13 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Lab. KESDA provinsi DKI Jakarta (analisis kandungan senyawa aktif, Pimpinella alpina), Lab. Percobaan Babakan FPIK (pemeliharaan ikan uji), dan Lab. Pengembangbiakan dan Genetika Ikan BDP FPIK IPB (pembuatan preparat histologi gonad dan analisis gonad metode acetocarmin). Pelaksanan penelitian direncanakan selama 4 bulan. Rancangan Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan adalah RAL (Rancangan Acak Lengkap). Dosis ekstrak purwoceng yang digunakan adalah 0, 10, 20 dan 30 mg/liter. Dari hasil analisis GC;MS, ekstrak purwoceng mengandung senyawa stigmasterol sebanyak 5,38%. Dengan demikian dosis stigmasterol yang terkandung dalam setiap dosis perlakuan secara berturut-turut sebanyak 0 mg, 0,538 mg, 1,076 mg, dan 1,614 mg. Masing-masing perlakuan dilakukan dengan tiga kali ulangan. Perlakuan A, ekstrak purwoceng 10 mg/liter Perlakuan B, ekstrak purwoceng 20 mg/liter Perlakuan C, ekstrak purwoceng 30 mg/liter Perlakuan D, perendaman dalam 17α-MT konsentrasi 500 µg/liter (kontrol positif) Perlakuan E, perendaman tanpa ekstrak purwoceng dan 17α-MT (Kontrol negatif) Y ij = μ + τ i + ij Keterangan : Y ij μ τ i : Nilai pengamatan perlakuan ke-i, ulangan ke-j : Rata-rata umum : Pengaruh perlakuan ke-i ij : Pengaruh acak yang menyebar normal Prosedur Penelitian 1. Pembuatan ekstrak purwoceng Tanaman purwoceng dikeringkan lalu digiling menjadi bubuk. Tanaman purwoceng yang telah menjadi bubuk direndam dalam pelarut methanol 70%
14 dengan perbandingan 1:2. Kemudian diaduk selama 3 jam, lalu didiamkan (maserasi) selama 24 jam. Selanjutnya disaring, lalu disiapkan menjadi ekstrak kental. 2. Pemeliharaan Ikan Uji Prosedur kerja yang dilakukan dalam pemeliharaan ikan adalah sebagai berikut: 1.1. Persiapan Wadah Wadah yang digunakan adalah akuarium perendaman volume 5 liter sebanyak 15 unit akuarium dan akuarium pemeliharaan ukuran 90 x 50 x 40 cm sebanyak 15 unit akuarium. Sebelum digunakan, akuarium disterilkan menggunakan kaporit dengan dosis 10 ppm, lalu dibilas dengan air bersih dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian akuarium diisi air sebanyak 100 liter, air yang digunakan adalah air yang telah diendapkan didalam bak tandon. 1.2. Perendaman Larva yang digunakan dalam penelitian ini adalah larva ikan nila (Oreochromis niloticus) berumur 4 hari (berat 0,02-0,03 gram/larva) diperoleh dari BRPBAT (Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar) Sempur Bogor. Larva direndam dalam larutan ekstrak purwoceng masingmasing 0, 10, 20, dan 30 mg/liter dengan lama waktu perendaman 8 jam dalam akuarium bervolume 5 liter. Akuarium tersebut diisi air sebanyak 3 liter dengan jumlah larva ikan nila 100 ekor/akuarium. Sebelum digunakan ekstrak purwoceng dan MT dilarutkan dengan larutan ethanol 95% sebanyak 5 ml. Perendaman dilakukan sebanyak dua kali perendaman, yaitu pada saat larva berumur 4 hari dan diulangi pada saat larva berumur 7 hari. 1.3. Pemeliharaan larva Setelah perendaman pertama dan kedua selesai, larva dipindahkan kedalam akuarium pemeliharaan. Larva diberi pakan starter berbentuk tepung untuk benih ikan air tawar merk Hi-Pro-Vite, tipe PS-P yang diproduksi oleh PT. Centra Proteina, Tbk. Komposisi nutrisi: protein minimum 40%, lemak minimum 10%, serat kasar maksimal 8%, dan
15 kadar air 12%. Selama pemeliharaan, ukuran dan jenis pakan disesuaikan dengan tingkat perkembangan larva. Pakan yang diberikan dengan frekuensi pemberian 3-4 kali/hari. Larva dipelihara selama 60 hari sehingga dapat diidentifikasi dengan metode asetokarmin untuk membedakan kelamin jantan dan betina. 3. Pemeriksaan Gonad Ikan Uji Pemeriksaan gonad ikan uji menggunakan metode asetokarmin (Zairin, 2002). Larutan asetokarmin Larutan asetokarmin dibuat dengan melarutkan 0,6 g bubuk karmin kedalam 100 ml asam asetat 45%. Larutan dididihkan selama 2 hingga 4 menit kemudian didinginkan dan disaring dengan kertas saring. Selanjutnya dimasukkan dalam botol tertutup dan disimpan pada suhu ruang. Pemeriksaan gonad Pemeriksaan gonad dilakukan setelah ikan berumur 60 hari dengan mengambil sampel sebanyak 30% dari ikan uji. Ikan dibedah dan diambil gonadnya secara hati-hati menggunakan pinset. Untuk memudahkan pengambilan gonad, usus dan organ dalam perut dikeluarkan. Sebagian gonad diletakkan di atas gelas objek kemudian dicincang dengan menggunakan pisau skalpel sampai halus. Kemudian cincangan gonad di atas objek gelas diberi larutan asetokarmin sebanyak 2 tetes. Objek gelas ditutup dengan cover gelas. Gonad siap diamati dibawah mikroskop binokuler dengan pembesaran 40X. Pengamatan Parameter 1. Kadar senyawa aktif dalam Purwoceng (Pimpinella alpina) Kadar senyawa aktif dalam purwoceng (Pimpinella alpina) dianalisis dengan menggunakan metode GC:MS (Gas chromatography-mass spectrometry) yang dilakukan di Dinas Kesehatan Provinsi DKI Jakarta. 2. Persentase Ikan Jantan Perhitungan persentase ikan jantan menggunakan rumus sebagai berikut: Jumlah ikan jantan( sampel ) Persentase Ikan Jantan x100% total ikan sampel
16 3. Kelangsungan Hidup Ikan Uji Kelangsungan hidup ikan dihitung jumlahnya pada akhir penelitian dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Nt SRt(%) x100% No SR : Kelangsungan hidup selama perlakuan (%) Nt No : Jumlah ikan pada akhir perlakuan (ekor) : Jumlah ikan pada awal perlakuan (ekor) 4. Persentase Ikan Nila Interseks Pengamatan juga dilakukan terhadap morfologi ikan dan dideskripsikan tingkat kesempurnaannya apabila terdapat ikan-ikan yang cacat kelamin (interseks). Jumlah ikan interseks ( sampel ) Persentase Ikan Interseks x100 % total ikan sampel 5. Pertumbuhan Ikan Uji Pengukuran bobot ikan dilakukan setiap minggu untuk perhitungan kebutuhan pakan dan pertumbuhan ikan sendiri. Perhitungan pertumbuhan menggunakan rumus sebagai berikut: G = (ln Wt ln Wo) / Δt x 100% G : Laju pertumbuhan harian individu (%) Wt Wo Δt 6. Kualitas Air : Bobot rata-rata individu pada akhir pemeliharaan (gram) : Bobot rata-rata individu pada awal pemeliharaan (gram) : Lama waktu pemeliharaan (hari) Pengukuran kualitas air meliputi suhu (suhu minimum dan maksimum selama penelitian), DO, dan ph yang dilakukan setiap hari menggunakan termometer, DO-meter, dan kertas lakmus. NH 3 diukur setiap minggu menggunakan spektrofotometer. Analisis Data Data persentase ikan jantan, kelangsungan hidup, dan pertumbuhan ikan ditabulasi. Dilakukan analisis kehomogenan, bila data sudah homogen dilakukan
17 analisis sidik ragam (ANOVA) dengan uji F dan bila berbeda nyata dilakukan uji Duncan. Data yang telah dianalisis disajikan alam bentuk tabel dan grafik yang selanjutnya dibahas sesuai dengan parameter uji yang diamati. Analisis eksploratif dilakukan terhadap data gonad yang diamati, kadar kandungan senyawa aktif dalam purwoceng, dan kecacatan. Data kualitas air dianalisis secara deskriptif dan disajikan dalam bentuk tabel.