METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung dari bulan Januari 2011 s.d. Februari 2012. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Embriologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi dan UPT Hewan Laboratorium Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan Penelitian Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus albinus) betina sebanyak 32 ekor dan jantan sebanyak 4 ekor berumur 8-10 minggu. Metode Penelitian Prosedur kerja penelitian ini adalah sebagai berikut: a. Superovulasi b. Koleksi sel telur c. Koleksi embrio fertilisasi d. Aktivasi partenogenetik e. Kultur in vitro f. Evaluasi embrio Superovulasi Superovulasi dilakukan dengan menyuntikkan hormon Pregnant Mare s Serum Gonadotropin (PMSG, Folligon, Intervet, Netherlands) 5 IU secara intraperitoneal untuk menstimulasi folikulogenesis. Kemudian 46-48 jam setelahnya dilakukan penyuntikan hormon human Chorionic Gonadotropin (hcg, Chorulon, Intervet, Netherlands) 5 IU secara intraperitoneal untuk menginduksi ovulasi. Koleksi Sel Telur Koleksi sel telur dilaksanakan pada 14-18 jam setelah penyuntikan hcg (Otaegui et al. 1999). Koleksi sel telur dilakukan dengan cara menyayat ampula
tuba Falopii. Sel telur diletakkan dalam cawan petri dan dicuci sebanyak tiga kali dalam medium M2 (Hogan et al. 1994). Sel telur yang masih dikelilingi oleh selsel kumulus ditempatkan dalam kombinasi M2 dengan hyaluronidase 0,02% dan diinkubasi selama 5-10 menit hingga ikatan antara sel kumulus terlepas dan sel telur dapat dikoleksi. Sel telur yang telah terlepas dari Cumulus Oocyte Complexes (COC) dipindahkan ke dalam medium CZB tanpa glukosa kemudian diinkubasi dalam inkubator CO 2 5% dengan suhu 37 o C selama 10-20 menit. Kemudian sel telur yang ada dihitung jumlahnya dan diamati sel telur berkualitas baik dan kurang baik. Sel telur yang berkualitas baik (viable), ditunjukkan dengan keadaan sitoplasma bulat dengan granulasi yang homogen sedangkan sel telur berkualitas kurang baik ditunjukkan dengan keadaan sitoplasma yang fragmentasi atau degenerasi (Rumiyati 2001). Koleksi Embrio Fertilisasi Mencit betina yang telah dilakukan superovulasi digabungkan dengan mencit jantan dengan perbandingan 1:1. Identifikasi mencit betina yang telah melakukan perkawinan dengan mencit jantan dilakukan dengan memeriksa sumbat vagina (vaginal plug) 15-18 jam setelah penyuntikan hcg (Hine 2009). Koleksi embrio dilakukan pada hari kedua setelah penyuntikan hcg dengan mencacah tuba Falopii di dalam medium M2 menggunakan bantuan mikroskop stereo. Embrio yang telah membelah menjadi dua sel atau lebih dimasukkan ke dalam cawan petri dan dicuci sebanyak tiga kali dalam medium Chatot Ziomec Bavister (CZB) tanpa glukosa. Aktivasi Partenogenetik Aktivasi partenogenetik menggunakan kombinasi medium CZB tanpa Ca 2+ dan Mg 2+ dengan cytochalasin B (Sigma, C6762, St. Louis, MO, USA) 5 µg/ ml dan strontium chlorida (SrCl 2 ) (Sigma, 255521, St. Louis, MO, USA) 10 mm (Murti et al. 2009). Aktivasi dilakukan dengan tiga jenis perlakuan: 1) menggunakan medium aktivasi tanpa HDACi, 2) kombinasi medium aktivasi dengan TSA 5 nm, 3) kombinasi medium aktivasi dengan scriptaid 5 nm. Sel telur dipindahkan ke dalam medium tetes sebanyak 50 µl pada masing-masing
perlakuan tersebut kemudian diinkubasi selama 6 jam dalam inkubator CO 2 5% dengan suhu 37 o C. Kultur In Vitro Embrio yang telah teraktivasi dari masing-masing medium dipindah ke medium CZB tanpa glukosa untuk kontrol positif, kombinasi CZB tanpa glukosa dengan TSA untuk perlakuan pertama, dan kombinasi CZB tanpa glukosa dengan scriptaid untuk perlakuan kedua kemudian diinkubasi selama 4 jam (Kishigami et al. 2006) dalam inkubator CO 2 5% dengan suhu 37 o C. Setelah itu, embrio dikultur pada medium CZB tanpa glukosa dalam medium tetes sebanyak 50 µl yang disiapkan dalam cawan petri 35 mm (Falcon 3002) dan ditutupi dengan mineral oil (Sigma; M8410) (Haydar et al. 2001). Medium tetes tersebut diekuilibrasi dalam inkubator CO 2 5% dengan suhu 37 o C selama semalam sebelum dimasukkan embrio. Embrio dikultur hingga mencapai tahap 2-8 sel. Setelah 48 jam, embrio yang telah membelah tersebut dipindah ke dalam medium CZB glukosa dalam medium tetes sebanyak 50 µl yang disiapkan dalam cawan petri 35 mm (Falcon 3002) dan ditutupi dengan mineral oil (Sigma; M8410) hingga tahap blastosis. Embrio hasil fertilisasi normal dikultur pada medium CZB tanpa glukosa dalam medium tetes sebanyak 50 µl yang disiapkan dalam cawan petri 35 mm (Falcon 3002) dan ditutupi dengan mineral oil (Sigma; M8410) (Haydar et al. 2001). Embrio dikultur hingga mencapai tahap blastosis. Evaluasi Embrio Evaluasi embrio dilakukan di bawah mikroskop inverted. Evaluasi pertama yaitu mengamati pembentukan pronukleus pada 0 jam setelah aktivasi kemudian dicatat jumlah embrio yang tidak membentuk pronukleus, membentuk 1 pronukleus, 2 pronukleus, lebih dari 2 pronukleus, serta immadiately cleavage. Hal serupa dilakukan pula pada 4 jam setelah aktivasi. Selanjutnya, embrio yang telah dikultur selama 24 jam diamati perkembangannya hingga 48 jam berikutnya.
Rancangan Penelitian Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap. Penelitian ini terdiri atas kelompok fertilisasi in vivo (kontrol negatif), kelompok aktivasi partenogenetik tanpa HDACi (kontrol positif), dan kelompok aktivasi partenogenetik dengan HDACi (perlakuan). Kelompok kontrol negatif adalah embrio yang dihasilkan dari proses fertilisasi normal secara in vivo. Kelompok kontrol positif adalah embrio yang dihasilkan dari proses aktivasi secara in vitro menggunakan medium aktivasi tanpa disertai penambahan HDACi. Kelompok perlakuan adalah embrio yang dihasilkan dari proses aktivasi secara in vitro menggunakan medium aktivasi dengan disertai penambahan HDACi. Perlakuan pertama yaitu dengan penambahan TSA dan perlakuan kedua yaitu dengan penambahan scriptaid. Penelitian dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Respon yang diamati adalah viabilitas embrio sejak aktivasi hingga kultur. Viabilitas embrio meliputi kelangsungan hidup berdasarkan morfologis embrio dan keberhasilan perkembangan setiap tahapan embrio. Perkembangan tahapan embrio ini dinilai dari kemampuan embrio membentuk pronukleus setelah aktivasi. Perkembangan selanjutnya diamati setelah 24 dan 48 jam pada kontrol positif dan perlakuan sedangkan pada kontrol negatif dilakukan setelah 48 dan 72 jam. Perkembangan embrio yang diamati mulai dari tahap pembelahan (cleavage) (2 sel, 4 sel, dan 8 sel), morula, dan blastosis. Kelompok Kontrol negatif Kontrol positif Perlakuan Fertilisasi Aktivasi tanpa HDACi Aktivasi dengan TSA Aktivasi dengan scriptaid Gambar 5 Diagram kelompok penelitian
Superovulasi Isolasi tuba falopii Koleksi sel telur 6 jam dalam medium aktivasi (kontrol positif) 4 jam dalam CZB tanpa glukosa 6 jam dalam medium aktivasi + TSA (perlakuan 1) (perlakuan 4 jam dalam CZB tanpa glukosa + TSA 6 jam dalam medium aktivasi + scriptaid (perlakuan 2) 4 jam dalam CZB tanpa glukosa + scriptaid Kultur dalam CZB tanpa glukosa hingga 8 sel (24 jam) Kultur dalam CZB glukosa hingga blastosis (24 jam) Gambar 6 Diagram rancangan penelitian aktivasi embrio partenogenetik Gambar 7 Diagram rancangan penelitian embrio fertilisasi
Analisis Data Data pembentukan pronukleus dan perkembangan embrio disajikan dalam bentuk persentase dan dianalisis dengan sidik ragam (Anova). Perbedaan antar perlakuan diuji dengan uji perbandingan berganda Duncan (DMRT, Duncan Multiple Range Test). Perhitungan statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak SPSS ver. 16.0.