, artinya jaringan diambil secepat mungkin setelah hewan mati. Keterlambatan pengambilan jaringan, terlebih dalam suhu lapangan yang panas, mengakibatkan jaringan cepat menjadi busuk. 2. Apabila di dalam kelompok hewan yang mati masih ada hewan lain yang sedang sakit, maka dianjurkan untuk mengambil sampel dari hewan tersebut. Pada jaringan yang mengalami perubahan maka diambil jaringan pada perbatasan antara jaringan yang sakit (mengalami perubahan) dengan jaringan yang sehat. 3. Ukuran jaringan yang diambil sekitar 1 cm 3. Jaringan tersebut harus segera difiksasi. Potongan jaringan yang terlalu besar mengakibatkan jaringan yang terletak di dalamnya tidak terfiksasi dengan serripurna, sehingga dapat membusuk. 4. Jika jaringan berupa tulang, maka perlu dilunakkan terlebih dahulu dalam larutan dekalsifikasi dengan perbandingan antara jaringan dan larutan 1 20 dengan waktu perendaman selama 24 jam. Meredam Jaringan dengan Larutan Buffered Neutral Formalin (BNF) 10% Biasanya dilakukan dengan cara merendam jaringan di dalam zat-zat kimia yang berfungsi sebagai bahan pengawet agar terhindar dari pencernaan jaringan oleh enzim-enzim (otolisis) atau bakteri dan untuk melindungi struktur 157
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001 fisik sel. Bahan pengawet yang rutin digunakan adalah larutan Buffered Neutral Formalin (BNF) 10% dengan ph berkisar antara 6.5-7.5. ph ideal adalah 7.0. Untuk membuat 1 liter BNF 10% yaitu dengan menimbang garam NaH 2PO4. H 2O sebanyak 4,0 gram, dan Na2HP0 4. 2H20 sebanyak 6,5 gram larutkan dengan akuades 1 liter kemudian tambahkan 100 ml formaldehyde (37%-40%.) Agar fiksasi jaringan dengan larutan tersebut berlangsung sempurna, maka perbandingan antara organ dan larutan yaitu 1 : 10, sedangkan lamanya fiksasi minimal 2 hari. Larutan Dekalsifikasi : Larutan dekalsifikasi yaitu larutan yang berfungsi untuk menghilangkan garam-garam kalsium dari jaringan tulang sebelum pemotongan sehingga tulang menjadi lunak, selain itu juga untuk memudahkan pemotongan. Dekalsifikasi hanya bisa dilakukan apabila jaringan difiksasi dengan sempurna. Larutan dekalsifikasi dapat dibuat dengan cara mencampur asam format sebanyak 160 ml dengan formalin teknis sebanyak 100 ml, kemudian larutan tersebut ditambahkan akuades sebanyak 1.740 ml, larutan tersebut siap untuk digunakan dengan perbandingan antara jaringan dan larutan 1 20 dengan waktu perendaman selama 24 jam. Proses Pembatan Preparat Histopatologi 1. Memotong jaringan organ Setelah jaringan organ yang berada di dalam larutan fiksatif matang, jaringan ditiriskan pada saringan selanjutnya dipotong menggunakan pisau scalpel dengan ketebalan 0,3-0,5 mm dan disusun ke dalam tissue cassette, kemudian sejumlah tissue cassette dimasukkan ke dalam keranjang khusus (basket). 2. Proses dehidrasi Keranjang (basket) yang di dalamnya berisi jaringan organ, dimasukkan ke dalam mesin processor otomatis (Gambar 1). Selanjutnya jaringan mengalami proses dehidrasi bertahap dengan putaran waktu sebagai berikut : ethanol 70% (2 jam) ethanol 80% (2 jam) aethanol 90 % (2 jam) a ethanol absolute (2 jam)a ethanol absolute (2 jam) xylol (2 jam) xylol (2 jam) parafin cair (2 jam) aparafin cair(2jam). Selanjutnya keran-jang yang berisi tissue cassette dikeluarkan untuk dilakukan proses berikutnya. 15 8
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001 3. Vakum Setelah proses dehidrasi dilakukan, kemudian dilanjutkan dengan penghilangan udara dari jaringan dengan menggunakan mesin vakum yang di dalammya terdapat tabung untuk menyimpan keranjang yang diisi parafin cair dengan temperatur (59-60 C) di vakum selama 30 menit. Keranjang diangkat, tissue cassette dikeluarkan dan disimpan pada temperatur 60 C untuk sementara waktu sebelum pencetakan dilakukan dengan parafin cair. Gambar 1. Mesin Processor Otomatis 4. Mencetak blok parafin Cetakan dari bahan stainles steel dihangatkan di atas api Bunsen, lalu ke dalam setiap cetakan dimasukkan jaringan sambil diatur dan sedikit ditekan. Sementara An ditempat lain telah disiapkan parafin cair dalam tempat khusus, sehingga dicapai suhu 60 C. Parafin cair tersebut dituangkan ke dalam jaringan sampai seluruh jaringan terendam parafin. Parafin dibiarkan membeku di atas mesin pendingin (Gambar 2.). Selanjutnya blok parafin dilepas dari cetakan dan disimpan difreezer (-20 C) sebelum dilakukan pemotongan. 5. Memotong blok jaringan Blok parafn yang mengandung jaringan, kemudian dipotong dengan menggunakan mesin mikrotom (Gambar 3) dengan ketebalan berkisar 3-4 pm. Potongan tersebut diletakkan secara hati-hati di atas permukaan air dalam waterbath bersuhu 46 C. Pada kesempatan ini bentuk irisan dirapikan, kemudian diletakkan di atas kaca obyek yang telah diolesi ewith, yang 159
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001 berfungsi sebagai bahan perekat. Kaca obyek dengan jaringan di atasnya disusun di dalam rak khusus dan dimasukkan ke dalam inkubator bersuhu 60 C sampai preparat siap untuk diwamai. D15!'E NSIrJV ' V(-AlAO (,HVO CONSOLE CONSOLE CCwSOIE Gambar 2. Mesin Pencetak Blok PERSIAPAN LARUTAN UNTUK PEWARNAAN Larutan hematoksilin Timbang serbuk hematoksilin I gram, potasium aluminium sulfat sebanyak 50 gram dan sodium iodate ( Na 103 ) sebanyak 0,2 gram dilarutkan dalam 1 liter akuades menggunakan alat pengaduk (stirer) dengan sedikit dipanaskan, kemudian disimpan satu malam dalam temperatur ruangan. Keesokkan harinya larutan tersebut ditambahkan asam sitrat (C 6H807) sebanyak 50 gram dan chloral hydrate (CZH3CL30Z) sebanyak 50 gram. Larutan dipanaskan dan diaduk selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Larutan akan stabil selama 1-2 tahun dalam botol berwama gelap pada temperatur ruangan. Larutan eosin Timbang serbuk eosin Y sebanyak 7,5 gram, erythrosin sebanyak 7,5 gram dan calcium chlorida sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam akuades 1 liter kemudian disaring. Larutan akan stabil selama 6-12 bulan dalam botol gelap pada temperatur ruangan. 160
Temu Teknis Fungsional Non Peneliri 2001 Larutan pembiru Lithium carbonat sebanyak 1,5 gram dilarutkan dengan akuades 1 dan diaduk hingga homogen. liter Gambar 3. Mesin Mikrotom PROSES PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSIN Preparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak khusus clan dicelupkan secara berurutan ke dalam larutan dengan waktu sebagai berikut " Ethanol absolute 3 menit " Ethanol absolute 3 menit " Ethanol 90% 3 menit " Ethanol 80% 3 menit " Bilas dengan air keran 1 menit " Larutan hematoksilin 6-7 menit " Bilas dengan air keran 1 menit " Larutan pembiru 1 menit " Air keran 1 menit " Larutan eosin 1-5 menit " Bilas dengan air keran 1 menit
Temu Teknis Fungsionai Non Penelui 2001 " Ethanol 80 % 10 celupan " Ethanol 90 % 10 celupan " Ethanol absolute 10 celupan " Ethanol absolute 1 menit Preparat diangkat satu persatu dari larutan xylol dalam keadaan basah, diberi satu tetes cairan perekat ( DPX ) dan selanjutnya ditutup dengan kaca penutup. Hasil pewarnaan dapat dilihat di bawah mikroskop. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) dapat dilihat pada (Gambar 4). Dari hasil pewarnaan yang dilakukan pada jaringan otot rangka kerbau terlihat dengan jelas bahwa inti sel berwarna biru sedangkan otot berwarna merah muda sampai merah. Proses pembiruan dalam hematoksilin akan merubah warna merah kecoklatan dari hematoksilin menjadi biru kehitaman, dimana akan terlihat lebih jelas setelah dilakukan counter stain dengan eosin yang berwarna merah menjadi merah muda. Proses ini akan terjadi dalam air keran yang bersifat alkali atau juga dapat dibantu dengan penambahan garam lithium carbonat yang menjadikan air lebih bersifat alkali. Gambar 4. Otot rangka kerbau, inti sel berwarna biru (a), Otot berwarna merah muda sampel merah (b), Pewarnaan H & E 40 x 162
Temu Teknis Fungsional Non Penelfti 2001 Dengan menggunakan prosedur penggunaan waktu yang standar, tidak menjamin akan mendapatkan hasil yang baik. Pengaturan waktu dalam proses pewarnaan ini sangat penting. Karena ketepatan waktu akan dipengaruhi oleh tipe dari tiap jaringan yang diproses, sehingga penggunaan waktu bisa berubah sesuai dengan kebutuhan. KESIMPULAN Pewarnaan hematoksilin dan eosin sangat bermanfaat untuk mengidentifikasi morfologi / komponen-komponen sel suatu jaringan dari organ tubuh hewan, sehingga kelainan histopatologi pada preparat dapat didiagnosis dengan baik. SARAN Bahan pengawet sebaiknya menggunakan buffer neutral formalin (BNF) 10 % dan tidak dianjurkan untuk menggunakan larutan alkohol dan gliserin UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada Ibu Drh. Rini Damayanti atas bimbingan dan bantuan dalam penulisan makalah ini. Juga kepada tim makalah atas komentar dan sarannya untuk perbaikan makalah ini kami ucapkan terima kasih. DAFTAR BACAAN CULLING, C.F.A. 1974. Handbook of Histopatological and Techniques. Third Edition, Butterworths & CO. JUNQUERA. L.C. J. CARNEIRO. 1980. Histolog i Dasar ( Basic Histology ). Ed 3. Lange Med. Publication. Los Altos. California. KEN, A. 1985. Laboratory Manual Histopathology. ATA-219. Balitvet Project.. VACCA, L.L. 1985. Laboratory Manual of Histochemistry. Raven Press. New York