BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Objek dan Lokasi Penelitian Objek atau bahan penelitian ini adalah daging buah paria (Momordica charantia L.) yang diperoleh dari Kampung Pamahan-Jati Asih, Bekasi. Dan untuk memastikan identitas dari tanaman paria yang didapatkan maka dilakukan uji determinasi di Sekolah Tinggi Ilmu Hayati ITB Bandung (Lampiran 1). Selain itu hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan bobot badan rata-rata 180-200 gram, umur 2-3 bulan yang diperoleh dari Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati ITB. Lokasi penelitian dilaksanakan di Laboratorium Riset, Laboratorium Kimia Instrumen Jurusan Pendidikan Kimia UPI Bandung, dan Laboratorium Farmakologi Jurusan Farmasi UNIGA. 3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat Peralatan yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat gelas, penguap berputar vakum (vaccum rotary evaporator), pompa vakum, HPLC (High Performance Liquid Chromatography), Spektrofotometer FT-IR (Fourier Transform-Infra Red) Shimadzu 8400, dan alat-alat uji toleransi glukosa yang 25
meliputi Optimum Omega (alat pengukur gula darah), stik test glukosa darah, dan sonde oral. 3.2.2. Bahan Pada penelitian ini, bahan utama yang digunakan adalah daging buah Momordica charantia. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan teknis dan bahan pro analisis (p.a). Bahan dengan kualitas teknis didestilasi terlebih dahulu sebelum digunakan. Bahan-bahan yang digunakan adalah metanol, heksan, etil asetat, aseton, n-butanol p.a, kloroform p.a, HgCl 2 p.a, HCl pekat, serbuk Mg p.a, CH 3 COOH glasial, H 2 SO 4 pekat, FeCl 3 p.a, NaOH, aquades, kertas saring. Sedangkan bahan yang digunakan untuk uji toleransi glukosa adalah larutan glukosa 20%, tagrakan, glibenklamid. 3.3. Metodologi Penelitian Pelaksanaan penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan. Tahapan tersebut yaitu penyiapan sampel, ekstraksi, fraksinasi, uji efek antihiperglikemia, uji fitokimia, karakterisasi FTIR, dan HPLC. Bagan alir penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada gambar 3.1 dibelakang ini : 26
Buah Daging Buah Paria Biji Paria - dikeringkan dengan bantuan sinar matahari - diblender Serbuk Daging Buah Paria - Maserasi dengan metanol Residu Ekstrak Metanol - Fraksinasi dengan Heksan Fraksi Metanol Sisa Fraksi Heksan - Fraksinasi dengan Etil Asetat Fraksi Metanol - Air Fraksi Etil Asetat - Fraksinasi dengan n-butanol - Uji Efek Antihiperglikemia - Karakterisasi Senyawa dalam Fraksi Fraksi Metanol - Air Fraksi n-butanol Fraksi Aktif Antihiperglikemia dan Golongan Senyawa dalam Fraksi Aktif Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian 27
Uraian dari masing-masing pekerjaan yang dilakukan adalah sebagai berikut: 3.3.1. Penyiapan Sampel Tumbuhan Tahap awal penelitian dimulai dari pengambilan sampel buah paria yang berumur 14 hari dari Kampung Pamahan-Jati Asih, Bekasi. Buah paria yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu dari kotoran yang menempel. Setelah itu, dipisahkan antara daging buah dengan biji yang kemudian diiris-iris dan dikeringkan dengan bantuan sinar matahari sampai kering. Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggiling sampai terbentuk serbuk. Kemudian serbuk daging buah paria yang diperoleh ditimbang untuk mengetahui berat daging buah dalam kondisi yang telah dikeringkan. 3.3.2. Proses Ekstraksi Serbuk daging buah paria (Momordica charantia L.) diekstraksi menggunakan pelarut metanol. Teknik ekstraksi yang digunakan ialah ekstraksi cair-padat dengan metode maserasi. Sampel direndam dalam pelarut metanol 6 x 2 liter berturut-turut selama 24 jam. Ekstrak hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong buchner Lalu filtratnya dipekatkan menggunakan rotary evaporator dalam keadaan vakum. Ekstrak pekat metanol kemudian ditimbang dan diencerkan kembali menggunakan 500 ml metanol. 28
Ekstrak metanol yang telah diencerkan difraksinasi berturut-turut dengan heksan (3 x 50 ml), etil asetat (3 x 50 ml), n-butanol (2 x 50 ml) sehinggga diperoleh fraksi heksan, etil asetat, n-butanol, dan metanol sisa. Masing-masing fraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan cara penguapan menggunakan alat rotary evaporator sampai diperoleh massa yang tetap dari masing-masing fraksi. 3.3.3. Uji Efek Antihiperglikemia Uji efek antihiperglikemia yang dilakukan adalah dengan menggunakan metode uji toleransi glukosa. Parameter yang diukur pada metode ini adalah penurunan kadar glukosa darah tikus uji yang dibuat hiperglikemia dengan memberikan larutan glukosa 20% secara oral dengan dosis 250 mg/kg berat badan 30 menit setelah pemberian ekstrak yang dibandingkan dengan kontrol yang diukur dengan menggunakan alat Optimum Omega. Pengukuran kadar glukosa darah kembali dilakukan pada menit ke-30, 60, 90, dan 120 setelah pemberian larutan glukosa. Prosedur pengujian yang dilakukan adalah sebagai berikut : a. Penyiapan hewan uji Hewan uji yang digunakan adalah tikus putih yang berasal dari galur Wistar dengan berat badan rata-rata 180-200 gram dan telah diadaptasikan selama satu minggu dan menunjukkan perilaku normal serta berat badan naik atau tetap. Tikus-tikus yang akan diuji dibagi menjadi 7 kelompok yang masing-masing 29
terdiri dari tiga ekor tikus. Sebelum percobaan, tikus dipuasakan selama 20-24 jam dengan tetap diberi air minum. b. Pengujian efek antihiperglikemia Perlakuan yang diberikan pada tiap kelompok adalah sebagai berikut : 1. Kelompok I : merupakan kontrol positif yang diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan suspensi tragakan 2 %. 2. Kelompok II : merupakan pembanding yang diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan glibenklamid dengan dosis 0,45 mg/kg berat badan. 3. Kelompok III : merupakan kelompok uji diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan ekstrak metanol daging buah paria dengan dosis 250 mg/kg berat badan. 4. Kelompok IV : merupakan kelompok uji diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan fraksi heksan daging paria dengan dosis 250 mg/kg berat badan. 5. Kelompok V : merupakan kelompok uji diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan fraksi etil asetat daging paria dengan dosis 250 mg/kg berat badan. 30
6. Kelompok VI : merupakan kelompok uji diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan fraksi n-butanol daging paria dengan dosis 250 mg/kg berat badan. 7. Kelompok VII : merupakan kelompok uji diberi larutan glukosa dengan dosis 2 gram/kg berat badan dan fraksi metanol-air daging paria dengan dosis 250 mg/kg berat badan. Pada hari percobaan, semua tikus diberi ekstrak yang diujikan secara oral. Tiga puluh menit kemudian diambil cuplikan darah vena (sebagai kadar glukosa awal atau puasa) dengan cara memotong sedikit bagian ekor tikus dan diberi larutan glukosa dengan dosis 200 mg/kg berat badan. Kadar glukosa darah kembali diukur pada menit ke-30, 60, 90, dan 120 setelah pemberian glukosa. Untuk uji efek antihiperglikemia, seluruh data yang diperoleh dikonversi sebagai S.D (Standar Deviasi), kemudian data dianalisa secara statistik menggunakan ANAVA. dimana : S.D = ( X X) 2 n 1 X = X = data kadar glukosa darah tikus pada tiap interval menit pengukuran. rata-rata (mean) kadar glukosa darah tikus tiap interval menit pengukuran. n = jumlah tikus yang digunakan tiap kelompok. 31
3.3.4 Karakterisasi Senyawa dalam Fraksi Masing-masing fraksi di karakterisasi senyawa yang terdapat di dalamnya dengan beberapa cara, yaitu : a. Uji Fitokimia Tiap fraksi diidentifikasi komponen fitokimianya dengan metode pereaksi warna yang bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalam masing-masing fraksi. Uji fitokimia dilakukan terhadap golongan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, tanin, kuinon, dan antosianin. Prosedur kerja yang dilakukan ialah sebagai berikut : 1. Pemeriksaan Alkaloid Pemeriksaan alkaloid dilakukan dengan cara, masing-masing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 5 tetes kloroform dan beberapa tetes Pereaksi Mayer. Terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya alkaloid. Pembuatan Pereaksi Mayer yaitu satu gram KI dilarutkan dalam 20 ml aquades sampai semuanya melarut. Lalu ke dalam larutan KI tersebut dimasukkan 0,271 gram HgCl 2 sampai larut. 2. Pemeriksaan Flavonoid Pemeriksaan flavonoid dilakukan dengan cara, masing-masing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan 1 gram serbuk Mg dan 190 ml HCl pekat. Timbulnya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid. 32
3. Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid Pemeriksaan terpenoid dan steroid dilakukan dengan cara, masingmasing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan 1 ml CH 3 COOH glasial dan 1 ml H 2 SO 4 pekat. Timbulnya warna merah menunjukkan andanya terpenoid sedangkan warna biru atau ungu menunjukkan adanya steroid. 4. Pemeriksaan Tanin Pemeriksaan tanin dilakukan dengan cara, masing-masing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes FeCl 3 1%. Timbulnya warna biru tua menunjukkan adanya senyawa tanin (fenolik). 5. Pemeriksaan Kuinon Pemeriksaan kuinon dilakukan dengan cara, masing-masing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes NaOH 0,1 N. Timbulnya warna merah menunjukkan adanya senyawa kuinon. 6. Pemeriksaan Antosianin Pemeriksaan antosianin dilakukan dengan cara, masing-masing ekstrak sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes HCl 0,1 N. Timbulnya warna merah menunjukkan adanya senyawa antosianin. b. Pengujian dengan Spektrometri FT-IR (Fourier Transform-Infra Red) Pemeriksaan IR untuk mengetahui gugus-gugus fungsi yang terdapat dalam ekstrak metanol, heksan, etil asetat, n-butanol, dan metanol- air dari daging buah 33
M. charantia. Penentuan gugus-gugus fungsi dilakukan dengan menggunakan Spektrometri FT-IR (Fourier Transform-Infra Red) Shimadzu 8400. c. Analisis HPLC Analisis dengan HPLC ini dilakukan untuk melihat bagaimana pola pemisahan yang terjadi dari masing-masing fraksi yang didapatkan dengan menggunakan berbagai macam pelarut. Tahapan dari pengukuran dengan HPLC ialah sebagai berikut: 1. Fraksi sampel (metanol, heksan, etil asetat, n-butanol, dan metanol sisa) masing-masing ditimbang sebanyak 0,02 gram dan dilarutkan dengan menggunakan metanol sebanyak 5 ml. Sampel kemudian disaring dengan membran dan didegasing selama 5 menit agar sampel larut secara sempurna. 2. Alat HPLC dengan merk Hitachi, diset dahulu sesuai dengan keadaan yang diinginkan (proses pemisahan 10 menit, tekanan pompa 31,000 kgf/cm 2, kecepatan alir 0,500 ml/menit, dan panjang gelombang 254 nm) kemudian sampel diinjeksikan dengan menggunakan syringe ke alat HPLC. Dan setelah proses pemisahan selesai akan dihasilkan grafik yang menunjukkan senyawasenyawa yang mengalami pemisahan sesuai dengan waktu retensinya. 34