BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Objek dan Lokasi Penelitian Objek atau bahan penelitian ini adalah biji paria (Momordica charantia) yang diperoleh dari Kampung Pamahan, Jati Asih, Bekasi Determinasi tanaman paria dilakukan di Sekolah Ilmu Hayati ITB Bandung. Lokasi penelitian adalah Laboratorium Research, Laboratorium Kimia Analitik Instrumen Jurusan Pendidikan Kimia dan Laboratorium Farmakologi UNIGA. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam tahap ekstraksi dan fraksinasi ekstrak biji paria adalah peralatan gelas standar kimia organik/kimia bahan alam, set alat destilasi, penguap berputar vakum (vacuum rotary evaporator), pompa vakum, dan corong buchner. Peralatan yang digunakan untuk uji efek antihiperglikemia adalah set alat pengukur glukosa darah dan sonde oral sedangkan peralatan untuk pengujian senyawa hasil isolasi adalah Fourier Transform-Infra Red (FT-IR) Spectrophotometer Shimadzu 8400, dan HPLC. 31
3.2.2 Bahan Bahan yang digunakan pada proses ekstraksi dan fraksinasi adalah pelarut metanol redest, n-heksan redest, etil asetat redest, butanol pro analis. Sedangkan untuk uji toleransi glukosa adalah glukosa, tragakan, dan glibenklamid. Untuk uji warna digunakan bahan seperti kloroform pa, HgCl 2 pa, HCl pekat, serbuk Mg pa, CH 3 COOH glasial, H 2 SO 4 pekat, FeCl 3. 6H 2 O pa, NaOH, dan aquades. 3.2.3 Hewan Uji Hewan uji yang digunakan untuk uji antihiperglikemia adalah tikus putih dari galur Wistar berumur 2-3 bulan dengan berat rata-rata 150 200 gram. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dirancang untuk untuk mencari fraksi aktif dari biji Momordica charantia, hal ini akan dilakukan melalui isolasi yang diuji efek antihiperglikemia (antidiabet) terhadap tikus dari galur Wistar. Tikus putih berumur 3 bulan dengan berat 150-200 gram diadaptasi untuk penggujian. Setelah itu, tikus dikelompokan ke dalam 7 kelompok masing-masing terdiri dari 3 ekor. Tikus dipuasakan sebelum diuji dan dihitung kadar glukosa darahnya dan ditetapkan sebagai kadar glukosa awal. Kemudian kadar glukosa darah dicek setiap 30 menit selama 2 jam. Data Bagan alir penelitian yang telah dilakukan dapat dilihat pada Gambar 3.1. 32
Biji M. charantia - diiris tipis - dikeringkan - dihaluskan Serbuk Biji M. charantia kering maserasi metanol Ekstrak metanol Fraksinasi heksan Ekstrak metanol 1 Fraksi heksan Ekstrak metanol-air Fraksinasi EtoAc Fraksi etil asetat Uji efek antihiperglikemia & Identifikasi golongan senyawa (uji warna, IR, HPLC) Fraksinasi n-butanol Fraksi residu Fraksi butanol Fraksi aktif dan golongan senyawanya Gambar 3.1. Bagan alir penelitian 33
Tahapan kegiatan yang telah dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Tahap penyiapan sampel dan determinasi tanaman paria 2. Tahap isolasi dan fraksinasi 3. Tahap uji aktivitas antidiabetes ekstrak dan fraksi biji tanaman paria 4. Tahap pengukuran data spektoskopi (FT-IR dan HPLC) dan uji golongan senyawa fraksi aktif. 3.3.1 Penyiapan Sampel Pada awal penelitian, dilakukan penentuan spesies tumbuhan atau determinasi tumbuhan di Sekolah Ilmu Hayati ITB Bandung. Buah tanaman paria yang akan digunakan, dibersihkan terlebih dahulu dari debu, tanah serta bagian yang tidak diperlukan. Kemudian diiris halus kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari atau dengan menggunakan oven. Selanjutnya bahan kering tersebut dihaluskan. 3.3.2 Ekstraksi Teknik ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Serbuk biji tanaman paria direndam dengan pelarut metanol. Setelah perendaman dilakukan, dilanjutkan dengan penyaringan menggunakan corong Buchner dan hasilnya dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator vaccum. 3.3.3 Fraksinasi (Ekstraksi Cair-Cair) Ekstrak metanol yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan alat rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental metanol. Ekstrak kental kemudian diencerkan dengan metanol sampai volume 500 ml. 34
Ekstrak metanol lalu difraksinasi dengan menggunakan pelarut yang berbeda kepolarannya. Secara berturut-turut heksan, etil asetat, dan butanol. Setiap fraksinasi dilakukan sebanyak 3 kali per 50 ml ekstrak. 3.3.4 Uji Efek Antihiperglikemia Pada penelitian ini uji efek antihiperglikemia akan dilakukan dengan menggunakan metode uji toleransi glukosa. Parameter yang diamati pada metode ini adalah penurunan kadar glukosa darah yang dibandingkan dengan kontrol dan diukur dengan menggunakan alat glucotest Optimum Omega. Prinsip metode uji toleransi glukosa adalah tikus uji diinduksi hiperglikemia dengan pemberian larutan glukosa secara oral dengan dosis 2 g/kg bb setengah jam setelah pemberian sedian uji. Pemeriksaan kadar glukosa darah kembali dilakukan pada menit ke-30, 60, 90, dan 120 menit setelah pemberian larutan glukosa. Berikut ini adalah prosedur pengujian efek antihiperglikemia yang akan dilakukan : Penyiapan Hewan Uji Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih yang telah diadaptasikan selama satu minggu dan menunjukkan perilaku normal serta berat badan naik atau tetap. Pengujian Efek Antihiperglikemia Tikus untuk pengujian dibagi menjadi 7 kelompok yang masing-masing terdiri dari tiga ekor tikus jantan. Untuk rincian masing-masing kelompok dapat dilihat sebagai berikut : 1. Kelompok I : kontrol positif yang diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah suspensi tragakan 2 % 35
2. Kelompok II : pembanding diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah glibenklamid dosis 0,45 mg/kg bb 3. Kelompok uji III : diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah ekstrak metanol biji paria dosis 250 mg/kg bb 4. Kelompok uji IV : diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah fraksi etil asetat biji paria dosis 250 mg/kg bb 5. kelompok uji V : diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah fraksi n-butanol biji paria dosis 250 mg/kg bb 6. Kelompok uji VI : diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah fraksi residu biji paria dosis 250 mg/kg bb 7. Kelompok uji VII : diberi glukosa 2 g/kg bb ditambah fraksi heksan biji paria dosis 250 mg/kg bb Pada hari percobaan semua tikus ditimbang berat badannya kemudian diberi perlakuan. Tikus yang telah dipuasakan selama 16 jam diberi ekstrak dan fraksi yang diujikan. Pemeriksaan kadar glukosa darah dilakukan melalui cuplikan darah yang diambil dengan cara memotong sedikit bagian ekor tikus jantan. Tiga puluh menit kemudian diambil cuplikan darah vena, sebagai kadar glukosa awal atau puasa. Kemudian tikus diberi larutan glukosa 2 g/kg bb. Kadar glukosa darah kembali diukur pada menit ke-30, 60, 90, dan 120 setelah pemberian glukosa. 36
Analisa Data Untuk uji efek antihiperglikemia, seluruh nilai yang diperoleh dikonversi sebagai S.D, kemudian data dianalisa secara statistik menggunakan program SPSS untuk analisis varians (ANAVA) dan uji lanjut LSD. 3.3.5 Penentuan Golongan Senyawa Fraksi Aktif Masing-masing ekstrak dan fraksi diidentifikasi komponen fitokimianya dengan metode pereaksi warna. Dalam metode ini dapat diketahui secara kualitatif golongan senyawa yang terdapat pada masing-masing ekstrak. Senyawa yang diperiksa adalah senyawa golongan alkaloid, flavonoid, kuinon, tanin, steroid dan terpenoid. Berikut adalah prosedur penentuan golongan senyawa dengan pereaksi warna : 1. Pemeriksaan Alkaloid Ekstrak kental dari masing-masing fraksi diambil satu ml, lalu ditambahkan lima tetes kloroform dan beberapa pereaksi Mayer yang terbat dari satu gram KI dilarutkan dalam 20 ml aquades sampai semuanya melarut. Lalu ke dalam larutan KI tersebut ditambahkan 0,271 gram HgCl 2 sampai larut. Terbentuknya endapan putih menandakan adanya alkaloid. 2. Pemeriksaan Flavonoid Ekstrak kental dari masing-masing fraksidiambil sebanyak satu ml, lalu ditambah dengan serbuk Mg sebanyak satu gram dan 10 ml HCl pekat. Perubahan warna larutan menjadi warna kuning menandakan adanya flavonoid. 37
3. Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid Ekstrak kental dari masing-masing fraksi diambil sebanyak satu ml, lalu ditambah dengan satu ml CH 3 COOH glasial dan satu ml asam sulfat pekat. Jika warna berubah menjadi ungu/ biru menandakan adanya senyawa steroid. Jika warna berubah menjadi merah menandakan adanya senyawa terpenoid. 4. Pemeriksaan Tanin Ekstrak kental dari masing-masing fraksi diambil sebanyak satu ml, lalu ditambah dengan beberapa tetes FeCl 3. 6H 2 O 1 %. Perubahan warna menjadi biru tua menandakan adanya senyawa fenolik. 5. Pemeriksaan Kuinon Ekstrak kental dari masing-masing fraksi diambil sebanyak satu ml, lalu ditambah dengan beberapa tetes NaOH 0,1 N. Perubahan warna menjadi merah menandakan adanya senyawa kuinon. 6. Pemeriksaan Antosianin Ekstrak kental dari masing-masing fraksi diambil sebanyak satu ml, lalu ditambah dengan beberapa tetes HCL 0,1 N. Perubahan warna menjadi merah menandakan adanya senyawa antosianin. 3.3.6 Pengukuran Data Spektroskopi FT-IR Pengukuran data spektroskopi dimaksudkan untuk memperoleh informasi golongan senyawa dari fraksi aktif yang telah diukur. Spektrum IR akan menyumbangkan informasi tentang gugus fungsi yang dimiliki oleh senyawa mayor yang ada di dalam setiap fraksi biji buah Momordica charantia. Spektrum 38
IR senyawa organik bersifat sangat khas bagi setiap senyawa tertentu. Gugus fungsi tersebut akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang spesifik. 3.3.7 Pengukuran Data Pola Kromatografi HPLC Kromatogram HPLC membantu mengetahui berapa banyak komponen yang terdapat dalam suatu campuran. Larutan cuplikan masing-masing ekstrak dimasukkan ke dalam kolom dengan kondisi yang diset sebagai berikut : tekanan pompa 31,000 kgf/cm 2, kecepatan alir 0,500 ml/menit, panjang gelombang 254 nm, dan waktu 10 menit. Fasa gerak mendorong komponen melewati kolom dan terjadi pemisahan. Perbedaan pemisahan menyebabkan komponen-komponen memisah menjadi pita-pita sepanjang kolom dan dideteksi oleh detektor dan sinyalnya diplot sebagai fungsi waktu, sederet puncak-puncak simetri diperoleh yang disebut kromatogram. Dari kromatogram dapat diperoleh informasi tentang jumlah komponen penyusun campuran, jenis-jenis komponen, dan konsentrasi tiap komponen yang terdapat dalam msing-masing fraksi. 39