BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimen secara deskriptif yang bertujuan untuk memberikan informasi tentang potensi probiotik dari Lactobacillus plantarum yang diisolasi dari usus halus itik Mojosari (Anas plathyrinchos) dengan pengujian secara in vitro yaitu suatu kajian tentang ketahanan Lactobacillus plantarum terhadap kondisi ph asam, garam empedu, penghambatan terhadap bakteri patogen dan interaksinya dengan bakteri nonpatogen. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei - Desember 2011 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang. 3.3 Alat dan Bahan Penelitian 3.3.1 Alat Penelitian Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi Laminar Air Flow, spektrofotometer, timbangan analitik, hot plate, autoclave, oven, shaker water bath, mikropipet, colony counter, vortex, Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, rak tabung reaksi, beaker glass, jarum ose, pipet tetes, spatula, stirer, sumuran 43
44 (bor), gelas ukur, blue tip, yellow tip, ph indicator universal, alumunium foil, plastik wrap, bunsen, korek api, corong, kertas putih, plastik tahan panas dan kertas coklat. 3.3.2 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Lactobacillus plantarum yang diisolasi dari usus halus itik Mojosari (Anas plathyrinchos), MRSA (de Maan Rogosa Sharpe Agar), MRSB (de Maan Rogosa Sharpe Broth), NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), Oxgall 0,3% (b/v) (Merck), Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Lactobacillus paracasei, alkohol 70%, etanol (Merck), NaOH (Merck), HCl, aquadest, kapas dan spritus. 3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap ph Asam Uji ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan isolat bakteri asam laktat (BAL) terhadap ph rendah. Prosedur pengujiannya dilakukan dengan metode Zavaglia et al. (1998) yaitu: 1. Dilakukan kurva pertumbuhan sebelum perlakuan terhadap ph asam, untuk mengetahui jumlah awal sel bakteri yang hidup. 2. Kultur stok cair bakteri Lactobacillus plantarum yang berumur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1 ml kedalam 10 ml MRS broth dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 18 jam.
45 3. Diambil 1 ml kultur dan dimasukkan pada 9 ml MRS broth yang ph sudah diatur menjadi 2, 3, dan 4 dengan HCl 1N dan teknik isolasi dilakukan dengan metode pour plate pada MRS agar, 4. Diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam. 5. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung dengan colony counter. 3.4.2 Uji Ketahanan Lactobacillus plantarum Terhadap Garam Empedu Uji ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan isolat bakteri asam laktat (BAL) terhadap garam empedu yang terdapat dalam lambung manusia. Prosedur pengujiannya dilakukan dengan metode Sharpe (1980) yaitu: 1. Kultur stok cair bakteri asam laktat yang berumur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1 ml kedalam 10 ml MRS broth dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 18 jam, 2. Dilakukan kurva pertumbuhan bakteri Lactobacillus plantarum sebelum perlakuan terhadap garam empedu, untuk mengetahui jumlah awal sel bakteri yang hidup, 3. Diambil 1 ml kultur dan dimasukkan pada 9 ml MRS broth yang mengandung Oxgall 0,3% (b/v) garam empedu dan sebagai kontrol digunakan MRS broth, teknik isolasi dilakukan dengan metode pour plate pada MRS agar, 4. Kemudian diinkubasi pada 30 0 C selama 24 jam. 5. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung dengan colony counter.
46 3.4.3 Uji Penghambatan Lactobacillus plantarum Terhadap Bakteri Patogen Bakteri patogen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella typhi. Pemilihan bakteri ini mewakili bakteri Gram positif dan Gram negatif. Prosedur pengujiannya dilakukan dengan metode sumur menurut Schillinger dan Lucke (1989) dalam Ekowati (2009) yaitu sebagai berikut: 1. Satu ose kultur bakteri uji (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella typhi) masing-masing diinokulasikan kedalam media NB (Nutrient Broth) 10 ml dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam dan kultur stok cair Lactobacillus plantarum yang berumur 24 jam diambil 1 ml kemudian dimasukkan kedalam 10 ml MRS broth dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 18 jam, 2. Masing-masing bakteri uji diinokulasikan sebanyak 25 µl kedalam NA (Nutrient Agar) secara pour plate dan dibiarkan mengeras, 3. Media NA yang telah mengeras kemudian dibuat sumuran dengan alat bor yang steril di bagian tengah zona yang dibuat di cawan petri, 4. Sumuran yang telah dibuat di media NA diisi dengan media MRSB yang telah berisi kultur bakteri Lactobacillus plantarum sebanyak 50 µl, 5. Kemudian diinkubasi pada 30 0 C selama 24 jam, 6. Diameter zona bening yang terbentuk disekitar sumuran diukur sebagai zona penghambatan Lactobacillus plantarum terhadap bakteri uji (bakteri patogen).
47 3.4.4 Uji Interaksi Lactobacillus plantarum Dengan Bakteri Non-Patogen Bakteri non-patogen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Lactobacillus paracasei. Prosedur pengujiannya dilakukan dengan metode sumur menurut Schillinger dan Lucke (1989) dalam Ekowati (2009) yaitu sebagai berikut: 1. Stok kultur cair Lactobacillus plantarum yang berumur 24 jam dan bakteri uji (Lactobacillus paracasei) diambil 1 ml kemudian dimasukkan kedalam 10 ml MRS broth dan diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 18 jam. 2. Diinokulasikan bakteri Lactobacillus paracasei sebanyak 50 µl secara pour plate (menuang media MRSA kedalam cawan petri dan biarkan mengeras), 3. Setelah mengeras di bagian tengah media MRS agar dibuat sumuran dengan bor dan dinokulasikan Lactobacillus plantarum sebanyak 50 µl, 4. Inkubasi pada suhu 30 0 C selama 24 jam, 5. Diamati terbentuknya koloni kedua bakteri yang menyatu (tidak saling menjauhi). 3.5 Analisis Data deskriptif. Hasil pengamatan yang diperoleh dari berbagai pengujian dianalisis secara