BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Mikroba yang menguntungkan dan merugikan dapat ditemukan di semua tempat, baik pada udara, menempel di permukaan kulit tangan bahkan bisa juga ditemukan pada makanan. Buah-buahan dan sayur-sayuran segar pun bukan jaminan terbebas dari mikroba. Buah dan sayur baik segar maupun busuk yang memiliki kandungan nutrisi dapat menjadi media tumbuh mikroba misalnya pada sampel sayuran busuk (selada busuk). Mikroba dari sampel selanjutnya dibiakkan untuk diidentifikasi bentuk morfologi serta dihitung jumlah koloni yang tumbuh, oleh karena itu kami menerapkan teknik isolasi dan enumerasi. 1.2. Rumusan Masalah 1.2.1. Bagaimana morfologi koloni bakteri yang tumbuh pada media? 1.2.2. Faktor apa sajakah yang mempengaruhi perbedaan jumlah koloni bakteri dalam setiap sampel? 1.3. Tujuan 1.3.1. Mahasiswa dapat mengetahui morfologi koloni bakteri yang tumbuh pada media. 1.3.2. Mahasiswa dapat mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi perbedaan jumlah koloni bakteri dalam setiap sampel. 1.4. Manfaat Manfaat yang dapat diperoleh dari praktikum ini adalah para peneliti atau pekerja yang membutuhkan teknik isolasi dan enumerasi koloni mikroba dalam penelitian atau pekerjaannya, dapat lebih memahami konsep isolasi dan enumerasi koloni mikroba serta lebih terampil dalam mengaplikasikan teknik tersebut secara aseptis. 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Isolasi adalah suatu cara untuk mendapatkan biakan murni dari suatu mikroba. Mikroba dapat diisolasi dari alam, misalnya sayuran busuk, buah busuk, lumpur danau atau sungai, limbah dan sebagainya. Isolasi mikroba dapat dilakukan dengan cawan gores atau cawan tuang. Sumber mikroba diberi perlakuan yang dapat merangsang pertumbuhan mikroba khususnya untuk mikroba yang diinginkan dan sekaligus menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan. Mikroba yang berhasil diisolasi harus dimurnikan berulang kali, sehingga koloni yang tumbuh dapat dipastikan berasal dari satu sel karena tidak semua mikroba mampu membentuk mikrokoloni yang terpisah secara sempurna. Biakan murni yang didapatkan selanjutnya dipindahkan secara steril pada biakan baru dan disebut sebagai isolat. (Yulneriwarni, 2008). Isolat yang telah dipindahkan kemudian diinkubasi selama 24-48 jam (temperatur 37 o C) kemudian dilakukan enumerasi. Enumerasi adalah suatu teknik penghitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasikan jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif. Isolasi dilakukan dengan menggunakan taoge agar dan dilakukan pemurnian untuk mendapatkan koloni tunggal dengan metode gores (streak plate) yaitu quadrant streak (Method B) kemudian dilakukan pengamatan morfologi masing-masing koloni tunggal yang tumbuh pada media agar tersebut. Jumlah mikroba yang tumbuh pada media ditunjukkan oleh Colony Forming Units (CFU) atau satuan bentuk koloni. Jumlah normal koloni pada biakan adalah 30-300 koloni. (Herbert, 1978; Hastuti, 2007) Mikroba penyebab makanan busuk dapat ditemukan di tanah, air dan udara baik dalam kondisi hangat maupun lembab. Tumbuhnya mikroba di dalam bahan pangan dapat mengubah komposisi bahan pangan, dengan beberapa cara yakni: menghidrolisis pati dan selulosa menjadi fraksi yang lebih kecil, menyebabkan fermentasi gula, menghidrolisis lemak, mencerna protein, menghasilkan bau busuk dan amoniak. Beberapa mikroba dapat membentuk lendir, gas, busa, warna, asam, toksin, dan lainnya. (Susiwi, 2009) Sayuran merupakan salah satu mikronutrien yang penting bagi pertumbuhan. Sayuran yang segar pasti memiliki kandungan bakteri yang lebih sedikit daripada sayuran yang busuk karena sayuran yang busuk pasti terkontaminasi berbagai macam bakteri, apabila didasarkan pada SK Dirjen POM No. 03726/B/SKNII/89 maka kandungan bakteri aerob yang diizinkan maksimum adalah 10 6 koloni/g sehingga jika suatu makanan (sayuran) yang mengadung jumlah koloni bakteri melebihi batas ambang tersebut maka makanan tersebut dikatakan tidak layak konsumsi. (Harsojo, 2000; Sinaga, 2000; Andini, 2000) 2
BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Kegiatan praktikum isolasi dan enumerasi ini dilaksanakan pada: Hari, tanggal : Selasa, 25 September 2012 Pukul : 8.50 10.40 WIB Tempat : Laboratorium Mikrobiologi Gedung C9 FMIPA UNESA 3.2. Alat dan Bahan Alat dan Bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi, enumerasi dan pemurnian mikroorganisme diantaranya : a. Alat Spet/suntikan (7 buah) Cawan Petri (6 buah) Pembakar spirtus Jarum inokulasi/ose Lemari pendingin Pinset Incubator Colony counter Neraca Ohaus Vortex b. Bahan Sayuran (selada) busuk (1 g) Taoge agar (150 ml dan 100 ml) Akuades (9 ml x 7=63 ml) 3.3. Metode Prosedur yang pertama untuk isolasi/penanaman mikroorganisme dilakukan dengan cara sayuran busuk (selada) ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml akuades steril (disebut juga suspensi pengenceran 10-1 ). Setiap langkah tersebut dilakukan secara aseptis. Suspensi pengenceran 10-1 dihomogenkan terlebih dahulu kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril (disebut suspensi pengenceran 10-2 ). Langkah tersebut dilakukan berulang sampai mendapatkan sampel 3
dengan suspensi pengenceran 10-7. Sampel tersebut secara aseptis diambil sebanyak 1 ml dari pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7 untuk kemudian dimasukkan ke dalam cawan Petri steril secara terpisah dengan menggunakan cara duplo (satu sampel dari setiap pengenceran ditanam pada dua cawan Petri masing-masing sebnayak 1 ml). Media taoge agar yang terlebih dahulu dipanaskan kemudian didinginkan hingga suhunya turun menjadi kurang lebih 45 o C. Media taoge agar selanjutnya dituangkan ke setiap cawan petri yang telah berisi sampel. Sampel dan media tersebut dihomogenkan dengan cara menggerakkan cawan petri membentuk angka 8 sehingga dihasilkan biakan. Biakan tersebut diinkubasi dengan posisi cawan petri terbalik pada suhu antara 28-30 o C selama 24-48 jam. Koloni bakteri yang terbentuk diamati morfologinya. Prosedur yang kedua untuk enumerasi/penghitungan mikroorganisme yang terdapat pada sampel dilakukan dengan cara koloni yang terbentuk setelah diinkubasi pada setiap cawan petri diamati dan dihitung jumlahnya. Jumlah mikroorganisme yang terdapat pada sampel uji ditentukan berdasarkan Standart Plate Count. 4
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Hasil pengamatan morfologi dan enumerasi koloni yang tumbuh pada media kami sajikan dalam bentuk tabel berikut ini: 5
6
Tabel 4.2. Data Enumerasi Kelas Sampel Busuk Jumlah Koloni Per Pengenceran 10-5 10-6 10-7 1 2 1 2 1 2 Jumlah Koloni (CFU/gr) Kangkung 165 138 45 54 TBUD TBUD 1,5 x 10 7 Selada TBUD TBUD 106 93 72 52 1,0 x 10 8 Bayam 235 270 4 5 2 3 2,5 x 10 7 Daun Bawang 64 92 7 9 3 4 7,8 x 10 6 Manisa 65 63 19 7 2 1 6,4 x 10 6 Sawi Putih 55 73 63 55 34 17 6,4 x 10 6 Wortel 12 6 3 1 2 1 <30 x 10 5 (9,0 x 10 3 ) 4.2. Pembahasan Tabel pertama merupakan data hasil pengamatan morfologi koloni bakteri yang tumbuh pada media. Kelompok kami menemukan 12 jenis koloni yang berbeda pada media dengan pengenceran sampel 10-6 pertama, 10-6 kedua, 10-7 pertama dan 10-7 kedua. Media dengan pengenceran sampel 10-5 pertama dan 10-5 kedua tidak kami amati karena koloni bakterinya sangat banyak dan rapat sehingga sulit untuk dilakukan pengamatan. Tabel kedua merupakan hasil olahan dari data enumerasi kelas. Sampel dengan jumlah bakteri tertinggi adalah selada busuk dengan jumlah koloni 1,0 x 10 8 CFU/gr. Wortel busuk berbeda dengan sampel yang lain karena pada sampel ini ditemukan jumlah bakteri terendah yaitu <30 x 10 5 (9,0 x 10 3 ) CFU/gr. 7
Jumlah mikroorganisme yang terdapat pada sampel uji ditentukan berdasarkan Standart Plate Count. Ambang batas yang ditetapkan oleh Badan POM sebagai standar batas kontaminasi bakteri yang masih dianggap aman untuk dikonsumsi adalah sebesar < 10 6 CFU/ml. Enam dari tujuh sampel busuk yang kami amati ternyata melebihi standar tersebut, sedangkan satu diantaranya masih dalam tahap aman dikonsumsi yakni wortel. Perbedaan jumlah koloni bakteri dalam setiap sampel disebabkan oleh beberapa faktor, misalnya perbedaan tingkat kebusukan pada setiap sampel yang digunakan, terjadinya kontaminasi melalui udara sebagai akibat praktikan terlalu banyak bicara selama praktikum, ruangan praktikum yang tidak sepenuhnya steril, proses pemindahan isolat yang dilakukan jauh dari sumber api, kurang akuratnya praktikan dalam menimbang dan mengukur sampel, tertinggalnya jarum spet dalam tabung reaksi, kurang telitinya praktikan pada saat menghitung jumlah koloni menggunakan colony counter dan kurangnya pemantapan praktikan dalam pemahaman baik konsep maupun teknik-teknik isolasi. 8
BAB V PENUTUP 5.1. Kesimpulan Berdasarkan pembahasan di atas dapat disimpulkan bahwa koloni bakteri yang terdapat pada setiap sampel selada busuk memiliki morfologi yang berbeda-beda dan sangat beragam yang meliputi ukuran koloni; bentuk (punctiform, circular, filamentous, irregular, rhizoid, spindle); karakteristik optik (opaque, translucent, transparent); karakteristik permukaan (halus mengkilap, kasar, berkerut, kering seperti bedak); pigmentasi (pigmentasi, nonpigmentasi); elevasi (flat, raised, convex, pulvinate, umbonate); dan bentuk tepiannya (entire, undulate, lobate, erose, filamentous, curled). Jumlah koloni bakteri dalam setiap sampel sayuran busuk pun sangat beragam. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain tingkat kebusukan yang berbeda antara satu sampel dengan sampel yang lain, praktikan kurang aseptis selama kegiatan berlangsung, praktikan kurang akurat dalam menimbang dan mengukur sampel yang digunakan serta praktikan kurang berhati-hati dalam mengaplikasikan teknik-teknik isolasi. 5.2. Saran Praktikan harus menguasai betul prosedur isolasi yang benar, cekatan dan selalu menerapkan teknik aseptis pada alat, bahan, lingkungan maupun diri praktikan baik sebelum, selama atau selesai kegiatan praktikum untuk mencegah kemungkinan kontaminasi. 9
DAFTAR PUSTAKA Harsojo; Sinaga, Rosalina dan Andini, L.S., 2000. Sanitasi makanan olahan di Jakarta dan Tangerang. Makalah. Disampaikan pada Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Hastuti, Ratih Dewi dan Ginting, Rohani Cinta Badia. 2007. Enumerasi bakteri, cendawan, dan aktinomisetes. 2.2 in Rasti Saraswati, Edi Husen, R.D.M Simanungkalit. Metode Analisis Biologi Tanah. Bogor : Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Herbert, S.D., dan Cox, D.J., 1978, An Anaerobic Glove Box for the Isolation and Cultivation of Methanogenic Bacteria, Journal of Applied Bacteriology, 45:411-415 Susiwi. 2009. Kerusakan Pangan. Web publication http://file.upi.edu/direktori/fpmipa/jur._pend._kimia/195109191980032- SUSIWI/SUSIWI-28%29._Kerusakan_Pangan.pdf. Diunduh tanggal 26 September 2012. Yulneriwarni, 2008. Mikroba, dari habitat ke industri. Makalah. Disampaikan dalam Simposium Biologi Industri, Fakultas Biologi Universitas Nasional, Jakarta 11 November 2008. 10
LAMPIRAN Penimbangan sampel (selada busuk) sebanyak 1 gram Akuades steril 9 ml Menghomogenkan media dengan sampel (untuk pengenceran 10-1 ) Menghomogenkan media dengan sampel (untuk pengenceran 10-7 ) Biakan yang diinkubasi agar tumbuh Penghitungan koloni menggunakan colony counter 11
12