28 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas antioksidan pada ektrak etanol jamur tiram dan kulit rambutan yang ditunjukkan dengan nilai IC 50 serta untuk mengetahui kesinerigisan antara kedua kombinasi tersebut yang ditunjukkan dengan nilai CI. 4.1 Pengumpulan dan Determinasi Tanaman Jamur tiram diperoleh dari Pasar Gede Kota Surakarta, Jawa Tengah. Sedangkan buah rambutan diperoleh dari perkebunan milik pribadi yang berada di Klaten. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret dengan hasil menunjukkan bahwa sampel yang digunakan adalah Jamur Tiram (Pleurotus ostreatus) dan Rambutan (Nephelium lappaceum). Hasil determinasi bisa dilihat pada lampiran 1 dan 2. 4.2 Ekstraksi 1 kg jamur tiram segar yang sudah disortasi kemudian dicuci hingga bersih kemudian jamur dipotong kecil- kecil agar lebih menyari kandungan yang ada di dalam jamur ketika direndam oleh pelarutnya. Pada rambutan, sebanyak 2 kg Rambutan matang yang sudah disortasi dari buah yag busuk atau yang jelek kemudian dipisahkan antara kulit dan daging buahnya, lalu masing-masing kulit dipotong kecil-kecil. Lalu dicuci bersih dan ditimbang sebanyak 500 gram. Pada kedua bahan tidak dilakukan penyerbukan melainkan menggunakan buah yang segar. 28
29 Ekstraksi kedua bahan dilakukan dengan cara maserasi. Maserasi adalah proses perendaman sampel untuk menarik komponen yang kita inginkan, dengan kondisi dingin. Keuntungan dari maserasi ini adalah lebih praktis, pelarut yang digunakan lebih sedikit jika dibandingkan bila menggunakan metode perkolasi dan tidak memerlukan pemanasan, sedangkan kekurangannya adalah waktu yang dibutuhkan lebih lama. Filtrat yang diperoleh dari proes tersebut kemudian diuapkan dengan penangas air hingga didapatkan ekstrak kental (Kristanti,2008). Prinsip maserasi adalah penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari yang sesuai selama 3 hari pada temperatur kamar, terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya lebih tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang hingga terjadi keseimbangan antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratya dipekatkan. Maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Proses maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. Alasan pemiihan penggunaan pelarut tersebut adalah dikarenakan senyawa flavonoid mudah tersari pada pelarut etanol 70% karena kesamaan polaritasnya. Sebagian besar pelarut murni (aseton, air dan etanol) memiliki kekuatan eksraksi lemah,
30 dibandingkan dengan pencampuran pelarut non polar dan air yang kemungkinan dapat meningkatkan indeks polaritas pelarut dan lebih meningkatkan daya ekstraksi pelarut tertentu. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian (Rini,2012) dimana peneliti menyimpulkan bahwa peningkatan polaritas untuk pelarut ke tingkat tertentu (hingga 50% air) akan memberikan kontribusi kelarutan senyawa antioksidan dalam pelarut. Adapula proses maserasi dilakukan selama 3 hari dengan menggunakan etanol 70% masing-masing sebanyak 1,5 L sambil sesekali diaduk untuk meratakan pelarut yang tidak merendam simplisia. Setelah tiga hari filtrat etanol ditampung, selanjutnya ampas jamur tiram dan kulit rambutan. Hasil maserasi dari Jamur Tiram di dapatkan warna kuning bening sedangkan pada kulit rambutan didapatkan cairan berwarna coklat pekat. Cairan berwarna(filtrat) tersebut kemudian diuapkan sebagian menggunakan wajan dan sebagiannya lagi diatas waterbath hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak etanol jamur tiram didapat sebanyak 30 gram dengan rendemen 3%(b/b), karakteristik dari ekstrak jamur tiram (Pleurotus ostreatus) adalah berbentuk semisolid berupa ekstrak kental, lengket,berwarna cokelat pekat, berbau khas jamur sedangkan ekstrak kulit rambutan menghasilkan ekstrak kental sebanyak 47,07 gram dengan rendemen 9,41%(b/b). Karakteristik dari ekstrak kulit rambutan(nepheleum lappaceum) adalah berbentuk semisolid berupa ekstrak kental berwarna coklat muda, lengket dan berbau etanol. Untuk proses dan hasil ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 3 dan 4.
31 4.3 Identifikasi Kandungan Kimia Hasil uji identifikasi kandungan kimia yang dilakukan pada ekstrak etanol Kulit rambutan positif mengandung antrakuinon, alkaloid, terpenoid dan flavonoid. Dalam pengidentifikasian sebelumnya juga telah dilakukan identifikasi kandungan kimia pada golongan steroid, terpenoid, alkaloid, fenolik, saponin dan flavonoid ekstrak metanol kulit rambutan positif mengandung flavonoid, terpen dan fenolik (Rusliati, 2011). Sedangkan pada ekstrak jamur tiram diketahui positif mengandung terpenoid, flavonoid dan saponin. Pada penelitian sebelumnya ekstrak metanol jamur tiram tidak ditemukan flavonoid sedangkan pada penelitian kali ini diketahui bahwa ekstrak etanol jamur tiram mengandung flavonoid. Kandungan senyawa yang terdapat pada penelitian sebelumnya positif mengandung alkaloid, terpenoid dan saponin(ekstrak metanol jamur tiram) (Rini,2012). Hasil bisa dilihat pada Tabel II dan III.
32 Tabel II. Hasil identifikasi kandungan kimia pada ekstrak kulit rambutan No Senyawa Teori Hasil uji Kesimpulan Gambar 1 Flavonoid Orange kuning atau kuning kehijauan orange kekuni ngan (+) 2 Saponin Biru violet, hijau fluresensi Coklat kemera han (-) 3 Tanin Ungu Coklat keme (-) rahan 4 Antrakuin on Merah Merah (+)
33 5 Alkaloid Orange kecok latan Orange kecok latan (+) 6 Terpen Coklat kemera han Coklat kemerah an (+) N o Tabel III. Hasil identifikasi kandungan kimia ekstrak jamur tiram Senyawa Teori Hasil uji Kesim Gambar pulan 1 Flavo Orange orange (+) noid kuning kekuningan atau kuning kehijauan 2 Sapo Biru Hijau (+) nin violet, hijau fluoresensi fluoresen si
34 3 Tanin Ungu Coklat kemerahan (-) 4 Antrakui non Merah Kuning kecoklatan (-) 5 Alkaloid Orange kecok latan Kuning kehijauan (-) 6 Terpen Coklat kemera han Coklat kemerahan (+) Pada uji kualitatif untuk mengetahui aktivitas antioksidan kedua ekstrak, dilakukan dengan cara ekstrak ditotolkan pada plat silika gel GF254 kemudian dielusi menggunakan campuran pelarut n-butanol, asam asetat dan aquadest
35 dengan perbandingan pelarut 14: 1: 5. Setelah elusi selesai, lempeng dikeringkan dan disemprot dengan larutan 0,004% DPPH dalam etanol. Uji positif yang bersifat anti radikal bebas menghasilkan bercak kuning dengan latar belakang ungu dalam waktu 20 menit. Uji aktivitas antioksidan secara kualitatif juga dilakukan pada vitamin C yang digunakan sebagai standar antioksidan. 4.4 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak 4.4.1 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Tunggal Dalam pengujian aktivitas antioksidan masing-masing ekstrak digunakan dengan spektrofotometer UV-Vis. Alasan menggunakan metode DPPH karena memiliki beberapa keunggulan diantaranya sederhana, cepat, sensitif dan hanya membutuhkan sedikit sampel (Aji,2009). Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH menunjukkan serapan maksimum larutan terletak pada panjang gelombang 516 nm dengan nilai serapan 0,89619 (Lampiran 5) dan dilanjutkan dengan pengukuran operating time pada larutan DPPH untuk mengetahui pada waktu berapa menit DPPH itu akan bereaksi dengan sampel yang diketahui dari selisih nilai absorbansi yang terkecil atau sudah mendekati konstan tidak berubah lagi. Didapat hasil operating time pada larutan DPPH 0,004% yaitu selama 30 menit. Oleh karena itu selama proses penembakan sinar UV harus diberi jeda selama 30 menit terlebih dahulu agar penyerapan DPPH lebih maksimal (Lampiran 6). Untuk semua pengukuran dengan metode peredaman radikal DPPH dilakukan pada panjang gelombang dan operating time tersebut.
36 Dari nilai absorbansi yang diperoleh, nilai % inhibisi menurut (Shian et al., 2012) dapat dihitung dengan menggunakan rumus : % Inhibisi Sehingga diperoleh nilai rata-rata % inhibisi yang dapat dilihat pada tabel IV. Dan rata-rata % inhibisi untuk vitamin C dapat dilihat pada tabel V. Tabel IV. Hasil rata-rata % inhibisi masing-masing ekstrak Konsentrasi (ppm) Rata-rata % inhibisi ekstrak Rata-rata % inhibisi jamur tiram ekstrak kulit rambutan 10 37,39% 42,12% 50 44,54% 47,67% 100 57,67% 53,33% 250 71,05% 66,29% 500 96,44% 89,10% Tabel V. Hasil rata-rata % inhibisi vitamin C % Inhibisi Vitamin C Konsentrasi Rata-rata % inhibisi 2 26,26 4 43,91 6 67,11 8 80,95 10 90,54 Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol jamur tiram dan kulit rambutan mempunyai kemampuan sebagai penangkal radikal bebas DPPH. Dalam penelitian ini baik ekstrak etanol jamur tiram dan kulit rambutan dengan konsentrasi 500 ppm memiliki aktivitas antioksidan yang paling tinggi dibandingkan dengan konsentrasi dibawahnya. Begitu juga pada hasil % inhibisi vitamin C nilai tertinggi dimiliki konsentrasi terbesar yaitu 10 ppm. Nilai aktivitas
37 antioksidan bisa disebut juga dengan % inhibisi, jika % inhibisi semakin tinggi maka semakin tinggi pula aktivitas antioksidannya. Grafik % inhibisi ekstrak jamur dan vitamin C dapat dilihat pada Gambar 10 dan Gambar 11. Gambar 11. Grafik % inhibisi ekstrak jamur tiram dan kulit rambutan Gambar 12. Grafik % inhibisi vitamin C Persamaan yang didapat pada grafik tungal ini akan digunakan untuk mencari nilai CI pada kombinasi kedua ekstrak dan untuk mengetahui kesinergisan kedua ekstrak.
38 Pada perhitungan nilai IC 50 masing-masing ekstrak dilakukan dengan menggunakan uji Probit yang terdapat pada aplikasi SPSS. Pada ekstrak jamur didapat nilai IC 50 sebesar 36 µg/ml (Lampiran 7) sedangkan nilai IC 50 rambutan sebesar 32 µg/ml (Lampiran 8). Sementara pada pembanding yaitu vitamin C didapat nilai IC 50 sebesar 3,83 µg/ml (Lampiran 9). Pada kedua ekstrak jika dilihat pada hasil IC 50 nya tergolong antioksidan sangat kuat dengan range antara < 50 µg/ml tetapi dengan nilai IC 50 dari vitamin C yang sangat tinggi maka dapat diketahui bahwa aktivitas antioksidan dari nilai vitamin C masih yang terbaik. Tujuan digunakannya analisis Probit untuk menganalisis hubungan antara satu variabel respon dan variabel bebas, di mana variabel responnya bernilai 1 untuk menyatakan keberadaan suatu karakteristik dan bernilai 0 untuk menyatakan ketidakberadaan suatu karakteristik. Pada analisis Probit, % inhibisi sebagai response frequency, total observed adalah nilai % total DPPH yaitu 100, factor adalah replikasi dan konsentrasi sebagai covariate(s)pada Transform digunakan Natural log. Pada output hasil dari analisis probit, diperoleh nilai signifikansi pada parameter estimate 0,081<0,005 sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa H 0 (tidak ada hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat ditolak maka H 1 (adanya hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat diterima. Pada confidence limit probability 0,500 vitamin C didapatkan nilai pada replikasi1 3,823 ppm pada replikasi ke 2 nilainya adalah 3,829 dan pada replikasi ke 3 didapatkan nilai sebesar 3,828 ppm. Dan didapatkan rata-rata nya adalah 3,83 ppm.
39 Pada hasil output dari analisis Probit ekstrak jamur tiram, diperoleh nilai signifikansi pada parameter estimate 0,000<0,005 sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa H 0 (tidak ada hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat ditolak maka H 1 (adanya hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat diterima. Pada confidence limit probability 0,500 jamur tiram didapatkan nilai pada replikasi 1 36,2 ppm pada replikasi ke 2 nilainya adalah 35,83 dan pada replikasi ke 3 didapatkan nilai sebesar 36,12 ppm dan didapatkan rata-rata nya adalah 36 ppm. Pada hasil output dari analisis probit ekstrak kulit rambutan, diperoleh nilai signifikansi pada parameter estimate 0,000<0,005 sehingga dapat ditarik kesimpulan bahwa H 0 (tidak ada hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat ditolak maka H 1 (adanya hubungan antara konsentrasi vs % inhibisi) dapat diterima. Pada confidence limit probability 0,500 jamur tiram didapatkan nilai pada replikasi 1 31,76 ppm pada replikasi ke 2 nilainya adalah 31,42 ppm dan pada replikasi ke 3 didapatkan nilai sebesar 31,772 ppm dan didapatkan rata-rata nya adalah 32 ppm. Dari hasil IC 50 itu kemudian kita membuat larutan tunggal ½ IC 50 dan ¼ IC 50 untuk masing-masing ekstrak kemudian diuji dengan spektrofotometer UV- Vis, didapatkan hasil absorbansinya (Lampiran 11). 4.4.2. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kombinasi Dari percobaan yang telah dilakukan terhadap masing-masing kombinasi ekstrak yang telah ditentukan, didapatkan hasil sebagai berikut (Tabel VI) :
40 Tabel VI. Hasil % inhibisi kombinasi ekstrak % Inhibisi Kombinasi Jamur 9 ppm Jamur 18 ppm kulit rambutan 8 ppm 47,77 47,77 47,78 51,84 51,94 51,97 kulit rambutan 16 ppm 53,52 53,52 53,75 59,1 59,3 59,33 Dari tabel diatas didapatkan hasil % aktivitas antioksidan kombinasi ekstrak yang semakin tinggi konsentrasi kedua kombinasi ekstrak tersebut maka akan semakin tinggi pula nilai % aktivitas antioksidannya. Dimulai dari kombinasi ekstrak 9 ppm jamur : kulit rambutan 8 ppm dengan nilai rata-rata % aktivitas antioksidannya yang sebesar 47,78% sampai dengan perbandingan konsentrasi ekstrak 18 ppm jamur : kulit rambutan 16 ppm dengan nilai rata-rata % aktivitas antioksidannya yang sebesar 57,24%. Tabel VII. Hasil pada aplikasi tunggal untuk ekstrak jamur tiram dan kulit rambutan Persamaan Ekstrak Tunggal Perbandingan Kombinasi % Inhibisi (y) Nilai x Jamur tiram ¼ IC 50 : ¼ IC 50 47,78 367,691 y = 0,119x + 38,07 ½ IC 50 : ¼ IC 50 53,60 373,516 ¼ IC 50 : ½ IC 50 51,92 371,832 ½ IC 50 : ½ IC 50 59,24 379,157 Kulit Rambutan ¼ IC 50 : ¼ IC 50 47,78 59,824 y = 0,094x + 42,15 ½ IC 50 : ¼ IC 50 53,60 121,812 ¼ IC 50 : ½ IC 50 51,92 103,890 ½ IC 50 : ½ IC 50 59,24 181,823 Menurut Reynold dan Maurer (2005), Combination Index (CI) merupakan perbandingan antara kombinasi dua agen pada rasio tertentu dengan agen tunggal yang mana nilainya menginterpretasikan sinergisitas. Rumus CI untuk senyawa dengan tipe aksi yang sama:
41 Nilai x sebagai (D x ) 1 atau (D x ) 2, sedangkan (D) 1 atau (D) 2 adalah konsentrasi tunggal kulit rambutan dan jamur tiram yaitu 8 ppm, 16 ppm, 9 ppm, dan 18 ppm. Nilai CI kombinasi ekstrak kayu secang dan kulit rambutan dapat dilihat pada tabel VIII. Tabel VIII. Hasil untuk kombinasi ekstrak (CI) kulit rambutan jamur tiram (ppm) (ppm) 9 18 8 0,17 0,19 16 0,12 0,14 Pada kombinasi ekstrak dapat dilihat bahwa pada semua perbandingan konsentrasi kombinasi didapatkan hasil yang sinergis kuat dengan rata-rata memiliki nilai 0,1-0,3. Tetapi terlihat pada perbandingan konsentrasi 16ppm (1/2 IC 50 ) ekstrak kulit rambutan : 9 ppm (1/4 IC 50 ) ekstrak jamur tiram memiliki efek sinergis kuat dengan nilai 0,12 dengan parameter nilai CI yang memiliki efek sinergis kuat yaitu 0,1-0,3.
42 Gambar 13. Aktivitas antioksidan ekstrak tunggal dan kombinasi dengan vitamin C Keterangan : Ekstrak A B C D E F G H I J K L kulit rambutan 1/4 IC50 + - - + - - + - - - - - kulit rambutan 1/2 IC50 - + - - + - - + - - - - jamur tiram 1/4 IC50 - - + + + - - - - - - - jamur tiram 1/2 IC50 - - - - - + + + - - - - vitamin C 2 ppm - - - - - - - - + - - - vitamin C 4 ppm - - - - - - - - - + - - vitamin C 8 ppm - - - - - - - - - - + - vitamin C 10 ppm - - - - - - - - - - - + Pada kolom A, B, C, dan F menjelaskan bahwa ekstrak tunggal kulit rambutan dan jamur tiram dengan konsentrasi ¼ IC50 dan ½ IC50 positif menunjukkan adanya aktivitas antioksidan dengan % inhibisi secara berturutberturut adalah 43,24%, 46,5%, 38,22%, dan 41,1%. Hasil % inhibisi antara ekstrak tunggal menunjukkan bahwa ekstrak kulit rambutan memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibanding ekstrak jamur tiram. Aktivitas antioksidan setelah pencampuran menurut perbandingan tertentu dari kedua ekstrak etanol jamur tiram dan kulit rambutan, ternyata menunjukkan bahwa persentase aktivitas antioksidan yang dihasilkan kombinasi ekstrak lebih tinggi dari kemampuan ekstrak tunggal, akan tetapi jika dibandingkan dengan
43 persentase aktivitas antioksidan pada vitamin C 8 ppm dan 10 ppm aktivitas antioksidan pada kombinasi lebih kecil. Perbedaan aktivitas antioksidan pada ekstrak tunggal, kombinasi ekstrak, dan vitamin C dapat dilihat pada gambar diatas (Gambar 12): Berikut adalah parameter nilai CI (Maurer,2005) : Nilai Tabel IX. Parameter nilai CI Keterangan < 0,1 Sangat sinergis kuat 0,1-0,3 Sinergis kuat 0,3-0,7 Sinergis 0,7-0,9 Cukup hampir mendekati sinergis 0,9-1,1 Hampir menambahkan efek sinergis 1,1-1,45 Cukup hampir antagonis 1,45-3,3 Antagonis >3,3 Antagonis kuat sampai antonis sangat kuat