LAMPIRAN
Lampiran 1. Road-map Penelitian Persiapan Penelitian Persiapan wadah dan ikan uji (15-30 Agustus 2013) Bak ukuran 45x30x35cm sebanyak 4 buah dicuci, didesinfeksi, dan dikeringkan Diletakkan secara acak dan diberi label Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 15 ekor/bak. Adaptasi ikan selama 7 hari Pencampuran pakan dengan imunostimulan (H0/9 September 2013) Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg. Imunostimulan dicampurkan pada pakan, ditambahkan putih telur sebagai binder dan diaduk. Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Pengganasan Virus VNN (H21 dan H28) PBS, tabung reaksi dan mortar diautoklaf Organ diambil dari ikan yang terserang VNN, digerus dengan mortar dan ditambahkan PBS steril. Air gerusan disaring dengan menggunakan milipore (Thermo TM ) 0,45 µm, hasilnya diambil sebanyak 1ml dengan menggunakan Spuit. Disuntikan secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml. Ikan media dipelihara, diamati gejala yang timbul untuk mengetahui apakah virus VNN sudah menginfeksi ikan tersebut. Hematologi Hematokrit Total Leukosit Diferensial Leukosit Uji Fagositosis Pelaksanaan Penelitian Pemberian pakan yang dicampur imunostimulan Pakan diberikan selama 45 hari pemeliharaan Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB Uji Tantang Uji tantang pada hari ke-38 Penyuntikan virus VNN ke tubuh semua ikan uji secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml. Pengambilan Darah Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21 dan 45 Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10% Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak pada setiap bak, lalu disimpan di microtube 1,5ml Parameter pengamatan Kualitas Air Suhu ph DO Salinitas Analisis Data Deskriptif Penyusunan Laporan
64 Lampiran 2. Pembuatan Isolat VNN organ diambil dari ikan yang terserang VNN Ikan media disuntikan secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml Organ digerus dengan menggunakan mortar Air hasil saringan diambil sebanyak 1ml dengan menggunakan Spuit Hasil gerusan dimasukkan ke dalam microtube Ditambahkan PBS steril
65 Lampiran 3. Pencampuran imunostimulan jintan hitam pada pakan Pakan ditimbang sebanyak 1kg Dosis jintan hitam ditambahkan sesuai perlakuan Pakan diberi label sesuai dengan dosis imunostimulan pada perlakuan Putih telur ditambahkan sebagai binder Diaduk hingga merata lalu dikeringanginkan
66 Lampiran 4. Pengamatan Hematokrit Darah diambil dengan spuit 1ml Setelah komponen darah terpisah lalu diukur dengan penggaris Darah dihisap kedalam tabung hematokrit Tabung hematokrit disentrifuge selama 15 menit, kecepatan 3.500 rpm Tabung hematokrit ditutup dengan lilin Tabung hematokrit diberi label
67 Lampiran 5. Pengamatan Total Leukosit Sampel darah dihisap dengan pipet berskala sampai 0,5 dilanjutkan dengan menghisap larutan turk sampai skala 11 Bilik hitung/ haemocytometer tersebut diletakkan di bawah mikroskop Empat tetesan pertama dibuang Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam haemocytometer
68 Lampiran 6. Pengamatan Differensial Leukosit Kaca pemulas disentuhkan pada tetesan darah, digeser Ke kanan sehingga darah menyebar sepanjang kaca objek, selanjutnya dikeringkan. Amati dengan perbesaran 1000x Sediaan tersebut digenangi dengan methanol secukupnya selama 5-10 menit Preparat dikeringanginkan Genangi dengan giemsa selama 25 menit Dibilas dengan aquades
69 Lampiran 7. Pengamatan Uji Fagositosis Kultur V. alginolyticus dipanen ditambahkan PBS, dimatikan dengan 2% formalin selama 24 jam. Preparat difiksasi dengan etanol (95%) selama 5 menit, dikeringanginkan, lalu diwarnai dengan safranin (0,15%) selama 10 menit dan diamati dengan mikroskop perbesaran 1000x. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Sampel dari microplate well diambil sebanyak 5 l dan diletakkan pada objek glass, dibuat preparat ulas, dikeringanginkan Tabung hematokrit dipotong pada leukosit, lalu ditampung pada mikrotube (effendorf).. Leukosit dimasukkan dalam microplate well, kemudian ditambah dengan V. alginolyticus (kepadatan 10 7 sel/ml) dengan volume yang sama.