PROTEKSI VAKSIN MUTAN BRUCELLA ABORTUS RB27 DERIVASI ISOLAT LAPANG S67 PADA MENCIT (The Efficacy of RB27 Mutant Vaccine Derived from Brucella abortus S67 against Challenge with Field Isolate of B. Abortus in BALB/C Mice) SUSAN M. NOOR dan M. POELOENGAN Balai Penelitian Veteriner, PO Box 151, Bogor 16114 ABSTRACT A recent study showed that unlike the S19 vaccine, the mutant vaccine of Brucella abortus when given to pregnant cattle does not induce abortion. The objective of this study is to evaluate the efficacy of RB27 mutant vaccine that was derived from Brucella abortus S67 against challenge with field isolate of B. abortus in BALB/c mice. Four groups of 6 BALB/c mice were used in this study. Group I was inoculated intraperitoneally with RB27 that is derivation of S67; Group II was inoculated with RB27 organisms that is derivation of S158; Group III was inoculated with S19 vaccine; and Group III was used as a control. A month after booster, all groups were challenged against field isolate of B. abortus. All mice were killed by ether at 4 weeks post-challenge and spleens were cultured for the presence of Brucella abortus organisms. The results showed that Group I had protection of 83%, Group II and Group III had 50% protection, group IV (control) had no protection. Keywords: Brucellosis, RB27, efficacy, S67, S158, S19, mice ABSTRAK Vaksin Brucella abortus galur mutan diketahui tidak menginduksi terjadinya abortus pada sapi bunting yang divaksinasi dibandingkan dengan vaksin B. abortus S19. Pada penelitian ini dianalisis tingkat proteksi vaksin mutan B. abortus RB27 yang diderivasi dari isolat lapang S67. Sebanyak 24 ekor mencit dibagi menjadi 4 Kelompok. Kelompok 1, mencit divaksinasi dengan vaksin mutan B. abortus RB27 derivasi S67. Kelompok 2 divaksinasi dengan vaksin RB27 derivasi S158. Kelompok 3 divaksinasi dengan vaksin S19 dan Kelompok 4 tidak divaksinasi (kontrol). Vaksinasi dilakukan sebanyak 2 kali secara intraperitoneal dengan interval waktu satu bulan. Satu bulan setelah booster, semua kelompok mencit ditantang dengan B. abortus isolat lapang. Satu bulan setelah ditantang mencit dibunuh dan dilakukan pemeriksaan bakteriologis pada organ limpa. Proteksi vaksin dianalisis berdasarkan jumlah mencit yang tidak terinfeksi oleh B. abortus pada limpanya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa proteksi vaksin kelompok 1 adalah 83%, kelompok 2 adalah 50%, kelompok 3 adalah 50 % dan kelompok 4 adalah 0% (tidak ada proteksi). Kata kunci: Brucellosis, RB27, efikasi, S67, S158, S19, mencit PENDAHULUAN Brucellosis pada sapi mengakibatkan gangguan reproduksi yang ditandai dengan abortus dan infertilitas (ENRIGHT, 1990). Brucella abortus dapat pula mengakibatkan demam undulan pada manusia (ACHA dan SZYFRES, 1980). Menurut DITJENNAK (1981), kerugian ekonomi yang ditimbulkan oleh penyakit brucellosis di Indonesia mencapai 10 milyard rupiah setiap tahunnya. Brucellosis telah menyebar ke seluruh propinsi kecuali Pulau Bali dengan angka prevalensi bervariasi dari 1% sampai 40% (SUDIBYO dan RONOHARDJO, 1989; SUDIBYO et al., 1991; SUDIBYO et al., 1997). Pengendalian brucellosis melalui program vaksinasi dengan vaksin B. abortus S19 mengakibatkan keguguran pada sapi bunting (CORNER dan ALTON, 1981; BECKETT dan MACDIARMID, 1987) dan hanya menimbulkan proteksi 65 75% pada sapi yang divaksinasi (MANTHEI, 1959 dan CORNER et al., 1985). Penggunaan B. abortus strain RB51 yang 741
merupakan strain mutan pada hewan model dapat memberikan proteksi pada mencit bunting yang ditantang dengan strain 2308 (SCHURIG et al., 1991) karena diketahui tingkat virulensi strain RB51 lebih rendah dari S19 pada uji in vitro (ENRIGHT, 1990). Efikasi vaksin B. abortus mutan RB27 yang diderivasi dari isolat lokal S158 pada marmut kurang memberikan proteksi setelah ditantang dengan B. abortus isolat lokal. Hal ini dapat terjadi kemungkinan karena kandidat vaksin tersebut kurang imunogenik dan kemungkinan lainnya adalah aplikasi pemberian vaksin dan waktu vaksinasi yang kurang tepat sehingga mengakibatkan rendahnya titer antibodi dalam tubuh hewan uji. Berdasarkan alasan tersebut pada penelitian ini akan melakukan uji efikasi strain B. abortus RB27 yang diderivasi dari isolat lokal S67 pada mencit serta evaluasi terhadap tingkat keamanannya. MATERI DAN METODE Rekoveri strain B. abortus RB27 derivasi isolat lokal S67 pada mencit Untuk mengetahui rekoveri strain B. abortus RB27 derivasi isolat lokal S67 pada mencit pascavaksinasi digunakan 40 ekor mencit BALB/c yang dibagi menjadi 8 kelompok percobaan (5 ekor/kelompok). Mencit divaksinasi dengan 1x10 8 cfu strain B. abortus RB27 secara intraperitoneal. Rekoveri strain B. abortus pada limpa diamati setiap minggu dengan melakukan isolasi dan identifikasi bakteri B. abortus serta jumlah shedding bakteri. Kultur bakteri dikarakterisasi berdasarkan inspeksi visual, kemampuan autoaglutinasi (BRAUN dan BONESSTALL, 1947), dan absorbsi kristal violet (WHITE dan WILSON, 1951). Monitoring rekoveri bakteri B. abortus dilakukan mulai pada minggu ke-1 sampai minggu ke-8 pascavaksinasi. Minggu ke-1, mencit kelompok 1 dieutanasi dan limpa dikoleksi, kemudian pada minggu ke-2 mencit Kelompok 2, minggu ke-3 mencit. Kelompok 3 begitu seterusnya sampai pada minggu ke-8 post vaksinasi (kelompok 8). Uji Efikasi strain B. abortus RB27 pada mencit Pada uji efikasi ini akan menggunakan 24 ekor mencit (BALB/c) yang dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan seperti tampak pada Tabel 1. Vaksinasi strain B. abortus RB27 dilakukan pada mencit secara intraperitoneal dengan dosis 1x10 8 cfu seperti pada Tabel 1. Mencit pada semua kelompok ditantang dengan strain B. abortus yang virulen secara intraperitoneal pada minggu ke-4 pascavaksinasi dengan dosis 1x10 5 cfu. Pada minggu ke-8 semua kelompok mencit dieutanasi, limpa dikoleksi secara aseptis untuk pemeriksaan bakteriologis. Tingkat proteksi dihitung berdasarkan ada tidaknya strain B. abortus yang terdapat pada limpa. HASIL DAN PEMBAHASAN Kandidat vaksin Brucella abortus mutan RB27 diperoleh dari pasase berulang strain B. abortus isolat lokal S67 dalam rifampisin. Kuman B. abortus S67 tersebut diisolasi dari susu sapi perah penderita Brucellosis di DKI Jakarta. B. abortus S67 mempunyai koloni yang halus (smooth) dan setelah dipasase berulang dalam TSA agar dengan penambahan rifampisin diperoleh B. abortus R27 yang mempunyai koloni kasar (rough). Koloni kasar B. abortus RB27 dapat dideterminasi dengan adanya reaksi aglutinasi dengan penambahan acriflavin (BRAUN dan BONESTELL, 1947) dan absorbsi kristal violet oleh koloni bakteri (WHITE dan WILSON, 1951). Kuman B. abortus RB27 diuji rekoveri sebelum diuji daya proteksinya pada mencit dan dibandingkan dengan daya proteksi strain RB27 yang diderivasi dari S158 dan juga vaksin S19 yang biasa digunakan dalam program vaksinasi Brucellosis. Sebagai hewan coba pada penelitian ini digunakan mencit BALB/c karena mencit banyak digunakan sebagai model untuk mempelajari beberapa aspek pada brucellosis sapi (MONTARAZ dan WINTER, 1986). Uji rekoveri strain RB27 derivasi isolat lokal S67 pada mencit menunjukkan bahwa pada minggu pertama pascainfeksi ditemukan 742
Tabel 1. Rencana uji patogenesitas vaksin B. abortus RB27 pada mencit Kelompok Mencit (ekor) Vaksin I 6 RB27 (derivasi S67) II 6 RB27 (derivasi S158) III 6 S19 IV 6 Kontrol (Saline) Vaksinasi dosis 1x10 8 cfu, ip Tabel 2. Reisolasi B. abortus strain RB27 dari limpa mencit yang diinjeksi dengan 1x10 8 cfu RB27 secara intraperitoneal pada minggu ke-1 sampai ke-8 pascainokulasi Kelompok Minggu ke- Pascainfeksi Rata-rata kuman (cfu) Ratio BL/BB (%) I 1 >300 - II 2 15 x 10 4 4,19 III 3 23 x 10 2 1,03 IV 4 33,7 x 10 2 3,89 V 5 14,2 x 10 2 2,42 VI 6 22,2 x 10 2 1,28 VII VIII 7 8 0 0 1,16 - Jumlah mencit/kelompok 5 ekor shedding kuman B. abortus pada limpa dengan jumlah kuman mencapai lebih dari 300 colony forming unit (cfu) dan kemudian mengalami penurunan mulai minggu ke-2 sampai sampai dengan minggu ke-6 dan menghilang mulai pada minggu ke-7 pascainokulasi (Tabel 2). Rendahnya jumlah shedding kuman B. abortus pada limpa mencit yang diinokulasi dengan strain RB27 secara intraperitoneal menunjukkan bahwa strain RB27 yang diderivasi dari isolat lokal B. abortus S67 adalah strain yang tidak virulen sehingga aman digunakan sebagai kandidat vaksin brucellosis. Hal ini didukung pula dengan hasil analisis rasio berat limpa per berat badan marmut pada Tabel 2 yang juga menunjukkan adanya penurunan berat mulai minggu ke-2 walaupun pada minggu ke-3 tampak rasio tersebut lebih rendah dibandingkan minggu ke-4. Hal ini bisa terjadi kemungkinan karena mencit yang dibunuh setiap minggu sebanyak 5 ekor diambil secara acak dari total mencit 40 ekor dan pada minggu ke-3, sebanyak 2 ekor dari 5 ekor mencit yang dibunuh menunjukkan rekoveri koloni kuman B. abortus pada limpa lebih cepat terjadi sehingga rata-rata jumlah kuman pada limpa menjadi lebih rendah. Strain brucella dikatakan virulen apabila berat limpa lebih besar dari 2 gram dan jumlah bakteri pergram limpa mencapai lebih dari 1000 koloni (ALTON et al., 1988). Selain itu strain RB27 ini dapat tumbuh tanpa penambahan CO 2, strain yang bebas CO 2 dalam pertumbuhannya merupakan strain yang tidak virulen karena strain B. abortus yang patogen sangat tergantung CO 2 untuk pertumbuhannya. Setelah diketahui tingkat keamanan strain RB27 tersebut maka dilakukan uji proteksi pada mencit dengan ditantang B. abortus isolat lokal. Pemeriksaan serologis (RBT dan CFT) dilakukan terhadap serum mencit dari tiap-tiap kelompok sebelum uji tantang. Hasil pemeriksaan serologis RBT dan CFT tercantum pada Tabel 3. Hasil serologis Rose Bengal Test (RBT) menunjukkan bahwa pada saat ditantang, mencit-mencit yang divaksinasi (Kelompok I, II dan III) menunjukkan reaksi positif, sedangkan kelompok mencit yang tidak 743
divaksinasi bereaksi negatif. Hasil serologis Complement Fixation Test (CFT) menunjukkan titer antibodi yang terbentuk pada mencit kelompok I lebih tinggi dibandingkan denga kelompok II dan III. Hasil uji proteksi dihitung berdasarkan ada tidaknya strain B. abortus yang terdapat pada limpa. Pada penelitian ini untuk membedakan kuman vaksin RB27 dengan kuman B. abortus tantang isolat lokal dideterminasi dengan adanya reaksi aglutinasi dengan penambahan acriflavin dan absorbsi kristal violet oleh koloni bakteri. Penambahan acriflavin pada koloni kuman RB27 segar akan terjadi reaksi aglutinasi dan koloni strain RB27 akan menyerap warna kuning apabila dikultur pada media dengan penambahan kristal violet (BRAUN dan BONESTELL, 1947; WHITE dan WILSON, 1951). Uji proteksi menunjukkan bahwa B abortus strain RB27 (kelompok I) mampu melindungi mencit hingga 83% setelah ditantang dengan B abortus isolat lokal. Tingkat proteksi B abortus strain RB27 ini lebih tinggi dibandingkan dengan tingkat proteksi strain RB27 derivasi S158 (kelompok II) dan vaksin S19 (kelompok III) yaitu masing-masing sebesar 50% (Tabel 4). Hal ini terjadi karena mencit yang divaksinasi dengan RB27 derivasi S67 menghasilkan titer antibodi yang lebih tinggi dari pada titer antibodi mencit kelompok II dan III (Tabel 3.) sehingga proteksi terhadap uji tantang juga lebih tinggi. Tingkat proteksi vaksin S19 pada hewan coba marmut pada penelitian sebelumnya hanya mencapai 10% sedangkan hasil uji proteksi pada mencit sekarang ini tingkat proteksi mencapai 50%. Perbedaan ini terjadi kemungkinan karena perbedaan aplikasi vaksin atau dapat pula seed S19 yang digunakan pada tahun lalu sudah mengalami perubahan karena pasase yang berulang, dan seed S19 yang sekarang diuji berbeda dengan seed S19 tahun lalu. Tabel 3. Hasil pemeriksaan serologis RBT dan CFT serum mencit sebelum uji tantang dengan B. abortus isolat lokal Kelompok Perlakuan RBT CFT I RB27 (S67) II RB27 (S158) +2 3/8 +3 1/32 +3 1/32 +2 1/16 +3 1/128 III S19 IV Kontrol (Saline) 744
Tabel 4. Proteksi vaksin B. abortus RB27 pada mencit setelah ditantang dengan isolat lokal B. abortus Kelompok Σ mencit (ekor) Proteksi (x/n) % Rasio BB/BL I 15 14/15 (93,3%) 3,85 ± 0,64 II 15 11/15 (73%) 5,22 ± 0,87 III 15 0/15 (0%) 4,81± 0,80 x: banyaknya mencit yang tidak terinfeksi n: banyaknya mencit yang diinfeksi Walaupun strain B abortus RB27 derivasi isolat lokal S67 pada penelitian ini memberikan tingkat proteksi yang tinggi pada mencit namun strain tersebut masih perlu dievaluasi lebih lanjut sebagai kandidat vaksin brucellosis terutama mengenai aplikasi dan dosis vaksin yang diperlukan pada hewan besar (ruminansia) khususnya pada sapi dan juga tingkat proteksinya. KESIMPULAN Brucella abortus strain RB27 derivasi isolat lokal S67 merupakan strain yang tidak virulen dan aman digunakan sebagai kandidat vaksin Brucellosis. Tingkat proteksi B abortus strain RB27 derivasi isolat lokal S67 lebih tinggi dibandingkan B abortus strain RB27 derivasi isolat lokal S158 dan vaksin S19. DAFTAR PUSTAKA ACHA, P.N. and B. SZYFRES. 1980. Zoonosis and communicable diseases common to man and animals. Washington, DC. Pan American health organisation.pp. 28 45. ALTON, G.G., J.M. JONES, R.D. ANGUS and J.M. VERGER. 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. Institute National de la Recherche Agronomique. Paris. BRAUN, W. and A.E. BONESTALL. 1947. Independent variation of characteristics in Brucella abortus variants and their detection. J. Am. Vet. Res. 8: 386 390. BECKETT, F.W. and S.C. MACDIARMID. 1987. Persistent serological titres following reduced dose Brucella abortus strain 19 vaccination. Br. Vet. J. 143: 477 479. CORNER, L.A. and G.G. ALTON. 1981. Persistent of Brucella abortus strain 19 infection in adult cattle vaccinated with reduced doses. Res. Vet. Sci. 31: 342 344. DITJENNAK. 1981. Penyakit Keluron Menular (Brucellosis). Pedoman Pengendalian Penyakit Menular. Bina Direktorat Kesehatan Hewan. Dirjen Peternakan. Jakarta. ENRIGHT, F.M. 1990. The pathogenesis and pathobiology of brucella infection in domestic animals. In: Animal Brucellosis. Eds K. Nielson and J.R. Duncan. Boca Raton. Florida, CRC Press. pp. 301 320. GOODWIN, C.J., S.J. HOLT, S. DOWNES and N.J. MARSHALL. 1995. Microculture tetrazolium assay: a comparison between two new tetrazolium salt, XTT and MTS. J. Immunological Methods. 179: 95 105. MANTHEI, C.A. 1959. Summary of controlled research with strain 19. Proceedings of the 63 rd Annual meeting. United States Livestock sanitation Association.pp. 91 93. NICOLETTI, P. 1977. A preliminary report on the efÿficacy of adult cattle vaccination using strain 19 in selected dairy herds in Florida. Proc. 8 0t h Annu. Met. US Animal Health Assoc. pp. 9??(100. SCHURIG, G.G., AT. PRINGLE and S.S. BRESSe. 1981. Localization of Brucella antigens that elicit a humoral immune response in Brucella abortus infected cattle. Infect. Immun. 34: 100??(1007. SUDIBYO, A dan P. RONOHARDJo. 1989. Brucellosis pada sapi perah di Indonesia. Proc. Pertemuan Ilmiah Ruminansia Besar. pp. 2??(31. SUDIBYO, A. A. PRIADI, M. DARODJAT dan SUPAr. 198. Pengembangan vaksin oral brucellosis: Tingkat proteksi vaksin oral Brucella suis galur 2 terhadap tantangan 745
brucella suis isolat lapang pada marmot. Pros. Seminar Hasil-hasil penelitian Veteriner. pp. 51 55. SUDIBYO, A., P. RONOHARDJO, B. PATTEN dan Y. MUKMIN. 1991. Status brucellosis pada sapi potong di Indonesia. Penyakit Hewan. 23 (41):18 22. SUDIBYO A., E.D. SETIAWAN dan SJAMSUL BAHRI. 1997. Evaluasi vaksinasi brucellosis pada sapi potong di Nusa Tenggara Timur. Laporan Penelitian Tahun Anggaran 1996/1997. Balitvet, Bogor. WHITE, P.G. and J.B. WILSON. 1951. Differentiation of smooth and non-smooth colonies of brucellae. J. Bact. 61:239 240. 746