IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Skrining Fitokimia Hasil pengujian skrining fitokimia menunjukan bahwa ekstrak yang dioleskan pada hewan coba mengandung tannin, saponin, dan flavonoid (Tabel 1). Pada uji alkaloid sampel menunjukan hasil negatif terhadap ketiga pereaksi (Wagner, Mayer, dan Dragendorf). Hasil uji saponin menunjukan tinggi busa ± 1,5 cm. Adanya flavonoid ditunjukan dengan terbentuknya warna merah jingga setelah ditambahkan serbuk Mg, 1 ml HCl pekat dan 20 tetes amil alkohol lalu dikocok kuat. Pada uji steroid dan triterpenoid tidak terbentuk warna hijau sehingga ekstrak batang pisang tidak mengandung senyawa tersebut. Ekstrak mengandung senyawa tannin ditunjukan dengan terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan setelah ditambahkan 2 tetes pereaksi FeCl 3. Tabel 1. Hasil uji fitokimia ekstrak batang pisang Ambon Uji Hasil analisis ekstrak batang pisang Alkaloid - Saponin + + Flavonoid + Steroid - Tanin + Triterpenoid - Efek tannin sebagai astringensia yang banyak digunakan sebagai pengencang kulit dalam kosmetik atau estetika (Olivia et al., 2004). Saponin berkhasiat sebagai antiseptik dan pembersih sedangkan flavonoid memiliki kemampuan bereaksi dengan komponen seperti allergen, virus dan karsinogenik sehingga flavonoid dapat berfungsi sebagai anti alergi, antikanker dan antiinflamasi (Lewis et al., 1999). 23
4.2 Potensi antibakteri ekstrak batang pisang Ambon Berdasarkan hasil pengujian potensi antibakteri ekstrak batang pisang Ambon dosis C menggunakan metode cakram kertas didapatkan hasil bahwa ekstrak batang pisang Ambon memiliki potensi antibakteri terhadap Staphilycoccus aureus dan Pseudomonas aeuroginosa hal ini dibuktikan dengan tidak tumbuhnya bakteri disekitar cakram kertas. A B Gambar 3. Gambar A adalah hasil pengujian antibakteri Staphylococcus aeureus dari ekstrak batag pisang Ambon. Gambar B adalah pengujian pengujian antibakteri Pseudomonas aeuroginosa ekstrak batang pisang Ambon. Potensi antibakeri yang dimiliki ekstrak batang pisang Ambn dikarenakan terdapatnya kandungan saponin yang terdapat di ekstrak batang pisang Ambon. Saponin merupakan senyawa metabolit sekunder yang berfungsi sebagai antiseptik sehingga memiliki kemampuan antibakteri. 4.3 Penentuan Dosis Efektif Berdasarkan hasil penentuan dosis efektif dari ekstrak batang pohon pisang didapat bahwa dosis yang paling baik memberikan pengaruh terhadap kualitas/ percepatan persembuhan luka adalah sediaan dengan dosis C (Tabel 2). Dosis C inilah yang selanjutnya digunakan sebagai dosis uji untuk sediaan gel dan aktivitas persembuhan luka. 24
Tabel 2 Perbandingan patologi anatomi persembuhan luka kulit pada penentuan dosis efektif antara mencit kontrol, mencit perlakuan dengan ekstrak batang pisang Hari ke- Kontrol Negatif Dosis Ekstrak Batang Pisang A B C 1 luka masih terlihat lebar dan basah, serta keropeng masih sangat jelas terlihat. 3 Luka berwarna merah dan basah, ada gumpalan darah, luka masih terbuka dan tepi luka masih terpisah 5 Luka berwarna merah pucat dan mulai kering, tepi luka mulai kering, luka masih terbuka luka masih terlihat lebar dan basah, serta keropeng masih sangat jelas terlihat. Luka berwarna merah, basah, merah dan ada gumpalan darah, luka masih terbuka dan tepi luka masih terpisah Luka berwarna merah pucat dan kering, tepi luka mulai kering, luka masih terbuka luka masih terlihat lebar dan basah, serta keropeng masih sangat jelas terlihat. Luka berwarna merah dan agak basah, ada gumpalan darah, luka terbuka dan tepinya masih terpisah Luka berwarna merah pucat dan kering, tepi luka mulai kering, luka masih terbuka luka masih terlihat lebar dan basah, serta keropeng masih sangat jelas terlihat. Luka berwarna merah pucat dan mulai mengering, ada gumpalan darah, luka terbuka dan tepinya masih terpisah Luka berwarna merah pucat dan kering, tepi luka mulai kering, luka mulai tertutup 7 Luka berwarna merah pucat dan kering, tepi luka mulai kering, luka masih sedikit terbuka Luka kering dan pucat, tepi luka kering, luka masih sedikit terbuka, kulit tepi luka mulai mengeras Luka kering dan pucat, tepi luka kering, luka mulai menyempit, kulit tepi luka mulai mengeras Luka kering dan pucat, tepi luka kering, luka menutup, kulit tepi luka keras Dari tabel 2 di atas tampak bahwa gambaran patologi anatomi secara garis besar memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak batang pohon pisang dengan dosis C memberikan hasil persembuhan yang paling baik berdasarkan parameter makroskopik. Ekstrak batang pohon pisang memberikan hasil yang lebih baik dalam mengembalikan keutuhan kulit akibat luka sayatan dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi apaapa, hal ini menunjukkan bahwa proses persembuhan luka dipercepat dengan pemberian ekstrak batang pohon pisang terutama pada dosis C seperti disajikan pada Gambar 3. A B C a b c Gambar 4. Gambaran makroskopik dari luka kulit pada mencit (A), tampak warna luka merah pucat pada dosis C (a), B (b) dan A (c). Gambar (B) menunjukkan tampakan histopatologik dari luka 25
kulit pada mencit kontrol yang tidak diberi apa-apa dan terlihat keropeng masih cukup besar. Gambar (C) memperlihatkan luka secara kualitas lebih baik dan keropeng lebih kecil serta homogen. Gambar B & C diwarnai dengan HE, pembesaran 40 X. 4.4 Pembuatan Sediaan Gel. Ekstrak batang pohon pisang telah berhasil dibuat dalam sediaan gel dengan konsentrasi ektrak dalam gel sebesar dosis C (sesuai hasil uji penentuan dosis efektif di atas) dan sediaan inilah yang digunakan sebagai bahan uji. Bahan dan formula yang digunakan untuk pembuatan sediaan gel adalah poligel, trietanolamin, gliserin, propilenglikol dan ekstrak (Tabel 3). Gambar sediaan gel ditampilkan pada Gambar 4. Tabel 3 Formula Sediaan Gel No Bahan Konsentrasi (%) 1 Poligel 8 2 Ekstrak C 3 Gliserin 2 4 TEA 1,5 5 Propilen glikol 9 6 Aqua DM Ad 100 Keterangan : C = Dosis terpilih dari ekstrak batang pisang A B C Gambar 5. Sediaan gel placebo (A); sedian gel ekstrak batang pisang (B); sediaan obat komersial (C). 26
4.5 Pengujian Sediaan Gel. Hasil evaluasi awal sedian gel ekstrak batang pisang dengan dosis C pada suhu 15 0 C dan 27 0 C pada hari ke-1,3 dan 7 tidak terjadi pemisahan, kemudian pada suhu 37 o C juga menunjukan tidak terjadi pemisahan pada hari ke-1 dan ke-3 sedangkan pada hari ke-7 mulai terjadi pemisahan. Pada suhu 45 0 C pada hari ke-1 tidak menjukan pemisahan tetapi pada hari ke-3 dan 7 mulai menunjukan pemisahan ditandai dengan terdapat lapisan air, hal ini disebabkan karena suhu yang tinggi dan sediaan gel yang memang berbasis poligel larut air dan tidak tahan panas (Tabel 4) Tabel 4 Evaluasi Awal Sediaan Gel Ekstrak Batang Pisang Ambon Suhu (T 0 C) Pemisahan (Hari ke-) 1 3 7 15 - - - 27 - - - 37 - - + 45 - + + Keterangan : + = Terjadi Pemisahan - = Tidak terjadi pemisahan Evaluasi akhir sediaan gel pada suhu 15 dan 27 0 C minggu ke-1,2 dan 3 hingga minggu ke-8 tidak terjadi pemisahan, kemudian pada suhu 37 0 C minggu ke-1, dan 2 belum terlihat pemisahan dan baru pada minggu ke-3 hingga ke-8 menujukan tanda pemisahan, sedangkan pada suhu 45 0 C pada minggu ke-1, 2 dan 3 sudah menunjukan pemisahan hingga minggu ke-8 (Tabel 5 ) Tabel 5 Evaluasi Akhir Sediaan Gel Ekstrak batang Pisang Ambon Suhu Pemisahan (Minggu ke-) (T 0 C) 1 2 3 4 5 6 7 8 15 - - - - - - - - 27 - - - - - - - - 37 - - + + + + + + 45 + + + + + + + + Keterangan : + = Terjadi Pemisahan - = Tidak terjadi pemisahan 27
4.6 Pemeriksaan Homogenitas Pemeriksaan homogenitas awal melalui pengamatan organoleptis berupa ph, bau dan warna menujukan sediaan gel pada suhu 15 0 C, 27 0 C dan 37 0 C yang diamati pada hari ke-1,3 dan 7 menujukkan hasil yang sama yaitu ph 7,3, bau khas ekstrak, dan warna coklat (Tabel 6 ), sedangkan pada suhu 45 0 C pada hari ke-1 memiliki ph 7,3 hari ke-3 ph 7 dan hari ke-7 ph 6,8 dan bau khas, serta pada hari ke-1, dan 3 warna masih terlihat coklat dan mulai berubah menjadi coklat pada hari ke-7 karena mulai ditandai terjadinya pemisahan akibat faktor suhu yang tinggi (Tabel 7). Tabel 6 Pemeriksaan Homogenitas Awal suhu 15, 27, dan 37 0 C Homogenitas Hari 1 3 7 ph 7,3 7,3 7,3 Bau Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat Tabel 7 Pemeriksaan Homogenitas Awal Pada Suhu 45 0 C Homogenitas Hari Ke - 1 3 7 ph 7,3 7 6,8 Bau Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat A B C D Gambar 6. Sediaan gel ekstrak batang pisang untuk pemeriksaan homogenitas setelah penyimpanan minggu ke-3. Pada suhu 15 0 C (A); pada suhu 27 0 C (B); pada suhu 37 0 C (C) dan pada suhu 45 0 C (D). 28
Pemeriksaan homogenitas akhir melalui pengamatan organoleptis berupa ph, bau dan warna menunjukan sediaan gel pada suhu 15 0 C, 27 0 C dan 37 0 C yang diamati pada minggu ke-1, 2 menunjukan hasil yang sama yaitu ph 7,3, bau khas ekstrak, dan warna coklat (Tabel 8, 9 dan 10 ), pada suhu 37 0 C minggu ke-3 menujukan perbedaan yaitu ph 7 dan warna yang terbentuk coklat hal ini disebabkan pada penyimpanan minggu ke-3 sediaan ekstrak menujukan pemisahan (Gambar 6). Pada suhu 45 0 C minggu ke-1menunjukan hasil ph 6,8,bau khas dan warna coklat, pada minggu ke-2 dan 3 menunjukan hasil ph 6,7 dan bau khas, serta warna coklat (Tabel 11) Tabel 8 Pemeriksaan Homogenitas Akhir Sediaan Gel Ekstrak Batang Pisang Pada Suhu 15 0 C Homogenitas Minggu 1 2 3 4 5 6 7 8 ph 7,3 7,3 7,3 7,3 7,2 7,0 7,0 6,8 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Tabel 9 Pemeriksaan Homogenitas Akhir Sediaan Gel Ekstrak Batang Pisang Pada Suhu 27 0 C Minggu Homogenitas 1 2 3 4 5 6 7 8 ph 7,3 7,3 7,3 7,0 6,7 6,7 6,7 6,7 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Tabel 10 Pemeriksaan Homogenitas Akhir Sediaan Gel Ekstrak Batang Pisang Pada Suhu 37 0 C Minggu Homogenitas 1 2 3 4 5 6 7 8 ph 7,3 7,3 7,0 6,0 6,0 5,7 5,7 5,7 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat 29
Tabel 11 Pemeriksaan Homogenitas Akhir Sediaan Gel Ekstrak Batang Pisang Pada Suhu 45 0 C Minggu Homogenitas 1 2 3 4 5 6 7 8 ph 6,8 6,7 6,7 6,0 6,0 5,6 5,3 5,0 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat 4.7 Pengujian Viskositas Pengujian viskositas tidak dilakukan untuk suhu 45 0 C pada minggu ke-2 hingga minggu ke-8 karena sediaan gel tersebut sudah mulai mencair (rusak) akibat faktor suhu yang tinggi (Tabel 12 dan 13). Adanya penurunan sediaan gel ekstrak batang pisang diakibatkan karena suhu dan lamanya penyimpanan, sehingga menyebabkan menurunnya viskositas, selain itu jumlah air yang ditambahkan ke dalam campuran sediaan gel ekstrak batang pisang juga sangat mempengaruhi viskositas. Tabel 12 Pengukuran viskositas sediaan gel ekstrak batang pisang hari ke-3,5, dan 7 Waktu Uji ( Hari) Perlakuan (centi poise) 15 0 C 27 0 C 37 0 C 45 0 C 3 17890 16680 15580 8980 5 16870 15060 10900 7890 7 12780 10500 8650 6980 Tabel 13 Pengukuran viskositas sediaan gel ekstrak batang pisang minggu ke1 sampai ke-8. Waktu Uji Perlakuan (centi poise) (Minggu) 15 0 C 27 0 C 37 0 C 1 12780 10500 8650 2 10600 9600 7280 3 9680 8560 6830 4 8980 7890 4560 5 7590 6500 2460 6 6809 5790 1970 7 5790 4320 1008 8 4890 3200 980 30
4.8 Pengujian Iritasi Kulit Pada uji iritasi kulit untuk ke-11 responden rata-rata tidak mengalami reaksi eritema hingga minggu ke-5, dan mulai muncul reaksi eritema berupa gatal pada minggu ke-6 hal ini disebabkan sedian gel batang pisang sudah mengalami degradasi dengan munculnya jamur dan mulai terbentuknya cairan sehingga konsistensi dari gelnya pun mulai mencair dan ph nya juga cenderung ke asam. Pengujian untuk iritasi kulit hanya dilakukan untuk sediaan gel ekstrak batang pisang dengan penyimpanan pada suhu kamar hal ini disebabkan biasanya masyarakat kita menyimpan obat pada kotak obat yang mana suhunya adalah suhu kamar. Pengujian tidak dilakukan pada suhu 37 0 C dan suhu 45 0 C dikarenakan pada suhu tersebut sediaan gel sudah mengalamai degradasi dan terlihat sudah terjadi pemisahan sehingga konsistensinya menjadi lebih encer dan tidak layak untuk dicoba. (Tabel 14 ) Tabel 14 Hasil Pengujian iritasi pada kulit pada Minggu ke-1 sampai ke-8 Responden Minggu ke- 1 2 3 4 5 6 7 8 1 0 0 0 0 0 1 1 1 2 0 0 0 0 0 0 1 1 3 0 0 0 0 0 1 1 1 4 0 0 0 0 0 1 1 1 5 0 0 0 0 0 0 1 1 6 0 0 0 0 0 1 1 1 7 0 0 0 0 0 1 1 1 8 0 0 0 0 0 1 1 1 9 0 0 0 0 0 1 1 1 10 0 0 0 0 0 1 1 1 11 0 0 0 0 0 1 1 1 4.9 Hasil Pengamatan Patologi Anatomi Kecepatan terbentuknya keropeng di ketiga kelompok menandakan kecepatan dari persembuhan luka. Menurut Singer dan Clarks (1999) keropeng merupakan tahap awal dari fase proliferasi yang meliputi aktivitas mitosis dari sel-sel epidermis, sel-sel endotel dan sel-sel fibroblas. Fibroblas, sel-sel radang dan pembuluh darah baru memenuhi jaringan luka dan membentuk jaringan granulasi yang akan terlihat berwarna 31
merah dan bergranulasi. Pada fase ini mulai terjadi proses re-epitelisasi dimana sel-sel epitel mulai bermigrasi dan berproliferasi ke jaringan luka. Hasil pengamatan patologi anatomi terhadap proses persembuhan luka pada hewan coba mencit untuk kelompok perlakuan dengan gel placebo (kontrol negatif), kelompok perlakuan dengan gel komersial (kontrol positif), serta kelompok perlakuan dengan gel ekstrak batang pohon pisang Ambon disajikan dalam tabel 15. Tabel disajikan berdasarkan parameter tertentu, yaitu: adanya pembekuan darah, terbentuknya keropeng, penutupan luka, dan ukuran luka. Tabel 15 Perbandingan Patologi Anatomi antara kelompok kontrol negatif (gel placebo), kelompok kontrol positif (gel komersil) dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon. Hari ke- Kontrol negatif (Gel Placebo) 3 Luka terlihat terbuka lebar dan basah. Tepi masih terpisah, belum terjadi pembekuan darah serta masih tampak merah pada daerah luka. Kontrol positif (Gel Komersil) Luka terlihat terbuka lebar dan mulai mengering. Tepi masih terpisah, belum terjadi pembekuan darah serta masih tampak merah pada daerah luka. Gel ekstrak batang pisang ambon Luka terlihat terbuka lebar dan basah. Tepi masih terpisah, belum terjadi pembekuan darah serta masih tampak merah pada daerah luka. 5 Luka masih terlihat terbuka. Tepi masih terpisah. Luka sudah mulai mengering walau ada bagian yang masih basah. Luka masih terlihat terbuka. Tepi masih terpisah. Luka sudah mulai mengering. Ada pembekuan darah. Luka masih terlihat terbuka dan mengering namun agak lembab. Tepi masih terpisah. Luka berwarna kehitaman. 32
7 Luka masih terbuka dan belum terjadi pengecilan diameter, tetapi terlihat adanya keropeng. Luka sudah mengering. Luka masih terbuka tetapi terjadi pengecilan diameter. Terlihat adanya keropeng dan luka sudah mengering. Tepi luka mengeras. Luka masih terbuka tetapi terjadi pengecilan diameter. Terlihat adanya pengelupasan keropeng dan luka sudah mengering. Tepi luka mengeras. 14 Luka sudah mulai terlihat tertutup dan terjadi pengecilan diameter. Luka sudah mengering. Luka sudah tertutup. Bekas luka sudah tidak terlihat. Sudah terjadi proses persembuhan luka. Luka sudah tertutup. Bekas luka sudah tidak terlihat. Sudah terjadi proses persembuhan luka. 21 Luka sudah tertutup dan bekas luka sudah menghilang. Area bekas luka sudah tertutupi bulu. Luka sudah tertutup dan bekas luka sudah menghilang. Area bekas luka sudah tertutupi bulu secara merata. Luka sudah tertutup dan bekas luka sudah menghilang. Area bekas luka sudah tertutupi bulu secara merata. Hasil pengamatan patologi anatomi pada ketiga kelompok pada awal perlakuan masih terlihat sama, dimana luka masih terlihat terbuka, luka basah dan belum terjadinya penggumpalan darah serta luka masih terlihat merah (Tabel 15). Luka yang terbuka memperlihatkan hasil kulit yang tersayat oleh benda tajam dan akan kehilangan kekuatan retraksinya dengan membentuk celah. Luka yang berwarna merah 33
menunjukkan reaksi peradangan terhadap penyayatan pada kulit, reaksi ini berupa vasokonstriksi sesaat dari pembuluh darah yang diikuti oleh vasodilatasi dari pembuluh darah (Vegad 1995). Vasodilatasi dari pembuluh darah ini dikenal dengan hiperemi dengan penampakan yang berwarna merah pada daerah luka. Pembuluh darah baru yang mulai terbentuk di daerah luka sejak hari pertama perlukaan menyebabkan peningkatan asupan darah yang membawa benang-benang fibrin, dimana benang fibrin ini juga memberikan fasilitas pada sel-sel radang untuk bermigrasi. Darah yang menggumpal merupakan reaksi platelet yang teraktivasi dan protein fibrinogen yang banyak dikeluarkan pembuluh darah akibat rangkaian reaksi peradangan (Anonim 2003). Sampai pada hari ke-5 pada semua kelompok mengalami fase peradangan, dimana pada fase ini tubuh akan berusaha menghentikan peradangan setelah terjadinya luka dengan vasokonstriksi, pengerutan ujung pembuluh yang putus (retraksi) dan reaksi hemostasis. Hemostasis terjadi karena trombosit yang keluar dari pembuluh darah saling melekat dan bersama dengan benang fibrin terbentuk terjadinya pembekuan darah (Sjamsuhidajat dan de Jong,1997). Kandungan tannin dan flavonoid yang berfungsi sebagai anti peradangan di dalam sediaan gel ekstrak batang pohon pisang Ambon dan gel komersil dapat mempercepat terjadinya pembekuan darah. Kecepatan terbentuknya keropeng di ketiga kelompok menandakan kecepatan dari persembuhan luka. Menurut Singer dan Clarks (1999) keropeng merupakan tahap awal dari fase proliferasi yang meliputi aktivitas mitosis dari sel-sel epidermis, sel-sel endotel dan sel-sel fibroblas. Fibroblas, sel-sel radang dan pembuluh darah baru memenuhi jaringan luka dan membentuk jaringan granulasi yang akan terlihat berwarna merah dan bergranulasi. Pada fase ini mulai terjadi proses re-epitelisasi dimana sel-sel epitel mulai bermigrasi dan berproliferasi ke jaringan luka. Terbentuknya keropeng pada kelompok kontrol negatif berbeda dengan kelompok perlakuan kontrol positif (gel komersil) dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon. Pada kelompok kontrol negatif keropeng terbentuk pada hari ke-7 dimana pada kelompok perlakuan kontrol positif dan sediaan gel pisang Ambon, keropeng telah terbentuk dari hari ke-6. Pada kelompok perlakuan gel ekstrak pisang Ambon, pada hari ke-7 keropeng sudah terlihat ada yang terlepas (Tabel 15). 34
Pada hari ke-7 terlihat adanya perbedaan dari ketiga kelompok dimana pada kelompok gel komersil dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon sudah terjadi pengecilan diameter pada lebar luka serta luka yang telah mengering sedangkan pada kelompok kontrol negatif pengecilan diameter dapat terlihat jelas pada hari ke-14. Perbedaan juga terlihat pada pertumbuhan rambut di daerah luka, dimana pada kontrol negatif terjadi pada hari ke-16 sedangkan pada kelompok gel komersil dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon terjadi pada hari ke-14. Tumbuhnya rambut yang lebih cepat pada kelompok perlakuan gel komersil dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon menunjukkan proses regenerasi yang lebih cepat dibandingkan dengan kelompok kontrol (Tabel 15). Bekas luka yang sudah mulai menghilang pada kelompok kontrol negatif terjadi di hari ke-16 sedangkan pada kelompok gel komersil dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon sudah mulai menghilang pada hari ke-14. Bekas luka yang menghilang lebih cepat pada kelompok perlakuan gel komersil dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon dibandingkan kelompok kontrol negatif menunjukkan bahwa perlakuan dapat mempercepat hilangnya jaringan parut yang menurut estetikanya keberadaan jaringan parut pada permukaan kulit terlihat kurang baik. Pada hari ke-21 semua kelompok sudah tidak menunjukkan perbedaan dimana kulit kembali normal (Tabel 15). 4.10 Hasil Pengamatan Histopatologi Parameter yang diamati pada pemeriksaan histopatologi adalah jumlah sel-sel radang (limfosit, neutrofil, dan makrofag), jumlah neokapiler, persentase re-epitelisasi dengan preparat yang digunakan adalah preparat yang telah diwarnai dengan pewarnaan Hematoxylin-Eosin dan kepadatan jaringan ikat (fibroblas) dengan preparat yang digunakan adalah preparat yang telah diwarnai dengan pewarnaan MT. Hasil pengamatan mikroskopis terhadap proses persembuhan luka pada hewan coba mencit untuk kelompok perlakuan dengan gel placebo (kontrol negatif), kelompok perlakuan dengan gel komersial (kontrol positif), serta kelompok perlakuan dengan gel ekstrak batang pohon pisang Ambon disajikan dalam tabel 16. 35
Tabel 16 Perbandingan mikroskopis pasca perlukaan antara kelompok kontrol negatif (gel placebo), kelompok kontrol positif (gel komersil) dan kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon. Hari Kontrol negatif ke- (Gel Placebo) 3 Ada Infiltrasi sel radang dan belum terbentuk reepitelisasi. Kontrol positif (Gel Komersil) Ada Infiltrasi sel radang dan belum terbentuk re-epitelisasi. Gel ekstrak batang pisang ambon Ada Infiltrasi sel radang dan belum terbentuk re-epitelisasi. (Pewarnaan HE, 400X) 5 Ada Infiltrasi sel radang dan mulai terbentuk reepitelisasi (24.57%). (Pewarnaan HE, 400X) Ada Infiltrasi sel radang dan mulai terbentuk re-epitelisasi (24.57%). (Pewarnaan HE, 400X) Ada Infiltrasi sel radang dan mulai terbentuk re-epitelisasi (33.60%). (Pewarnaan HE, 400X) 7 Ada Infiltrasi sel radang dan terbentuk reepitelisasi (57.82%). (Pewarnaan HE, 400X) Ada Infiltrasi sel radang dan terbentuk re-epitelisasi (57.82%). (Pewarnaan HE, 400X) Ada Infiltrasi sel radang dan terbentuk re-epitelisasi (68.32%). (Pewarnaan HE, 400X) (Pewarnaan HE, 400X) (Pewarnaan HE, 400X) 36
14 Luka sudah menutup dan terbentuk re-epitelisasi sempurna (100%). Luka sudah menutup dan terbentuk re-epitelisasi sempurna (100%). Luka sudah menutup dan terbentuk re-epitelisasi sempurna (100%). (Pewarnaan HE, 100X) 21 Re-epitelisasi sudah sempurna (100%). (Pewarnaan HE, 100X) Re-epitelisasi sudah sempurna (100%). (Pewarnaan HE, 100X) Re-epitelisasi sudah sempurna (100%). (Pewarnaan HE, 100X) (Pewarnaan HE, 100X) (Pewarnaan HE, 100X) 4.10.1 Infiltrasi Sel Radang Proses peradangan mencakup sel-sel radang dari pembuluh darah menuju jaringan luka. Sel-sel yang menginfiltrasi daerah luka diantaranya adalah limfosit, neutrofil dan makrofag. 4.10.2 Limfosit Peran limfosit didalam proses persembuhan luka adalah melepaskan limfokin yang mempengaruhi populasi dari sel-sel radang lainnya dan beberapa limfokin yang dilepaskan limfosit mempengaruhi populasi dari sel-sel radang lainnya seperti sel makrofag (Singer, 1999). Jumlah sel limfosit yang lebih tinggi pada kelompok gel ekstrak juga ditunjukkan pada hari ke-5 dan hari ke-7 dibandingkan kelompok kontrol negatif, dimana pada hari ke-5 jumlah sel limfosit sebanyak 107.00 ± 11.31 lebih 37
tinggi dibandingkan jumlah kontrol negatif yaitu 103.00 ± 8.49 dikarenakan pada hari ke-5 merupakan puncak sel limfosit banyak mengeluarkan limfokin-limfokin untuk proses peradangan yang nantinya dibutuhkan oleh makrofag untuk membunuh partikel asing. (Tabel 17). Tabel 17 Perbandingan jumlah sel limfosit pada ketiga kelompok perlakuan. Hari Kelompok ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif Gel Ekstrak 3 82.50 ± 0.61 BCD 87.50 ± 7.78 B 85.50 ± 9.19 BC 5 103.00 ± 8.49 A 110.00 ± 4.24 A 107.00 ± 11.31 A 7 80.00 ± 4.24 BCD 83.00 ± 1.41 BCD 82.00 ± 5.66 BCD 14 74.00 ± 1.41 BCD 71.50 ± 3.54 CD 70.00 ± 2.83 D 21 28.00 ± 2.83 E 24.00 ± 1.41 E 19.50 ± 3.54 E Keterangan: Huruf (superskrip) yang berbeda pada baris yang sama menunjukan ada perbedaan yang nyata (P<0,05). Kandungan zat aktif dalam ekstrak batang pohon pisang Ambon berfungsi sebagai faktor kemotaktik yang menarik kehadiran sel-sel radang dari sirkulasi darah dan bermigrasi ke dalam jaringan (Priosoeryanto 2006). Faktor kemotaktik adalah suatu bahan aktif di dalam lokasi peradangan yang memiliki fungsi mendatangkan sel-sel radang dari sirkulasi darah. Dimana faktor ini juga membantu penyelenggaraan respon peradangan hingga terjadinya persembuhan. Faktor kemotaktik (mediator inflamasi) berperanan penting dalam proses peradangan akut dengan meningkatkan permeabilitas vaskular, vasodilatasi dan rasa nyeri (Lewis 1986). Tingginya jumlah sel limfosit pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon dan kelompok kontrol positif merupakan proses peradangan akut yang pada kelompok ini lebih cepat berlangsung sehingga sel limfosit sebagai salah satu sel peradangan juga lebih cepat menginfiltrasi daerah luka. 38
4.10.3 Neutrofil Sel neutrofil merupakan sel pertahanan pertama terhadap kontaminasi mikroba pada peradangan. Kehadiran sel neutrofil dipengaruhi oleh adanya produk-produk yang dilepaskan oleh bakteri dan sel-sel yang rusak atau mati. Sel neutrofil berfungsi untuk membunuh dan memfagosit partikel-partikel asing yang terdapat pada daerah luka dengan cara fagositosis (Low, et al. 2001). Hasil pengujian statistik menunjukkan bahwa pola rataan jumlah neutrofil pada ketiga kelompok perlakuan relatif sama, yaitu angka yang tinggi pada hari awal dan kemudian angka menurun pada hari-hari berikutnya. Data pada tabel 20 menunjukkan bahwa pada hari ke-3 kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon memiliki jumlah neutrofil sebanyak 237.50 ± 7.78 menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) dengan kelompok kontrol positif yaitu 220.50 ± 13.44 dan dengan kelompok kontrol negatif yaitu 219.00 ± 12.73. Perbedaan ini juga ditunjukkan pada tabel 5 bahwa di hari ke-5 ketiga kelompok menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05), dimana pada kelompok gel ekstrak batang pohon pisang Ambon memiliki jumlah sel neutrofil sebanyak 271.00 ± 4.24 dan pada kelompok kontrol positif sebanyak 311.50 ± 10.61 sedangkan pada kelompok kontrol negatif memiliki jumlah neutrofil sebanyak 232.00 ± 5.66, hal ini dikarenakan sel neutrofil merupakan pertahanan seluler pertama maka jumlah neutrofil pada hari awal perlukaan memiliki jumlah yang cukup tinggi (Vegad, 1995). Berdasarkan teori tersebut membuktikan bahwa pada kelompok perlakuan ekstrak batang pohon pisang Ambon dan kontrol positif, sel neutrofil lebih cepat melakukan proses fagositosis dan jaringan nekrotik. Semua kelompok mengalami penurunan jumlah sel neutrofil dari hari ke-7 sampai dengan hari ke-21, ini menunjukkan bahwa sel neutrofil melakukan tugasnya sebagai sel pertahanan hanya pada awal pasca perlukaan karena tugasnya akan digantikan oleh sel makrofag sebagai sel pertahanan seluler yang kedua. Menurut Guyton dan Hall (1997), keberadaan sel makrofag dan sel neutrofil saling berhubungan dalam proses persembuhan luka. Sel neutrofil merupakan pertahanan seluler pertama yang jumlahnya akan meningkat pada awal pasca perlukaan dimana sel neutrofil akan memakan (memfagositosis) benda-benda asing. Benda-benda 39
asing dan sisa sel mati (jaringan nekrotik) yang tidak terfagositosis oleh sel neutrofil akan diteruskan oleh sel makrofag sebagai sel pertahanan seluler kedua. Tabel 18 Perbandingan jumlah sel neutrofil pada ketiga kelompok perlakuan Hari Kelompok ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif Gel Ekstrak 3 219.00 ± 12.73 D 220.50 ± 13.44 CD 237.50 ± 7.78 C 5 232.00 ± 5.66 CD 311.50 ± 10.61 A 271.00 ± 4.24 B 7 143.00 ± 8.49 E 148.00 ± 4.24 E 144.50 ± 7.78 E 14 74.00 ± 9.90 F 73.00 ± 7.07 F 68.50 ± 6.36 F 21 36.00 ± 1.41 G 35.00 ± 1.41 G 33.00 ± 5.66 G Keterangan: Huruf (superskrip) yang berbeda pada baris yang sama menunjukan ada perbedaan yang nyata (P<0,05). 4.10.4 Makrofag Sel makrofag merupakan sel radang yang berfungsi untuk mengeliminasi partikel asing dan jaringan mati. Sel makrofag dan sel neutrofil bekerjasama dalam menyerang dan menghancurkan partikel asing menyerbu masuk ke dalam tubuh. Menurut Guyton dan Hall (1997) sel makrofag akan melakukan emigrasi setelah sel neutrofil datang di daerah luka,dan setelah sel neutrofil melakukan fagositosis. Sel-sel neutrofil yang mati pun akan turut difagosit oleh sel makrofag. Tabel 19 Perbandingan jumlah sel makrofag pada ketiga kelompok perlakuan. Hari Kelompok ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif Gel Ekstrak 3 130.50 ± 2.12 G 137.50 ± 2.12 FG 132.50 ± 2.12 G 5 181.00 ± 2.83 E 316.00 ± 16.97 B 329.00 ± 4.24 A 7 213.50 ± 6.36 D 260.50 ± 2.12 C 269.00 ± 2.83 C 14 149.00 ± 5.66 F 128.00 ± 2.83 G 130.00 ± 4.24 G 21 41.00 ± 5.66 H 38.50 ± 2.12 H 39.50 ± 2.12 H Keterangan: Huruf (superskrip) yang berbeda pada baris yang sama menunjukan ada perbedaan yang nyata (P<0,05). Jumlah sel makrofag pada ketiga kelompok menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0,05) di hari ke-3 (Tabel 19). Perbedaan yang nyata (P<0,05) terlihat pada 40
hari ke-5 pada semua kelompok dimana jumlah sel makrofag yang tinggi pada kelompok gel ekstrak yaitu 329.00 ± 4.24 berbeda nyata dengan kelompok kontrol positif dengan jumlah sel makrofag sebanyak 316.00 ± 16.97 sedangkan kelompok kontrol negatif memilki jumlah sel makrofag sebanyak 181.00 ± 2.83 (Tabel 19). Perbedaan yang nyata (P<0,05) juga masih tampak pada hari ke 7 dimana pada kelompok gel ekstrak memilki jumlah sel makrofag sebanyak 269.00 ± 2.83 sedangkan pada kelompok kontrol negatif sebanyak 213.50 ± 6.36, namun kelompok kontrol positif menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05) dengan kelompok gel ekstrak (Tabel 19). Hal ini menunjukkan bahwa pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon dan kelompok kontrol positif lebih cepat dalam melakukan pembersihan partikel asing dalam luka dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Percepatan dalam pembersihan luka oleh sel makrofag salah satunya karena kandungan zat aktif dalam ekstrak batang pohon pisang Ambon yaitu saponin sebagai antiseptik dan pembersih. 4.10.5 Re-epitelisasi Re-epitelisasi merupakan tahapan perbaikan luka yang meliputi mobilisasi, migrasi, mitosis dan diferensiasi sel epitel (Aschrof, et al. 1999). Tahapan-tahapan ini akan mengembalikan intregitas kulit yang hilang. Perbedaan yang mencolok antara kelompok perlakuan (kelompok yang diberi obat komersial dan gel ekstrak batang pisang Ambon) dengan kontrol terlihat pada hari ke-7, dimana rata-rata re-epitelisasi pada kedua kelompok perlakuan sudah mencapai kisaran 0,60 sedangkan pada kelompok kontrol masih 0,52. Hasil ini memperlihatkan bahwa gel ekstrak batang pisang mempunyai kemampuan yang relatif sama dengan obat komersial untuk meningkatkan re-epitelisasi epidermis, sehingga luka lebih cepat menutup. (Tabel 20) 41
Tabel 20 Nilai Rata-rata Persentase Re-epitelisasi Kelompok Hari Pengamatan 3 5 7 14 21 Kelompok I ( gel placebo ) 0 0,29 0,52 1,00 1,00 Kelompok II ( pemberian Obat komersial) Kelompok III ( pemberian gel ekstrak batang pisan Ambon ) 0 0,34 0,62 1,00 1,00 0 0,40 0,60 1,00 1,00 Persembuhan luka sangat dipengaruhi oleh re-epitelisasi, karena semakin cepat proses re-epitelisasi semakin cepat pula luka tertutup sehingga semakin cepat persembuhan luka. Kecepatan dari persembuhan luka dapat dipengaruhi dari zat-zat yang terdapat dalam obat yang diberikan, jika obat tersebut mempunyai kemampuan untuk meningkatkan persembuhan dengan cara merangsang lebih cepat pertumbuhan sel-sel baru pada kulit. a b c e f d I Gambar 10. Gambaran mikroskopik luka pada hari ke-7. Kelompok kontrol negatif (I), Kelompok Obat komersial (II), Kelompok gel batang pisang Ambon (III). Terlihat pada kelompok I re-epitelisasi epidermis belum terjadi sempurna, keropeng/fibrin masih terlihat (a). Pada kelompok II proses re-epitelisasi sudah terjadi (b) walaupun keropeng/fibrin (c) masih terlihat tetapi sudah mulai lepas dari luka, disertai fibrosis dengan kerapatan tinggi (d). Pada kelompok III re-epitelisasi sudah mulai sempurna (e), keropeng sudah lepas, luka menyempit, serta fibrosis dengan kerapatan tinggi (f). Pewarnaan H & E. Pembesaran 20 X. II III 42
4.10.6 Neokapilerisasi Neokapilerisasi merupakan pembuluh darah baru berupa tunas-tunas yang terbentuk dari pembuluh darah dan akan berkembang menjadi percabangan baru pada jaringan luka. Neokapilerisasi akan saling beranastomose dan membentuk suatu jaringan sirkulasi darah yang padat pada jaringan luka. Pembuluh darah memiliki peranan penting dalam perbaikan jaringan untuk memberikan asupan nutrisi bagi jaringan yang sedang beregenerasi. Pembuluh darah juga menghantarkan sel-sel radang yang dibentuk di dalam sumsum tulang untuk mendekati jaringan yang terluka hingga sel radang tersebut melakukan emigrasi (Spector dan Spector, 1988). Tabel 21 Perbandingan neokapilerisasi pada ketiga kelompok di daerah luka. Hari Kelompok ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif Gel Ekstrak 3 43.00 ± 8.49 DE 61.00 ± 4.24 CDE 73.50 ± 2.12 BCD 5 103.00 ± 1.41 AB 121.50 ± 9.19 AB 111.50 ± 2.12 AB 7 93.00 ± 42.43 ABC 110.00 ± 25.46 AB 107.50 ± 33.23 AB 14 64.00 ± 2.83 CDE 63.00 ± 1.41 CDE 63.50 ± 0.71 CDE 21 35.00 ± 4.24 E 33.00 ± 5.66 E 30.50 ± 4.95 E Keterangan: Huruf (superskrip) yang berbeda pada baris yang sama menunjukan ada perbedaan yang nyata (P< 0,05). Jumlah neokapiler di hari ke-3 pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon lebih banyak yaitu 73.50 ± 2.12 dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang memilki neokapiler sebanyak 61.00 ± 4.24 dan kelompok kontrol negatif yang memiliki neokapiler sebanyak 43.00 ± 8.49 ( Tabel 21). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian gel ekstrak batang pohon pisang Ambon dapat mempercepat pembentukan neokapiler di daerah luka. Jumlah yang tertinggi dari semua kelompok dapat terlihat pada hari ke-5 dimana pada hari ke-5 ini neokapiler memberikan nutrisi yang maksimal bagi jaringan yang tengah beregenerasi. Mulai hari ke-14 sampai dengan hari ke-21, ketiga kelompok mengalami penurunan jumlah neokapiler dimana hal ini menunjukkan bahwa reaksi peradangan mulai menghilang. Menurut Vegad (1995) penurunan jumlah neokapiler ini dikarenakan adanya penyesuaian dari kebutuhan nutrisi pada jaringan yang semakin berkurang sehingga akan menurunkan jumlah vaskular dan reaksi edema pun akan mulai menghilang. 43
4.10.7 Fibroblas (Jaringan Ikat) Fibroblas merupakan sel pada jaringan ikat yang berpengaruh dalam proses persembuhan luka. Fibroblas mampu membentuk matriks ekstraseluler yang menunjang regenerasi sel-sel pada daerah luka dan menunjang keberadaan pembuluh kapiler baru pada proses granulasi jaringan. Fibroblas akan mengalami beberapa perubahan fenotip dan menjadi myofibroblas yang berfungsi untuk retraksi luka (Kalangi 2004). Tabel 22 Perbandingan ketebalan jaringan ikat pada ketiga kelompok di daerah luka dengan pewarnaan MT dan pembesaran 400 X. Ha ri ke- Kontrol negatif (Gel Placebo) 3 Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka rendah. Jaringan ikat sedikit dan tidak kompak. Kontrol positif (Gel komersil) Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sedang. Kepadatan jaringan ikat sedikit dan tidak mengumpul. Gel ekstrak batang pisang ambon Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sedang. Kepadatan jaringan ikat sedikit dan tidak mengumpul. 7 Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka rapat. Jaringan ikat padat tetapi masih ada rongga. Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka rapat. Jaringan ikat padat tetapi masih ada rongga. Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka rapat. Jaringan ikat padat tetapi masih ada rongga. 44
14 Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka rapat. Jaringan ikat padat tetapi masih ada rongga. Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sangat rapat. Jaringan ikat padat dan kompak. Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sangat rapat. Jaringan ikat padat dan kompak. 21 Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sangat rapat. Jaringan ikat padat dan kompak Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sangat rapat. Jaringan ikat padat dan kompak Kepadatan serabut kolagen pada daerah luka sangat rapat. Jaringan ikat padat dan kompak Pada hari ke-3 kepadatan serabut kolagen pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon menunjukkan hasil yang berbeda dengan kelompok lainnya (Tabel 22). Peningkatan jumlah fibroblas ini terus berlangsung sampai dengan hari ke-21. Kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon menunjukkan hasil yang lebih banyak daripada kelompok gel komersil dan kelompok kontrol. Pada hari ke-14, kepadatan fibroblas pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon tidak berbeda dengan kelompok gel komersil yang sudah sempurna, namun keduanya berbeda dengan kelompok kontrol yang kepadatannya padat meski masih ada rongga (Tabel 22), hal ini menunjukkan bahwa proses re-epitelisasi lebih cepat pada kelompok ekstrak batang 45
pohon pisang Ambon yang mengindikasikan proses penutupan luka yang lebih cepat dibandingkan kelompok lainnya. Pada hari ke-21 semua kelompok mengalami kepadatan fibroblas yang sudah sempurna. Kepadatan jaringan ikat yang lebih padat pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon menunjukkan bahwa pengecilan besar luka lebih cepat terjadi pada kelompok ekstrak batang pohon pisang Ambon, ini dikarenakan semakin banyaknya jaringan ikat pada luka maka semakin besar daya kontraksi luka sehingga sisi luka akan tertarik dan menyebabkan besar luka menjadi mengecil. 46