MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan selama sembilan bulan dari bulan April sampai dengan Desember 2011. Lokasi pemeliharaan pada penelitian ini bertempat di Laboratorium Lapang Ilmu Nutrisi Unggas Depertemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan IPB, Bogor. Analisa nilai hematologi dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Darmaga, Bogor. Materi Ternak Penelitian ini menggunakan 48 ekor ayam petelur strain Hy Line Brown umur 19 minggu yang dibagi dalam empat perlakuan dan tiga ulangan. Setiap ulangan terdiri dari 4 ekor ayam sebagai satuan percobaan. Ayam tersebut dipelihara selama 11 minggu. Gambar 8. Ayam Petelur Penelitian Kandang dan Perlengkapan Peralatan yang digunakan pada pemeliharaan ayam petelur adalah kandang individu. Setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan air minum. Peralatan lain yang digunakan adalah timbangan, plastik pakan, ember, thermometer, alat kebersihan kandang serta peralatan lain yang menunjang. Peralatan yang digunakan untuk sampling darah diantaranya adalah syringe 5 ml, tabung berheparin, box es batu, dan rak tabung reaksi. Analisa profil darah yang dilakukan adalah analisa eritrosit, hemoglobin, hematokrit, leukosit dan deferensiasi 15
leukosit. Peralatan yang digunakan untuk analisa profil darah berupa sahli, mikroskop, pipet butir darah merah dan putih, hemoglobiner, microcapillary hematocrit reader dan hemocytometer. Peralatan yang digunakan untuk analisa kandungan kolesterol pada serum adalah tabung reaksi beserta rak tabung, mikropipet, vortex, dan spektofotometer. Pakan Bahan pakan penyusun pakan adalah jagung, dedak padi, bungkil kedelai, tepung ikan, CPO, tepung daun dan bunga marigold, CaCO 3, premix, dan DL-Metionin. Air minum diberikan ad libitum. Tepung daun dan bunga marigold dianalisis untuk mengetahui kandungan nutriennya. Hasil analisis proksimat menunjukkan bahwa daun marigold mengandung bahan kering 16,16%, protein kasar 18%, serat kasar 8,67%, abu 8,29%, dan energi metabolis 1978 kkal. Untuk bunga marigold mengandung bahan kering sebesar 18,55%, protein kasar 10,17%, serat kasar 15,13%, abu 3,29%, dan energi metabolis 2348 kkal. Tabel 3. Komposisi Pakan Penelitian Bahan Pakan P0 P1 P2 P3 Jagung Kuning (%) 48,3 48 47,2 48 Dedak Padi (%) 12,2 8,2 7,75 7,83 Bungkil Kedele (%) 15 15 15,9 15 Tepung Ikan (%) 9,3 8,5 9 9 CPO (%) 5,5 5,6 5,5 5,5 NaCl (%) 0,1 0,1 0,1 0,1 CaCO 3 (%) 9 9 9 9 Premix (%) 0,5 0,5 0,5 0,5 DL- Methionin (%) 0,1 0,1 0,05 0,07 Tepung daun Marigold (%) - 5-2,5 Tepung bunga Marigold (%) - - 5 2,5 Keterangan : P0 = pakan kontrol, P1 = pakan mengandung 5% tepung daun marigold, P2 = pakan mengandung 5% tepung bunga marigold, P3 = pakan mengandung campuran 2,5% tepung daun dan 2,5% tepung bunga marigold. 16
Pakan disusun untuk memenuhi nutrien untuk ayam petelur berdasarkan rekomendasi dari Lesson dan Summer (2005) dengan kandungan energi metabolis 2900 kkal/kg dan protein kasar sebesar 18%. Komposisi pakan dan perhitungan komposisi nutrien pakan penelitian terdapat pada Tabel 3 dan Tabel 4. Pakan pada penelitian ini berbentuk mash. Tabel 4. Perhitungan Komposisi Nutrien Pakan Penelitian Nutrien Perlakuan P0 P1 P2 P3 Bahan Kering (%) 90,23 85,68 85,67 85,68 Energi Metabolis (kkal)/kg 2903,95 2902,95 2915,20 2910,92 Protein Kasar (%) 18,01 18,09 18,23 18,09 Lemak Kasar (%) 8,21 8,07 7,94 7,97 Serat Kasar (%) 3,21 2,72 2,67 2,68 Kalsium (%) 4,06 4,01 4,04 4,04 Pospor total (%) 0,58 0,52 0,53 0,53 Keterangan : P0 = pakan kontrol, P1 = pakan mengandung 5% tepung daun marigold, P2 = pakan mengandung 5% tepung bunga marigold, P3 = pakan mengandung campuran 2,5% tepung daun dan 2,5% tepung bunga marigold. Prosedur Pembuatan Tepung Daun dan Bunga Marigold Alur pembuatan tepung daun dan bunga Marigold disajikan pada Gambar 8. Bunga dan Daun Pelayuan (24 jam) dan Pengeringan dengan oven (65 C) Penggilingan Tepung daun dan Bunga Gambar 9. Alur Pembuatan Tepung Daun dan Bunga Marigold 17
Tepung yang sudah jadi kemudian dicampurkan ke dalam pakan perlakuan sesuai dengan formula yang telah dibuat. Pembuatan Pakan Pakan dibuat dengan mencampur bahan-bahan pakan yang digunakan secara manual. Pencampuran pakan dilakukan dengan mencampur bahan pakan berdasarkan kandungan gizinya yaitu, bahan pakan sumber energi, sumber protein dan sumber mineral. Tepung daun dan bunga marigold dicampurkan dengan bahan pakan sumber protein lainnya. Bahan pakan sumber protein dan sumber mineral yang sudah tercampur rata kemudian dicampur dan diaduk hingga tercampur rata. Campuran tersebut lalu dicampur dengan campuran bahan pakan sumber energi hingga tercampur rata. Tabel 5. Kandungan Nutrien Pakan Penelitian (Berdasarkan As Fed) Perlakuan Nutrien P0 P1 P2 P3 Bahan Kering (%) 88,11 88,05 85,19 85,25 Energi Metabolis (kkal/kg) 2478 2648,25 2529,75 2763,75 Protein Kasar (%) 14,64 13,81 14,89 14,12 Lemak Kasar (%) 4,62 5,71 4,92 6,17 Serat Kasar (%) 6,29 6,32 6,81 5,38 Abu (%) 12,12 11,86 11,36 10,86 Beta N (%) 50,44 50,35 48,21 51,72 Kalsium (%) 4,48 5,57 5,56 4,60 Pospor (%) 1,05 1,09 1,16 1,12 Fe (%)* 0,105 0,113 0,091 0,105 Keterangan :Hasil analisis laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fapet, IPB (2012); *Hasil analisis laboratorium Ilmu Nutrisi Ternak Perah (2012); P0 = pakan kontrol, P1 = pakan mengandung 5% tepung daun marigold, P2 = pakan mengandung 5% tepung bunga marigold, P3 = pakan mengandung campuran 2,5% tepung daun dan 2,5% tepung bunga marigold. Pakan yang sudah jadi kemudian dianalisis untuk mengetahui kandungan nutrien yang sebenarnya. Kandungan nutrien pakan penelitian terdapat pada Tabel 5. Kandungan pakan yang sebenarnya ternyata tidak sesuai dengan hasil perhitungan. Hal ini 18
dikarenakan kualitas bahan pakan yang rendah, sehingga kebutuhan ayam petelur disesuaikan dengan kebutuhan ayam petelur menurut SNI (2006). Pemeliharaan Tahap awal yang dilakukan adalah pembersihan kandang dan peralatan yang akan digunakan dengan desinfektan. Setelah itu dilakukan pengapuran pada dinding dan lantai kandang. Beberapa hari setelah kapur mengering, dilakukan pemasangan kandang yang telah dibersihkan terlebih dahulu, lalu dilakukan penyemprotan desinfektan ke seluruh ruangan kandang dan dibiarkan selama 1 minggu. Tahap selanjutnya adalah penaburan sekam di lantai bagian bawah kandang individu yang berfungsi sebagai litter. Pemeliharaan ayam dilakukan selama 11 minggu. Pakan diberikan sebanyak dua kali sehari, yaitu pagi dan sore. Pada minggu pertama pemeliharaan dilakukan adaptasi terhadap pakan perlakuan selama 7 hari. Pada hari pertama pemeliharaan, ayam masih diberikan pakan komersial yang berasal di peternak. Pada hari kedua dan ketiga, ayam diberikan pakan campuran dari pakan komersial dari peternak sebanyak 75% dan pakan perlakuan sebanyak 25%. Pada hari keempat dan kelima, ayam diberi pakan campuran dari 50% pakan komersial yang berasal dari peternak dan 50% pakan perlakuan. Pada hari keenam dan ketujuh, ayam diberi pakan campuran dari 25% pakan yang berasal dari peternak dan 75% dari pakan perlakuan. Pada hari kedelapan dan seterusnya, ayam diberi 100% pakan perlakuan. Pakan diberikan sebanyak dua kali sehari yaitu pagi dan sore. Air minum diberikan ad libitum. Sisa pakan ditimbang setiap tujuh hari sekali. Sampling darah Pengambilan darah dilakukan pada minggu ke 11 pemeliharaan (30 minggu umur ayam). Darah diambil dari vena jugularis sebanyak 5 ml dengan menggunakan syringe. Sampel darah dimasukkan dalam tabung berheparin. 19
Tahap Analisis Darah a. Analisa Profil Darah 1. Perhitungan Jumlah Eritrosit Pehitungan jumlah sel darah merah dilakukan dengan alat kamar hitungan sel darah merah menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100 kali. Prosedur pengerjaannya sebagai berikut: aspirator dipasang pada pipet sel darah merah. Darah yang telah dihisap sampai batas angka 0,5 pada pipet, ujung pipetnya dibersihkan menggunakan tisu. Dengan cepat dan hatihati larutan Hayem dihisap sampai tanda 101 yang tertera pada pipet.pada penghisapan ini hindari adanya gelembung, jika terdapat gelembung maka prosedur harus diulang. Aspirator dilepas dari pipet darah merah, dengan menggunakan ibu jari dan telunjuk kanan, isi pipet dikocok dengan pola gerakan angka 8 selama 3 menit. Bagian yang tidak ikut terkocok harus dibuang. Cairan dengan hati-hati dimasukkan ke dalam kamar hitung dengan cara menempelkan ujung pipet pada pertemuan antara dasar kamar hitung dan kaca penutup. Butir-butir darah dibiarkan mengendap selama kurang lebih satu menit. Perhitungan butir darah merah tersebut dilakukan menggunakan hand counter. Untuk menghitung sel darah merah dalam hemocytometer, digunakan kotak sel darah merah yang berjumlah 25 buah dengan mengambil bagian sebagai berikut: satu kotak pojok kanan atas, satu kotak pojok kiri, satu kotak tengah, satu kotak pojok kanan bawah, dan satu kotak kiri bawah. Untuk membedakan kotak sel darah merah dengan kotak sel darah putih, dapat berpatokan pada garis pemisah pada kotak sel darah merah dan luas kotak sel darah merah relatif lebih kecil dibandingkan dengan kotak leukosit. Butir darah merah yang telah dihitung tersebut disimbolkan dengan a dan untuk mengetahui jumlah sel darah merah dalam 1mm 3 darah dihitung dengan menggunakan rumus menurut Sastradipradja et al. (1989). a 10 4 20
2. Perhitungan Hematokrit Penentuan hematokrit dilakukan dengan mengisi tabung hematokrit dengan darah dan antikoagulan. Campuran darah kemudian disentrifikasi sampai sel-sel darah mengumpul di dasar. Pengisian pipa mikrokapiler dilakukan dengan memiringkan tabung yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa diisikan darah sampai mencapai 4 5 bagian kemudian ujung pipa disumbat dengan crestoseal, pipa mikrokapiler tersebut disentrifikasi selama 15 menit dengan kecepatan 2.500-4.000 rpm. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume sel darah merah menggunakan alat baca mikrohematokrit (microcapillary hematocrit reader) (Sastradipradja et al., 1989). 3. Perhitungan Kadar Hemoglobin (Hb) Metode yang digunakan untuk mengukur kadar hemoglobin dalam penelitian ini adalah metode Sahli. Larutan HCL 0,01 N diteteskan pada tabung Sahli sampai tanda tera 0,1 atau garis bawah, kemudian sampel darah dihisap menggunakan pipet hingga mencapai tanda tera atas. Sampel darah segera dimasukkan ke dalam tabung dan ditunngu selama 3 menit atau hingga berubah warna menjadi coklat kehitaman akibat reaksi antara HCL dengan hemoglobin membentuk asam hematin. Setelah itu, larutan ditambah dengan akuades, teteskan sedikit sambil terus diaduk. Larutan akuades ditambahkan hingga warna larutan sama dengan warna standar hemoglobinometer. Nilai hemoglobin dapat dilihat di kolom gram% yang tertera pada tabung hemoglobin, yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah (Sastradipradja et al., 1989). 4. Mean Corpusculas Volume (MCV) dan Mean Corpusculas Hemoglobin Concentration (MCHC) Menurut Sastradipradja et al. (1989) nilai MCV dan MCHC dihitung dengan menggunakan rumus berikut ini: 21
MCV (fl) adalah : Hematokrit X 10 Σ Eritrosit MCHC (%) adalah : Hemoglobin X 100 Σ Hematokrit 5. Perhitungan Leukosit Perhitungan jumlah leukosit dilakukan menggunakan pipet leukosit dengan bantuan aspirator hingga batas 0,5 lalu ujung pipet dibersihkan dengan tisu. Setelah itu, larutan modifikasi Rees & Ecker dihisap hingga tanda 11 pada pipet leukosit, kemudian dihomogenkan dengan gerakan tangan pola angka delapan.cairan yang tidak terkocok lalu dibuang. Setelah itu, sampel darah diteteskan dalam hemacytometer, dibiarkan beberapa saat hingga cairan mengendap lalu jumlah leukosit dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 kali. Untuk menghitung jumlah sel darah putih dalam hemacytometer, digunakan empat kotak yang terletak di empat sudut kamar hitung, masing-masing terdiri atas 16 buah kotak yang luasnya 1/16 mm 2. Jumlah leukosit yang terhitung disimbolakn dengan b dan untuk mengetahui jumlah leukosit dalam 1 mm 3 Sastradipradja et al. (1989) sebagai berikut: b 50 darah dihitung dengan rumus menurut 6. Differensiasi leukosit Darah dibuat preparat ulas ± 2 cm dari ujung gelas objek. Preparat ulas difiksasi dengan metanol 75% selama 5 menit kemudian diangkat sampai kering udara. Ulasan darah direndam dengan larutan giemsa selama 30 menit, diangkat dan dicuci dengan menggunakan air kran yang mengalir untuk menghilangkan zat warna yang berlebihan, kemudian dikeringkan dengan kertas isap. Preparat ulas diletakkan di bawah mikroskop pembesaran 1000 kali dan ditambahkan minyak imersi kemudian dihitung limfosit, heterofil, monosit, basofil, dan eosinofil secara jigjag dengan 22
pembesaran 1000 kali sampai jumlah total 100 butir leukosit (Sastradipradja et al., 1989). Rancangan dan Analisis Data Perlakuan Pakan pada penelitian ini dibuat dengan empat perlakuan yaitu: P0 : Pakan kontrol, tanpa tepung Marigold P1 : Pakan mengandung 5% tepung daun Marigold (TDM) P2 : Pakan mengandung 5% tepung bunga Marigold (TBM) P3 : Pakan mengandung 2,5% TDM dan 2,5% TBM Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat perlakuan dan tiga ulangan. Setiap ulangan terdiri dari 4 ekor ayam. Model Matematis Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + t i + e ij Keterangan : Y ij = nilai pengamatan untuk perlakuan pakan yang diberikan (R0, R1, R2, dan R3) ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum t i e ij = pengaruh perlakuan (R0, R1, R2, dan R3) ke-i = error perlakuan (R0, R1, R2, dan R3) ke-i dan ulangan ke-j Data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis dengan menggunakan ANOVA (Analysis of variance) dan jika analisis yang dihasilkan berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan menggunakan uji Duncan (Steel dan Torrie, 1993). Analisis Data Data hasil penelitian akan diolah dengan analisis statistik berupa uji ANOVA untuk melihat pengaruh perlakuan pakan terhadap profil darah ayam petelur. Jika 23
diketahui bahwa faktor perlakuan pakan memberikan pengaruh yang nyata terhadap peubah-peubah yang diamati, akan dilakukan uji lanjut Duncan. Peubah yang diamati Peubah yang akan diamati dalam penelitian ini adalah: 1. Konsumsi Pakan (gram/ekor/hari) Konsumsi pakan dihitung dari selisih dengan mengurangi pemberian pakan awal dengan sisa pakan setiap minggu dibagi 7 hari. 2. Konsumsi Protein (g/ekor/hari) Konsumsi protein diperoleh dengan mengalikan antara konsumsi ransum dengan kandungan protein kasar pada tiap ransum perlakuan. 3. Konsumsi Fe (g/ekor/hari) Konsumsi Fe ayam petelur diperoleh dengan mengalikan antarakonsumsi ransum dengan kandungan Fe tiap ransum perlakuan. 4. Jumlah Eritrosit (juta/mm 3 ) Pengukuran eritrosit ayam petelur dianalisis dengan menggunakan kamar hitung Neubauer (Sastradipradja et al., 1989). 5. Kadar Hemoglobin (g%) Nilai hemoglobin ayam petelur dianalisis menggunakan metode Sahli (Sastradipradja et al., 1989). 6. Persentase Hematokrit (%) Persentase hematokrit ditentukan dengan metode mikrohematokrit (Sastradipradja et al., 1989). 7. MCV dan MCHC Mean Corpuscular Volume (MCV) dan Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC) dihitung dengan menggunakan rumus menurut Sastradipradja et al. (1989) 8. Jumlah Leukosit (ribu/mm 3 ) Pengukuran leukosit ayam petelur dianalisa dengan menggunakan metode Neubauer. 9. Penentuan Deferensiasi Leukosit (%) 24