Latar Belakang IV. INDUKSI MUTASI DENGAN SINAR GAMMA MELALUI IRADIASI TUNGGAL PADA STEK PUCUK ANYELIR (Dianthus caryophyllus) DAN UJI STABILITAS MUTANNYA SAMPAI GENERASI MV3 Pendahuluan Perbaikan sifat genetik dan agronomi tanaman dapat dilakukan melalui program pemuliaan tanaman. Secara konvensional, jika tanaman menghasilkan biji maka pemuliaan dapat dilakukan dengan persilangan baik antar spesies, varietas, genera, atau kerabat yang diinginkan (Soerdjono 2003). Namun jika tanaman tidak atau sulit menghasilkan biji, maka program pemuliaan tanaman lainnya dapat diterapkan, seperti misalnya pemuliaan mutasi. Pemuliaan mutasi pada program pemuliaan tanaman merupakan suatu sarana yang dilakukan untuk membentuk suatu varietas tanaman yang mempunyai karakter tertentu. Salah satu sisi yang menguntungkan dari penggunaan metode mutasi dibandingkan dengan metode pemuliaan tanaman konvensional adalah kemampuannya untuk mengubah beberapa karakter saja, tanpa merombak seluruh konstitusi genetik tanaman tersebut (National Nuclear Agency 2002). Selain dapat mengubah satu karakter tanpa mengubah seluruh susunan gen secara signifikan, metode ini juga dipilih karena kombinasinya dengan pembiakan secara vegetatif dapat menurunkan resiko kehilangan karakter mutan akibat segregasi (van Harten 2002). Metode ini juga sangat berguna untuk diterapkan pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif mengingat tanaman yang membiak vegetatif umumnya mempunyai heterozigositas yang tinggi sehingga persilangan akan menyebabkan hilangnya karakter awal yang baik (Micke dan Donini 1993). Melalui pemuliaan mutasi dapat langsung dihasilkan kultivar yang baru, atau dapat pula memperbaiki keragaan tanaman untuk dijadikan sebagai sumber bahan tanaman pada program pemuliaan selanjutnya. Mutasi buatan dapat diinduksi oleh mutagen kimia, seperti EMS (ethyl methane sulphonate) atau mutagen fisik, seperti iradiasi sinar x atau sinar γ. Akan tetapi pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif, induksi mutasi dengan menggunakan mutagen kimia tidak disarankan mengingat banyak hasilnya yang tidak memuaskan. Hal ini diperkirakan akibat
70 rendahnya pengambilan dan daya serap bagian vegetatif tanaman tersebut terhadap bahan kimia (IAEA 1977). Dari banyak penelitian mutasi induksi, telah diketahui bahwa umumnya mutasi yang diinginkan terletak pada kisaran LD 50. Datta (2001) melaporkan bahwa LD 50 sinar gamma pada krisan berada pada kisaran 15-20 Gy. Pada anyelir, Johnson (1980) memperoleh 4 dari 9 kultivar anyelir yang menjadi mutan non-kimera dengan perlakuan dosis 68 Gy sinar gamma, tanpa menyebutkan besarnya LD 50. Broertjes dan van Harten (1988) juga melaporkan bahwa dosis sinar gamma yang pernah dicobakan pada anyelir dan berhasil membentuk mutan masih cukup lebar kisarannya, yaitu terletak antara 25-120 Gy. Walaupun pada dosis 120 Gy masih diperoleh mutan positif, namun mulai dosis 100 Gy sudah menunjukkan tingkat letalitas yang tinggi. Berdasarkan hal tersebut, maka diperlukan penelitian untuk mencari LD 50 yang berlaku pada iradiasi sinar gamma terhadap stek pucuk anyelir. Pada penelitian ini dicobakan kisaran dosis mulai dari 15, 30, 45, 60, 75 sampai 90 Gy, sehingga diharapkan bisa didapatkan nilai LD 50 tanpa terlalu banyak mutan letal yang terjadi. Tujuan Penelitian ini bertujuan : (1) mengamati tingkat radiosensitivitas stek pucuk dari beberapa genotipe anyelir terhadap iradiasi sinar gamma, (2) menentukan LD 50 pada stek pucuk beberapa genotipe anyelir terhadap iradiasi sinar gamma, serta (3) memperoleh mutan positif yang solid dan stabil, yang potensial untuk dikembangkan. Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di dua tempat, yaitu di (1) Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR), Badan Tenaga Nuklir (BATAN) Pasar Minggu, Jakarta, serta di (2) rumah sere Instalasi Penelitian Tanaman Hias (INLITHI) Cipanas, Cianjur. Penelitian dilakukan mulai dari Bulan September 2002 sampai Bulan September 2004.
71 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah stek pucuk anyelir dari lima genotipe, yaitu genotipe 10.8, genotipe 11.10. genotipe 24.1, genotipe 24.14 dan genotipe 24.15 (deskripsi kelima genotipe tertera pada Lampiran 1). Materi tanaman berasal dari sumber plasma nutfah yang tersedia di Instalasi penelitian Tanaman Hias Cipanas, yang diseleksi berdasarkan warna bunga, daya adaptasi di lapangan dan ketahanan terhadap hama dan penyakit utama anyelir. Hama utama yang ditemui di lapangan adalah mites (Pediculopsis graminum), sedangkan penyakit utama yang ditemukan di lapangan adalah busuk fusarium (Fusarium oxysporum pv. dianthi). Sebagai sumber radiasi digunakan sinar gamma dari ionisasi Cobalt 60, yang diberikan melalui irradiator gamma chamber 4000A, type Irpasena, buatan India. Bahan lainnya yang digunakan dalam penelitian sebagai media aklimatisasi antara lain humus bambu steril, media tanam arang sekam, pupuk urea, TSP, KCl, pupuk kandang, pupuk daun, dan pestisida. Metode Percobaan Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama adalah genotipe anyelir, yang terdiri atas lima genotipe, yaitu genotipe 10.8, 11.10, 24.1, 24.14 dan 24.15. Faktor kedua adalah dosis iradiasi, yang terdiri dari tujuh taraf, yaitu 0, 15, 30, 45, 60, 75 dan 90 Gy. Jadi pada percobaan ini terdapat 35 kombinasi perlakuan, dan setiap kombinasi perlakuan diulang tiga kali. Untuk sumber bahan tanaman, digunakan lima stek pucuk untuk setiap satuan percobaan, sehingga secara keseluruhan dibutuhkan 525 stek pucuk. Dimana : Model linier rancangan acak lengkap pola faktorial adalah sebagai berikut : Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk Y ijk = hasil pengamatan dari pengaruh genotipe ke-i, dosis iradiasi ke-j, ulangan ke-k µ = rataan umum α i = pengaruh genotipe ke-i β j = pengaruh iradiasi ke-j (αβ) ij = interaksi antara pengaruh genotipe ke-i dan dosis iradiasi ke-j ε ijk = pengaruh galat percobaan genotipe ke-i, dosis iradiasi ke-j, dan ulangan ke-k
72 Pengujian hipotesis untuk semua tanaman contoh dilakukan dengan uji F pada taraf 5%, Sebagai uji lanjutan, digunakan Uji Jarak Berganda Duncan (UJGD) pada taraf 5%. Untuk mendapatkan nilai Lethal Dosis 50 (LD 50 ), digunakan program curve-fit analysis, yaitu suatu program analisis statistik yang dapat digunakan untuk mencari model persamaan terbaik terhadap presentase kematian dari suatu populasi (Finney, 2005). Data kualitatif pada karakter generatif mutan, yaitu warna dan bentuk tepi petal bunga anyelir, digunakan sebagai indikator MUTAN, sedangkan data kuantitatif pada karakter generatif mutan digunakan untuk pembuatan dendogram, untuk melihat derajat kemiripan mutan dengan tetuanya (dendogram disajikan pada bab VII). Persiapan Stek Pucuk (Pengakaran) Lima belas stek pucuk dari tiap-tiap genotipe anyelir yang diuji, diakarkan dalam media untuk pengakaran, yaitu tanah : pasir steril : kompos = 1:1:1. Pengakaran dilakukan pada bak semai yang disungkup dengan plastik selama 4 hingga 6 minggu. Stek yang telah berakar, tinggi sekitar 15 cm atau telah memiliki 4 daun, dijadikan sebagai bahan tanaman yang diradiasi dengan sinar gamma. Iradiasi Stek Pucuk Anyelir dengan Sinar Gamma Aplikasi iradiasi dilakukan di BATAN dengan menggunakan Gamma Chamber. Aplikasi diberikan satu kali (iradiasi tunggal) pada 7 taraf dosis, yaitu 0, 15, 30, 45, 60, 75 dan 90 Gy. Stek berakar diradiasi tanpa tanah. Stek dicabut dengan hati-hati dari media tanah, dibersihkan, lalu dimasukkan ke dalam kertas pembungkus yang telah disiapkan, sebelum dimasukkan ke dalam gamma chamber. Bahan tanaman untuk perlakuan 0 Gy (kontrol) juga dibawa ke BATAN untuk memastikan bahwa tindakan yang diberikan seragam terhadap semua tanaman, kecuali tindakan perlakuan iradiasi yang berbeda sesuai taraf dosis yang diberikan. Stek pucuk yang telah diradiasi (MV0) langsung ditanam dalam media yang merupakan campuran kompos : tanah : pasir = 1:1:1 di rumah sere INLITHI Cipanas. Pada fase ini dihitung presentase kematian akibat iradiasi sinar gamma. Stek berakar yang bertahan hidup dipindahkan ke lapang untuk dijadikan tanaman induk. Tanaman induk ini dijaga agar tetap dalam keadaan vegetatif dan vigor. Penyemprotan pestisida diberikan untuk menghindari serangan hama atau penyakit.
73 Pembentukan Tanaman MV1-MV3 Untuk pembentukan populasi MV1, stek anyelir diambil dari pucuk batang tanaman MV0 yang vigor, dengan panjang sekitar 10-15 cm, atau telah memiliki empat atau lima pasang daun. Stek langsung diakarkan di media perakaran. Pangkal stek diberi Rooton-F sebelum tanam, dan akar muncul pada sekitar 6 MST. Stek berakar dipindah ke lapang dengan perlakuan yang sama pada MV0. Mulai dari populasi tanaman MV1 ini dilakukan pengamatan dan seleksi untuk mengetahui ada tidaknya mutan yang terbentuk akibat perlakuan iradiasi sinar gamma. Pemeliharaan Lingkungan dalam rumah sere (rumah plastik) dijaga agar berada dalam kisaran suhu 25-30 0 C dan RH sekitar 90%. Pupuk nitrogen diberikan dua kali, yaitu pada saat tanam dan pada umur 6 minggu masing-masing sebanyak 4 gram/ tanaman, sedangkan phosphor dan kalium masing-masing 9 dan 6 gram diberikan pada umur 6 MST. Selain itu juga diberikan pupuk daun cair sebanyak dua kali seminggu dengan dosis sesuai anjuran. Bila diketahui ada serangan hama atau penyakit, dilakukan penyemprotan pestisida, dengan frekuensi dan dosis sesuai anjuran. Pengamatan Pada tanaman induk, pengamatan dilakukan baik secara visual maupun dengan pengukuran parameter pertumbuhan. Pengamatan visual meliputi kondisi tanaman induk secara umum serta keragaman yang timbul pada tanaman induk pasca iradiasi. Pada populasi MV0, untuk mencari nilai LD 50 dilakukan pengamatan terhadap persentase tanaman hidup, yaitu jumlah tanaman yang masih dapat bertahan hidup setelah diradiasi, dibagi jumlah tanaman total yang diradiasi pada setiap genotipe. Pengamatan dilakukan selama empat minggu. Untuk mendapatkan nilai Lethal Dosis 50 (LD 50 ), digunakan program curve-fit analysis, yaitu suatu program analisis statistik yang dapat digunakan untuk mencari model persamaan terbaik terhadap presentase kematian dari suatu populasi (Finney 2005). Analisis statistika pada program ini merupakan penggabunga n antara datadriven analysis dan model-driven analysis sehingga model persamaan matematika yang diperoleh dari pola kematian populasi genotipe-genotipe anyelir tidak harus sama
74 antar genotipe yang satu dengan genotipe lainnya. Hanya model dengan nilai koefisien korelasi (r) tertinggi yang digunakan pada penelitian ini. Model-model yang digunakan tersebut adalah Modified Power, Polynomial Fit dan Linear Fit. Untuk karakter yang diamati melalui metode pengukuran, pengamatan dilakukan dua minggu sekali. Pada populasi MV1 pengamatan dilakukan terhadap : (1) Jumlah tunas, dihitung dua minggu sekali, dari umur satu sampai tiga bulan. (2) Tinggi tanaman (cm), diukur dari pangkal batang sampai pucuk tanaman, dilakukan satu bulan sekali. (3) Jumlah daun, dihitung dari jumlah daun per tanaman setiap dua minggu sekali (4) Panjang daun (cm), diukur pada daun terpanjang, satu bulan sekali (5) Lebar daun (cm), diukur pada daun terlebar, satu bulan sekali selama tiga bulan (6) Persentase bunga mutan, yaitu jumlah bunga mutan yang terbentuk per unit percobaan, dibagi dengan jumlah bunga total yang dihasilkan tanaman per unit percobaan. Adapun keragaan bunga mutan yang diamati meliputi perubahan pada morfologi bunga dan jumlahnya : a. Warna petal, digunakan Royal Horticulture Colour Chart (RHCC) b. Diameter bunga (cm), diukur dari diameter terlebar pada bunga yang telah mekar penuh c. Jumlah Benang Sari d. Jumlah Putik e. Jumlah petal dan f. Bentuk tepi petal, mengikuti standar UPOV (1990) seperti telah dijelaskan pada Gambar 3, bab III. Indikator Mutan Indikator mutan positif pada penelitian ini adalah perubahan pada warna petal dan bentuk tepi petal bunga anyelir yang berbeda dari tanaman normalnya. Perubahan pada karakter generatif lainnya (jumlah putik, tangkai sari dan sebagainya) atau pada karakter vegetatif seperti daun albino, tanaman kerdil, pertumbuhan roset dan sebagainya, tidak dimasukkan dalam kategori mutan positif dan tidak dihitung sebagai mutan.