BAB III METODE PENELITIAN

43 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini adalah penelitian observasional analitik dengan pendekatan secara cross sectional untuk mengetahui kadar MMP 9 dan TNF α pada ketuban pecah dini aterm dan ketuban pecah dini pretrem. B. Rancangan Penelitian Penelitian ini secara obervasional analitik dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah penelitian potong lintang (Cross Sectional study) dan pendekatan uji klinis pada penderita KPD preterm dan KPD aterm. Sampel 01 02 X(a) X (b) 03 04 Dilakukan uji statistik kadar serum MMP 9 dan TNF α dengan uji t

44 Keterangan: 01 : dilakukan Diagnosis 02 : dilakukan diagnosis 03 : Uji Klinis kadar serum MMP 9 dan TNF α 04 : Uji Klinis kadar serum MMP 9 dan TNF α X(a) X(b) : Ketuban Pecah dini aterm : Ketuban Pecah dini Pretrm C. Subjek Penelitian Subyek penelitian harus memenuhi kriteria yaitu pasien yang bersalin di RSU DR. Moewardi Surakarta dari bulan Juli sampai dengan Agustus 2012 yang bersedia menanda tangani lembar informed consent. Kelompok kasus adalah penderita ketuban pecah dini preterm dan ketuban pecah dini aterm yang sesuai dengan syarat penerimaan sampel ( kriteria inklusi dan eksklusi). D. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan mulai bulan Juli sampai bulan Agustus 2012 di bagian Obstetri dan Ginekologi RSUD Dr Moewardi Surakarta dan di Laboratorium Prodia Jakarta.

45 E. Besaran Sampel Menurut DeCherney (2007) insiden ketuban pecah dini terjadi sekitar 10,7%. Proporsi disini sebesar 10,7% atau P: 0,107 sehingga Q= 1-P atau 0,893 perhitungan sampel menggunakan rumus: maka besarnya sampel adalah : n= (1,96) 2 x 0,1x0,9 / (0,1) 2 = 34,5 dibulatkan menjadi 35. N : besaran sampel P : Presentase kejadian KPD Α : Tingkat kemaknaan yaitu α= 0,05 Ζ α= 1,96 D : tingkat presisi ( tingkat kesalahan penduga ) yaitu 0,1 E. Populasi Penelitian 1. Kriteria Inklusi a. Ibu hamil usia 20 35 tahun, yang bersalin di kamar bersalin RS Dr. Moewardi Surakarta dengan ketuban pecah dini preterm dan ketuban pecah dini aterm b. Tidak ada kelainan bayi c. Bersedia mengikuti penelitian dengan menendatangani lembar informed consent.

46 2. Kriteria Eksklusi a. Ibu hamil dengan penyakit kronis antara lain Diabetes Melitus, kelainan ginjal, kelainan jantung, hipertensi kronis, infeksi kronis dan dengan penyakit infeksi sistemis seperti pnemonia, tifoid, malaria, hepatitis dan lain sebagainya. b. Dengan gaya hidup merokok, pecandu alkohol dan pecandu narkoba c. Mendapatkan pengobatan antibiotika sebelumnya d. Inkompetensi serviks e. Riwayat trauma sebelum hamil f. Kehamillan kembar g. Kematian janin dalam rahim h. Janin dengan kelainan kongenital i. Adanya kelainan plasenta j. Adanya kelainan bentuk uterus. F. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Kadar serum MMP -9 dan TNF-α 2. Variabel terikat KPD kehamilan preterm dan KPD kehamilan aterm.

47 G. Definisi Operasional - KPD kehamilan preterem adalah keluarnya air ketuban sebelum terjadinya persalinan pada umur kehamilan 28 sampai dengan 36 minggu - KPD aterm adalah keluarnya air ketuban sebelum terjadinya persalinan pada umur kehamilan 37 mggu sampai dengan 42 minggu. - Kadar serum MMP 9 dan TNF α ditunjukkan dengan angka nominal pada pemeriksaan Enzym Linked Imunossorben Assay ( ELISA). H. Instrumentasi dan Pengambilan Sampel 1. Instumentasi Alat - Spuit disposibel - Tabung kaca - Kapas alkohol - Alat tulis kantor dan seperangkat komputer - Tabung rekasi dan spuit 5 ml - Kapas savlon dan kertas lakmus - spekulum cocor bebek Bahan - Reagen MMP- 9 assay Diluent RDI-34 - Reagen TNF-α Assay Diluent RDI- 41 -Alkohol Absolut 90 % - Kapas

48 2. Pengambilan sampel 1. Pasien yang memenuhi kriteria penerimaan sampel diberikan penjelasan mengenai prosedur yang akan dikerjakan, apabila setuju maka menandatangani persetujuan yang telah di sediakan. 2. Dilakukan pemeriksaan cairan ketuban baik dengan pengamatan secara langsung, pemeriksaan inspekulo atau dengan kertas nitrazin. 3. Dilakukan pengambilan darah vena cubiti sebanyak 10 ml selanjutnya 5 ml untuk pemeriksaan serum MMP 9 dan TNF α. Darah vena yang diambil adalah sebelum diberikan antibiotik. Tabung sampel darah diberikan label, nama dan register, kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 15 menit selanjutnya serum disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -20 C dan selanjutnya dikirim ke Jakarta menggunakan Ice pack dan dikerjakan di Laboraturium PRODIA Jakarta. Pemeriksaan kadar MMP 9 dan TNF α serum dilakukan dengan cara kuantitatif menggunakan metode ELISA. I. Pemeriksaan ELISA pada MMP-9 Setelah semua sampel penelitian reagen, standard kerja dan sampel sudah disiapkan, kemudian ditambahkan 100μL Assay Diluent RD1-34 pada tiap cekungan, kemudian ditambahkan 100 ul standar, kontrol atau sampel * ke tiap cekungan, diikubasi selama 2 jam pada suhu ruang dengan pengocok microplate orbit Horizontal (0.12 ) diatur pada 500 + 50 rpm, Setelah itu dilakukan Aspirasi dan pencucian sebanyak 4 kali, Pada tahap berikutnya penambahkan

49 200uL konjugate pada tiap cekungan dan dilanjutkan dengan Inkubasi 1 jam pada suhu ruangan dengan pengocok dan Aspirasi serta pencucian 4 kali. Tambahkan 200uL substrate solution pada tiap cekungan dan diinkubasi selama 30 menit dengan suhu ruangan pada benchtop. Pada tahap ini preparat harus dilindungi dari sinar. Selanjutnya ditambahkan 50uL substrate solution pada tiap cekungan dan dibaca pada 450 nm dalam 30 menit, dengan koreksi λ 540 atau 570 nm. Pemeriksaan ELISA pada TNF-α Bawa semua reagen dan sampel kedalam suhu kamar. Hal ini merekomendasikan bahwa semua sampel, standard dan control akan diuji dalam rangkap dua. 1. Siapkan reagen, standard kerja, control dan sampel seperti yang diinstruksikan. 2. Tambahkan 50µL pengencer assay RDI-41 untuk masing-masing cekungan 3. Tambahkan 50 µl standar pada control dan sampel untuk setiap cekungan. Campur dengan lembut menekan piring cekungan selama 1 menit. Tutup dengan strip perekat yang disediakan kemudian diinkubasikan selama 2 jam dalam suhu kamar. 4. Aspirasi masing-masing cairan pada cekungan degan baik dan masukkanlah kedalam botol manifold kemudia cuci dengan buffer cuci ( 400 µl). ulangi proses ini sebanyak 4 kali sehingga total lima kali pencucian. Bersihkan sisa

50 buffer cuci dengan cara membalikkan piring pemeriksaan dan keringkan dengan kertas penyerap yang bersih. 5. Tambahkan 100 µl TNF-α conjugated pada tiap cekungan. Tutup pdengan strip perekat yang baru. Di inkubasi dengan suhu kamar selama 2 jam. 6. Ulangi aspirasi/ cuci seperti pada langkah 5. 7. Tambahkan 100 µl solusi substrat untuk setiap cekungan, inkubasi lagi selama 30 menit pada suhu kamar, lindungi dari cahaya. 8. Tambahkan 100 µl stop solution untuk setiap tabung, dengan lembut tekan piring untuk memastikan pencampuran menyeluruh. 9. Periksa kepadatan optic masing-masing dengan baik dalam waktu 30 menit, dengan menggunakan lempeng pembaca dengan set dasar 450 nm. Jika koreksi panjang gelombang tersedia, set ke 450 nm atau 570 nm. Jika koreksi panjang gelombang tidak tersedia, mengurangi pembacaan pada 540 nm- 570 nm dari pembacaan pada 450 nm. Pengurangan akan mengkoreksi ketidaksempurnaan optic di piring. 10. Pembacaan dilakukan secara langsung pada 450 nm tanpa koreksi akan mendapatkan hasil yang lebih tinggi dan kurang akurat.

51 Gambar 3: Skema pemeriksaan TNF-α J. Analisis Data Data yang diperoleh dari kadar MMP-9 dan TNF-α pada ketuban pecah dini pretrm dan aterm dikumpulkan dan dibandingkan kemaknaanya secara statistik menggunakan uji t dengan menggunakan SPSS versi 17.00 for widows.