BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan metode penelitian eksperimental laboratorium posttest-only equivalent-group design dengan kelompok perlakuan dan kelompok kontrol yang telah dirandomisasi dan pengamatan yang dilakukan pada akhir penelitian. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian akan dilakukan di Laboratorium Farmasi Universitas Islam Indonesia. Penelitian ini dilakukan dari bulan Mei 2015 hingga Februari 2016. Pada bulan Mei 2015 hingga Juni 2015 dilakukan penyusunan proposal penelitian. Pemberian perlakuan pada hewan coba hingga analisis hasil penelitian dilakukan dari bulan Juli 2015 hingga Februari 2016. 3.3 Populasi dan Subyek Penelitian Subyek penelitian menggunakan mencit DDY sejumlah 60 ekor jantan dan betina berusia 8-10 minggu dengan berat 25-30 gram. Mencit yang digunakan sehat dan tidak cacat. Subyek penelitian dibagi kedalam lima kelompok perlakuan dan masing-masing kelompok terdiri dari enam ekor mencit jantan dan enam ekor mencit betina. 3.4 Variabel Penelitian Variabel penelitian terdiri dari variabel bebas dan variabel terikat. Variabel bebas dari penelitian ini adalah dosis ekstrak yang diberikan. Dosis yang akan diberikan pada kelompok perlakuan I sebanyak 50mg/kgBB, kelompok perlakuan II sebanyak 100mg/kgBB, kelompok perlakuan III sebanyak 200mg/kgBB, kelompok perlakuan IV sebanyak 400mg/kgBB, dan kelompok V yang merupakan kelompok kontrol akan diberikan aquades. Variabel terikat pada 16
penelitian ini adalah ada atau tidaknya perubahan pada gambaran histopatologi hepar pada hewan uji. 3.5 Definisi Operasional 3.5.1 Ekstrak etanol adalah sediaan yang dibuat dengan membacam bahan dengan pelarut etanol yang kemudian diuapkan hingga mencapai konsentrasi tertentu untuk mengekstraksi kandungan bahan aktifnya (Agoes, 2009) 3.5.2 Perubahan histopatologi hepar adalah perubahan histopatologi pada sel hepar yang dinilai menggunakan metode penilaian kerusakan sel hepar Manja Roenigk meliputi penilaian terhadap sel hepar normal, sel degenerasi keruh, sel degenerasi hidropik, dan sel nekrosis. Degenerasi keruh adalah perubahan sel hepar berupa gambaran sel yang membengkak dengan sitoplasma yang bergranula dan berwarna tidak homogen. Gambaran degenerasi hidropik berupa pembengkakan sel hepar dengan gambaran sitoplasma yang bervakuol dan berwarna tidak jernih. Gambaran nekrosis berupa sitoplasma yang eosinofilik (berwarna merah muda) yang homogen dengan inti sel nekrotik berwarna lebih gelap dengan ukuran yang lebih kecil dari inti sel normal. 3.6 Instrumen Penelitian Penelitian ini menggunakan beberapa instrumen penelitian, antara lain : 1. Kandang hewan coba 2. Sonde untuk mencit 3. Flakon tempat ekstrak 4. Miniset untuk pembedahan 5. Timbangan 6. Mikroskop 7. Daun sirih merah yang sudah diproses menjadi esktrak etanol. 8. Hewan coba mencit galur DDY (Deutch Democratic Yokohama) 17
Bahan untuk pembuatan preparat histopatologi : 1. Formalin buffer 10% (larutan formalin 10% dalam buffer Natrium asetat sampai mencapai ph 7,0) 2. Alkohol 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, absolute, xylol 3. Parafin cair (Histoplast) 4. Albumin dan Poly-L-Lysine 5. Bahan pengecatan Hematoksilin-Eosin (HE) 6. Canada balsam dan Entelan 3.7 Alur Penelitian 3.7.1 Pengambilan dan determinasi bahan uji sirih merah Bahan uji yang digunakan adalah daun sirih merah yang diambil dari daerah Sleman, Yogyakarta. Bahan uji yang telah diambil kemudian dilakukan proses ekstraksi. 3.7.2 Pembuatan ekstrak etanol daun sirih merah Pembuatan ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan oleh ahli dari Laboratorium Farmasi Universitas Islam Indonesia. 3.7.3 Persiapan hewan uji Persiapan hewan uji meliputi pemeliharaan hingga sesuai dengan usia, penyesuaian suhu, kelembaban, dan pemberian makanan. Usia hewan coba berupa mencit adalah sekitar 8-10 minggu dengan berat 25-50 gram, jenis kelamin jantan dan betina yang sehat dan tidak cacat. Kondisi kandang yang sesuai antara lain suhu 22 C ± 3 C, kelembapan 30-70%, dengan penerangan 12 jam terang dan 12 jam gelap. Makanan diberikan secara standar. Mencit dipelihara dalam 10 kandang, masing-masing kandang berisi 5 sampai 6 ekor mencit. Jumlah hewan uji sebanyak 50 ekor. Masing-masing kelompok perlakuan terdiri dari lima ekor mencit DDY jantan dan lima ekor mencit DDY betina. Sebelum penelitian dimulai, berat badan mencit ditimbang. Selama penelitian dilakukan, penimbangan berat badan dilakukan satu kali dalam 18
seminggu. Pengukuran berat badan juga termasuk menghitung apabila terjadi penurunan maupun kenaikan berat badan mencit selama penelitian berlangsung. Setelah penelitian selesai, berat badan ditimbang dan dilanjutkan dengan terminasi hewan uji dan pengamatan data secara histopatologi. 3.7.4 Pemaparan ekstrak etanol sirih merah pada hewan uji Dosis ekstrak etanol sirih merah diberikan sesuai dengan kelompok perlakuan. Volume ekstrak yang diberikan adalah 0,5 ml dengan frekuensi 1 kali sehari pada sore hari. Dosis pada kelompok perlakuan I adalah 50mg/kgBB, kelompok perlakuan II 100mg/kgBB, kelompok perlakuan III 200mg/kgBB, kelompok perlakuan IV 400mg/kgBB, dan kelompok kontrol diberikan aquades dengan volume yang sama. 3.7.5 Skema Penelitian Gambar 13. Skema penelitian 19
3.7.6 Pengambilan organ Setelah dilakukan perlakuan selama 90 hari, mencit diterminasi dengan pemberian anestesi menggunakan ketamin dilanjutkan dengan dislokasi servikal. Selanjutnya organ hepar diambil kemudian dilakukan pembuatan sediaan histopatologi melalui tahap fiksasi, dehidrasi, impregnansi, embedding, dan dilanjutkan dengan pewarnaan HE. 3.7.7 Pembuatan Sediaan Patologi Anatomi Prosedur pembuatan sediaan histopatologi dilakukan dalam beberapa tahap, antara lain : 1. Fiksasi Potongan jaringan difiksasi menggunakan larutan formalin buffer selama 18-24 jam. Proses fiksasi dilanjutkan dengan memasukkan jaringan ke dalam aquades selama 1 jam untuk menghilangkan larutan fiksasi. 2. Dehidrasi Dehidrasi merupakan tahapan yang dilakukan untuk mengeluarkan air dari jaringan sehingga lebih mudah terisi oleh parafin. Jaringan yang terisi parafin akan lebih mudah untuk dilakukan pemotongan. Proses dehidrasi dilakukan dengan memasukkan jaringan ke dalam alkohol dengan konsentrasi yang berbeda hingga berwarna lebih jernih dan transparan. Jaringan didiamkan dalam alkohol dari konsentrasi 70%, 80%, 90% masing-masing selama 1 hari. Kemudian dilanjutkan dengan alkohol 95% dan 100% masing-masing selama 2 hari dan diganti sebanyak 2 kali. Selanjutnya, jaringan didiamkan di dalam alkohol-xylol selama 1 jam kemudian selama 2 kali 2 jam dimasukkan dalam larutan xylol murni. 3. Impregnansi Tahap ini bertujuan mengganti xylol dalam jaringan dengan parafin. Jaringan yang sudah melalui proses dehidrasi kemudian didiamkan dalam larutan parafin cair selama 2 kali 2 jam. 4. Embedding Proses selanjutnya adalah membenamkan jaringan dalam parafin padat dengan titik lebur 56-58ºC. Diamkan hingga parafin berubah menjadi 20
padat. Jaringan yang sudah padat, dipotong setebal 4 μm dengan mikrotom. Potongan jaringan kemudian diletakkan di kaca objek yang sudah diolesi dengan albumin dan gliserin, kemudian keringkan di tempat terbuka. 5. Pewarnaan dengan HE Pewarnaan Hematoksilin-eosin digunakan untuk menganalisis jaringan. Hematoksilin akan memberi warna pada nukleus, sedangkan Eosin akan memberi warna pada sitoplasma sel. Pewarnaan HE dilakukan dengan memasukkan kaca objek yang telah berisi jaringan ke beberapa larutan sebagai berikut : Tabel 4. Proses pewarnaan Hematoksilin-eosin Larutan Xylol I Xylol II Alkohol 100% I Alkohol 100% II Alkohol 90% I Alkohol 90% II Alkohol 80% I Alkohol 80% II Alkohol 70% I Alkohol 70% II Hematoksilin Mayer Air kran mengalir Eosin Air kran mengalir Alkohol 70% I Alkohol 70% II Alkohol 80% I Alkohol 80% II Alkohol 90% I Alkohol 90% II Alkohol 100% I Alkohol 100% II Xylol I Xylol II Waktu/lamanya 3 menit 21
3.7.8 Pengambilan Data Pengamatan secara Patologi Anatomi organ hepar dari hewan coba dilakukan oleh penulis dengan bimbingan oleh seorang ahli patologi anatomi. Sediaan yang diamati adalah organ hepar yang diberikan pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE). Gambaran potongan organ hepar dari semua kelompok perlakuan selanjutnya dibandingkan dengan gambaran histopatologi pada kelompok kontrol. Preparat histopatologi dari semua kelompok perlakuan dilakukan pengamatan dan perhitungan jumlah sel yang mengalami nekrosis, vakuolisasi lemak, dan degenerasi hidropik. 3.8 Metode Analisis Data Pada penelitian ini dilakukan pengamatan dan penghitungan jumlah sel yang mengalami nekrosis, vakuolisasi lemak, dan degenerasi hidropik pada masing-masing mencit dari setiap kelompok perlakuan. Analisis data menggunakan metode ANOVA. Metode ANOVA digunakan pada penelitian yang bertujuan membandingkan kelompok perlakuan yang berjumlah lebih dari dua kelompok dengan variabel berupa variabel interval atau rasio (Kountur, 2004). Pada penelitian ini akan dibandingkan empat kelompok perlakuan dengan satu kelompok kontrol sehinga metode analisis statistik ANOVA dapat digunakan. 3.9 Etika Penelitian Penelitian ini telah diajukan ke komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Berdasarkan surat keterangan lolos kaji etik nomor 04/Ka.Kom.Et/70/KE/VIII/2015, penelitian ini telah mendapat persetujuan secara etik. 22