II. METODELOGI PENELITIAN 2.1 Metode Pengumpulan Data 2.1.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di UPT Laboratorium Biosain dan Bioteknologi Universitas Udayana. Penelitian ini berlangsung selama 3 bulan yang dimulai dari bulan November 2011 hingga Januari 2012. 2.2 Prosedur Penelitian 2.2.1 Penyegaran Isolat Bakteri Pediococcus acidilactici dari Stok Kultur pada Media MRS Broth Biakan murni isolat P. acidilactici yang diisolasi dari susu sapi Bali dari 10 strain BAL dalam vial stok biakan yang disimpan dalam gliserol pada suhu -20 o C, diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 5 ml MRS broth steril dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat pada media ini ditandai dengan meningkatnya kekeruhan media MRS Broth. Tabung reaksi yang menunjukkan hasil positif akan digunakan dalam tahap pengujian selanjutnya. 2.2.2 Pembuatan Working Culture BAL Isolat Susu Sapi Bali Isolat BAL yang telah disegarkan, dibuat koloni tunggal yang terpisah dengan metode Streak for single colony pada media MRS agar. Koloni yang terpisah diinokulasikan ke dalam 5 ml MRS Broth dan diinkubasi pada temperatur 37 o C selama 24 jam. Dari suspensi tersebut juga dibuat stok gliserol dengan menambahkan 1 ml kultur isolat ke dalam 1 ml gliserol 30% dan kemudian di simpan di dalam freezer pada temperatur -20 o C sampai waktu yang tidak terbatas. Working culture dibuat dengan cara stab inoculation dari bakteri stock culture pada 5 ml MRS agar dan diinkubasi pada temperatur 37 o C selama 24 48 jam (Hadioetomo, 1990). 6
2.2.3 Uji Konfirmasi 2.2.3.1 Uji Pewarnaan Gram Uji pewarnaan dilakukan pada masing-masing isolat yang berumur 24 jam dengan tujuan untuk menyakinkan bahwa bakteri yang akan dipakai adalah bakteri yang benar dan murni. Masing-masing isolat diuji dengan menggunakan perangkat pewarna Gram. Isolat yang dikonfirmasi mula-mula dibuat apusannya pada gelas benda dengan cara mengambil 1 jarum ose, kemudian ditunggu hingga mengering sambil difiksasi di atas api bunsen (kira-kira 20 cm di atas bunsen), diwarnai dengan gentian violet selama 1,5 menit, dicuci dengan air mengalir dalam keadaan terbalik, dikeringkan, ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan kontak selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, ditetesi dengan alkohol 96% dan dibiarkan selama 5 detik, dicuci dengan air mengalir, dan diwarnai dengan pewarna tandingan safranin selama 1 menit. Sel bakteri yang telah terwarnai dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan kertas hisap tanpa menggosok sediaan, dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Bakteri gram positif akan tampak berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan tampak berwarna merah dibawah mikroskop. Kelompok BAL merupakan bakteri gram positif, sehingga akan mengikat zat warna gentian violet dengan sangat kuat dan terlihat berwarna ungu dibawah mikroskop (Lay, 1994). 2.2.3.2 Uji Katalase Sebanyak dua tetes H2O2 dengan konsentrasi 10% diteteskan pada apusan bakteri uji pada kaca objek dan diamati gelembung gas yang terbentuk. Hasil positif ditunjukkan oleh terbentuknya gelembung gas oksigen yang dihasilkan dari degradasi H2O2 oleh enzim katalase, sedangkan pada hasil negatif tidak diikuti oleh terbentuknya gas (Hadioetomo, 1990; Soemarno, 2000). Bakteri Asam Laktat memberikan hasil negatif terhadap uji ini (Sujaya et al., 2008). 7
2.2.3.3 Uji Produksi Gas dari Hasil Metabolisme Glukosa Ke dalam suspensi isolat Bakteri Asam Laktat pada media MRS broth, dimasukkan jarum ose panas (hot-loop). Hasil positif ditunjukkan oleh adanya gelembung gas karbondioksida dari hasil metabolisme glukosa (Sperber and Swan, 1976). Bakteri Asam Laktat memberikan hasil negatif terhadap uji ini (Sujaya et al., 2008). 2.3 Uji Ketahanan Bakteri Pediococcus acidilactici Terhadap ph Rendah Biakan murni dari isolat Bakteri P. acidilactici dibuat suspensinya dengan cara menginokulasikan 1 jarum ose Bakteri Asam Laktat ke dalam 5 ml MRS Broth dan diinkubasi pada temperatur 37 o C selama 24 jam. Kemudian, sebanyak 100 µl suspensi BAL ini dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 900 µl media MRS Broth yang ph 2, 3 dan 4, diinkubasi selama 3 jam dalam water bath pada suhu 37 o C, disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Pelet bakteri pada dasar tabung selanjutnya dicuci sebanyak dua kali dengan 300 µl larutan salin (dengan cara divortex dan disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 7000 rpm yang dilakukan sebanyak dua kali dan supernatannya dibuang). Pelet yang dihasilkan selanjutnya disuspensikan dalam 300 µl larutan salin dan sebanyak 50 µl suspensi ini diinokulasikan kedalam 5 ml media MRS Broth ph netral untuk selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Meningkatnya kekeruhan biakan pada medium MRS Broth ph netral ini yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm (OD 660 nm) menunjukkan bahwa BAL tersebut dapat bertahan pada ph rendah (Sant Anna dan Torres, 1998; Hyronimus et al., 2000). Untuk mendapatkan data yang representative, maka assay ini diulang sebanyak 3 kali. Kriteria yang dipakai untuk menilai adanya pertumbuhan (ketahanan) bakteri uji ini pada ph rendah adalah dengan mengamati tingkat kekeruhannya pada media cair yang diukur nilai 8
absorbansinya dengan spektrofotometer. Bila nilai absorbannya (A) < 0,1 maka strain bakteri tersebut dikatagorikan tidak tahan terhadap ph rendah (Sujaya, et al., 2008). 2.4 Uji Ketahanan Bakteri Pediococcus acidilactici Terhadap Deoksikolat Dari working culture dibuat suspensi isolat Bakteri P. acidilactici dengan menginokulasikan 1 jarum ose bakteri tersebut ke dalam 5 ml MRS Broth kemudian diinkubasi selama 24 jam pada temperatur 37 0 C. Isolat yang tumbuh tersebut divortex terlebih dahulu, kemudian disiapkan 4 buah tabung yang berisi masin-masing 5 ml media MRS Broth. Ke dalam masing-masing tabung ditambahkan suspensi bakteri sebanyak 50 µl. Tabung pertama sebagai kontrol (bakteri tidak ditambahkan Natrium Deoksikolat atau NaDC). Tabung kedua ditambahkan 10 µl NaDC 100 mm (konsentrasi NaDC 0,2 mm), tabung ketiga ditambahkan 20 µl NaDC 100 mm (konsentrasi NaDC 0,4 mm), dan tabung keempat ditambahkan 30 µl NaDC 100 mm (konsentrasi NaDC 0,6 mm). Selanjutnya setiap tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Ketahanan isolat Bakteri Asam Laktat diukur berdasarkan tingkat kekeruhan (OD 660 nm) menggunakan spektrofotometer. Penelitian ini diulang sebanyak 3 kali (Hyronimus et al., 2000; Prangdimurti, 2001). Kriteria yang dipakai untuk menilai adanya ketahanan bakteri uji ini pada NaDC sama dengan yang dilakukan pada uji ketahanan terhadap ph rendah diatas. 2.5 Bioassay Resistensi Terhadap Antibiotika Isolat diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasi ke media MRS broth, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Proses penanaman isolat bakteri P. acidilactici dilakukan dengan penyebaran isolat di atas media MRS Agar. Isolat yang sudah diinkubasi, dihomogenkan terlebih dahulu dengan vortex, disebar sebanyak 100 µl di atas media agar yang telah disiapkan, Dibiarkan kering selama kurang lebih 15 menit, dan setelah kering, kertas cakram yang mengandung antibiotika dan 9
kertas cakram kontrol diletakkan pada masing-masing bagian pada cawan petri. Semua cawan selanjutnya diinkubasi 48 jam (Kirby and Bauer, 1966). Proses inkubasi untuk isolat P. acidilactici dilakukan dengan meletakkan cawan petri ke dalam anaerobic chamber terlebih dahulu, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator. Zona bening yang terbentuk menunjukkan adanya penghambatan antibiotika terhadap pertumbuhan Bakteri Asam Laktat (BAL) 2. 6 Bentuk Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium yang bertujuan untuk mengetahui ketahanan Bakteri Asam Laktat yang diisolasi dari susu sapi Bali terhadap ph rendah, deoksikolat dan beberapa jenis antibiotik yang umum dipakai dalam mengobati masalah infeksi saluran pencernaan. Secara umum rangkaian penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 1. Pembuatan Media Penyegaran Isolat Bakteri Uji Konfirmasi Isolat Bakteri Asam Laktat Uji Pewarnaan Gram Uji Katalase Uji produksi gas dari metabolisme glukosa Uji ph Rendah Uji Deoksikolat Bioassay Antibiotik Analisis Data Gambar 1. Skema Tahapan Penelitian 10
2.7 Analisis Data Data yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis secara deskriptif dan dalam beberapa hal juga dilakukan analisis kuantitatif dengan menggunakan analisis sidik ragam (Analysis of Variance atau ANOVA). Jika dalam analisis ANOVA ini diperoleh hasil yang berbeda nyata pada p < 0,05, maka uji dilanjutkan dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan menggunakan Software SPSS Release For Windows versi 15. 11