34 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian yang dilakukan eksperimental laboratories in vivo pada tikus (Sprague Dawley) jantan. B. Tempat dan Waktu Penelitian 1. Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan di beberapa tempat, yaitu : a. Daun Pepaya akan di dapatkan dari perkebunana pepaya milik warga di daerah Muntilan Magelang Jawa Tengah. b. Pembuatan ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) dilaksanakan di Laboratorium Farmasi unit II Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. c. Pembuatan gel ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) dilaksanakan di Laboratorium Farmasi unit II Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. d. Pembuatan preparat sel PMN di bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. e. Pembacaan preparat dilakukan di Laboratorium Histopatologi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta f. Pengukuran diameter luka gingiva tikus (Sprague dawley) jantan dilaksanakan di Laboratorium FKIK Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. 34
35 2. Waktu Penelitian ini akan dilakukan pada bulan desember 2015 sampai dengan bulan januari 2016. C. Subyek Penelitian 1. Subyek a. Tikus (Sprague Dawley) Jantan (n-1) (t-1) > 15 Subyek yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus yang diperoleh dari Abadi Jaya jalan Gandok gg Narodo No 3X Condong Catur Depok Sleman, Yogyakarta. Tikus yang digunakan berusia ± 3 bulan dengan berat badan berkisar antara 250-300 gram. b. Daun papaya (Carica papaya L.) Daun Pepaya akan di dapatkan di perkebunan milik warga di daerah Muntilan Magelang Jawa Tengah. Ciri-ciri daun yang sehat adalah yang hijau dan tampak bersih. 2. Besar sampel Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini dapat dihitung dengan rumus Federrer (1963) : Keterangan : n = jumlah sampel t = jumlah variabel sehingga didapatkan, (n-1) (t-1) > 15 (n-1) (3-1) > 15 n = 8,5
36 Dengan pembulatan maka n=9 dan asumsi drop out 2 tiap kelompok, sehingga jumlah subyek penelitian yang digunakan pada tiap kelompok n= 11 ekor. Pada penelitian ini terdapat 3 kelompok perlakuan, sehingga total subyek penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah 33 ekor tikus (Sprague dawley) jantan. D. Kriteria Inklusi dan Eksklusi Subyek penelitian yang digunakan adalah 33 ekor tikus (Sprague dawley) jantan dengan kriteria inklusi dan eksklusi. 1. Kriteria inklusi a. Tikus putih jantan 1) Jenis kelamin = Jantan 2) Umur = 2-3 bulan 3) Berat = 250-300 gram 4) Aktif b. Daun papaya (Carica papaya L.) Daun papaya yang baik adalah berwarna hijau segar. 2. Kriteria eksklusi a. Tikus putih betina 1) Umur 2-3 bulan 2) Berat 250-300 gram 3) Diketahui terjangkit penyakit atau tidak aktif 4) Diketahui mati sebelum perlakuan selesai
37 b. Daun papaya (Carica papaya L.) Daun papaya yang berwarna kecoklatan. E. Identifikasi Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Identifikasi variabel penelitian a. Variabel pengaruh 1) Gel ekstrak daun pepaya konsentrasi 75% 2) Kontrol positif : Kenalog 10% 3) Kontrol negatif : Aquades b. Variabel terpengaruh Variabel terpengaruh dalam penelitian ini adalah ukuran diameter luka pada proses penyembuhan luka gingiva pada tikus ( Sprague dawley) jantan. c. Variabel terkendali 1) Jenis kelamin tikus, yaitu tikus (Sprague Dawley) jantan 2) Umur tikus sekitar 2-3 bulan 3) Berat badan tikus 250 gram hingga 300 gram 4) Makanan tikus mengunakan pellet AD-2 11 dan air mineral 5) Air minum : air mineral 6) Alat mengoleskan bahan hidrogen peroksida 7) Pengukuran pembuatan gel ekstrak 8) Pengukuran diameter luka
38 d. Variabel tidak terkendali 1) Infeksi bakteri 2) Penurunan berat badan tikus jantan 3) Komplikasi pasca perlukaan gingiva 2. Definisi operasional a. Hidrogen peroksida adalah zat kimia yang terkandung dalam bahan bleaching yang memiliki konsenterasi tertinggi yang biasa dipakai di tempat praktek dokter gigi adalah konsenterasi 35% yang dapat memberikan proses pemutihan gigi yang baik dibanding bahan pemutih gigi yang lainnya namun disamping kelebihannya itu hidrogen peroksida 35% jika tidak diaplikasikan dengan baik dapat menimbulkan efek samping jika terkena gingiva. Pada penelitian ini akan dilakukan tindakan perlukaan pada daerah gingiva tikus dilakukan dengan cara mengoleskan bahan bleaching kandungan hidrogen peroksida 35% menggunakan micro brush sesuai dengan konsentrasi yang terkandung dalam bahan bleaching, lalu daerah yang diolesi akan timbul luka melepuh akibat zat kimia. b. Ekstrak daun papaya adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstrak senyawa aktif dari simplisia nabati daun pepaya menggunakan pelarut yang sesuai. Ekstrak dengan metode maserasi dengan cara merendam di dalam etanol 70% selama 24 jam dan disaring hingga didapatkan ekstrak kental 100%. Larutan yang
39 diperoleh dipanaskan diatas pemanas hingga menguap dan menyisakan ekstrak kental (pekat). c. Daun papaya mempunyai kandungan saponin, tanin, dan flavonoid yang berfungsi dalam membantu proses penyembuhan luka. d. Gel ekstrak daun pepaya adalah sediaan setengah padat yang mudah dioleskan dan digunakan sebagai obat luar dengan kandungan ekstrak yang diperoleh dengan melalui proses penyaringan daun pepaya menggunakan pelarut etanol 70%. e. Pengamatan proses penyembuhan luka gingiva diperoleh dengan melakukan pengukuran diameter luka pada gingiva yang sebelumnya sudah diberikan pengobatan dengan menggunakan gel ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) 75% f. Sel PMN (neutrofil) jarang ditemukan dalam jaringan ikat normal, dan akan berjumlah banyak pada saat proses inflamasi. Akan dilakukan pengamatan secara mikroskopis melalui pengamatan preparat menggunkanan pewarnaan HE F. Instrumen Penelitian 1. Bahan a. Daun papaya (Carica papaya L.) 3 kg sebagai bahan dasar ekstrak b. Kenalog in ora base 10% sebagai obat pembanding kelompok ke-1 c. Etanol 70%, untuk pelarut ekstrak d. Tikus (Sprague Dawley) jantan sebagai hewan uji.
40 e. Natrium CMC (CMC-Na) 3gram (5%) sebagai bahan tambahan dalam pembuatan gel f. Aquades 100ml (10%) steril sebagai pembanding ke-2 g. Pellet AD-2-11, bahan pakan tikus h. Alkohol 70% i. Stik ph universal untuk mengukur Ph pada ekstrak j. Xylol untuk larutan yang digunakan saat pembuatan preparat k. Kapas sebagai alat bantu dalam proses induksi luka serta saat proses perlakuan berjalan l. Hidrogen peroksida 35% sebagai bahan uang digunakan untuk menginduksikan luka m. Chloroform dari toko bahan kimia Bratachem 2. Alat alat a. Penyaring, untuk menyaring ekstrak daun pepaya b. Pemanas, untuk memanaskan larutan ekstrak daun pepaya c. Autoklave, untuk sterilisasi alat-alat pembuatan ekstrak daun pepaya d. Timbangan, untuk menimbang bahan saat pembuatan ekstrak daun papaya dan saat pembuatan gel ekstrak daun pepaya e. Gelas ukur dan gelas beker, sebagai alat ukur larutan saat proses ektraksi daun pepaya f. Water bath, pemanas bahan ekstrak daun pepaya g. Cahwan porselin, wadah pemanas bahan ekstrak daun pepaya
41 h. Sendok stainless stell, sebagai pengaduk saat proses pembuatan gel ekstrak daun pepaya i. Mortil, tempat pencampuran bahan saat pembuatan gel ekstrak daun pepaya j. Botol gel, untuk menyimpan gel ekstrak daun pepaya k. Kaca alroji, untuk uji daya serap gel ekstrak daun pepaya l. Sentrifugator, untuk uji konsentrasi larutan ekstrak daun pepaya m. Kandang tikus diberi kode nomor n. Jangka sorong untuk alat pengukuran diameter luka pada gingival tikus o. Micro brush, untuk pengolesan dalam setiap perlakuan G. Cara Kerja 1. Tahap persiapan a. Ekstraksi bahan uji Pembuatan ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) 75% dilakukan di LPPT UNIT II UGM. Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi dengan bahan pelarut etanol 70%. 3 kilogram daun pepaya dicuci terlebih dahulu hingga bersih, kemudian di keringkan dengan menggunakan oven. Langkah selanjutnya, daun papaya dipotong kecil, kemudian diblender dan disaring lalu diambil serbuknya sebesar 300 gram. Rendam di dalam etanol 70% selama 24 jam dan dilakukan penyaringan hingga didapatkan ekstrak kental 100%. Kemudian larutan yang diperoleh dipanaskan diatas pemanas hingga menguap dan menyisakan ekstrak kental (pekat).
42 b. Pembuatan bentuk sedia an gel Pembuatan gel ekstrak daun pepaya terdiri dari bahan basis gel dan yang berperan sebagai basisnya adalah bahan-bahan seperti natrium CMC (CMC-Na) 5 gram (5%) dan aquades 70 ml (0%) steril. Adapun proses pembuatan gel adalah sebagai berikut : 1) Siapkan bahan dasar pembuat gel yaitu serbuk CMC-Na. 2) Timbang CMC-Na seberat 5 gram, masukkan ke dalam gelas ukur. 3) Larutkan bahan dasar dengan aquades sebanyak 100 gram sedikit demi sedikit dan di aduk sampai rata. 4) Selanjutnya tambahkan ekstrak daun papaya sesuai dengan konsentrasi yaitu 75% 5) Masukkan ekstrak ke dalam gelas beker dan satukan dengan serbuk CMC-Na, aduk sampai rata sehingga membentuk masa gel. 6) Setelah bahan menjadi padat maka akan menghasilkan 100 gram gel ekstrak daun papaya dengan konsentrasi 75% setelah itu bahan tersebut di masukkan ke botol gel dan disimpan di dalam lemari es bersuhu 4-6ºC.
43 Daun papaya (Carica papaya L.) 3 kg dicuci bersih dengan air Daun papaya (Carica Papaya L.) dikeringkan pada suhu 60-70 o C Daun digiling dengan menggunakan blender hingga berupa serbuk Serbuk (Carica Papaya L.) direndam dengan etanol 70% sambil di aduk selama 30 menit lalu diamkan selama 24 jam Ampas filltrat Diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dengan suhu 70 o C Ekstrak kental Daun papaya (Carica Papaya L.) dengan konsentrasi 100% Pembuatan gel ekstrak Daun papaya (Carica Papaya L.) 75% Gambar 4. Pembuatan Gel
44 c. Cara pengaplikasian gel 1) Siapkan gel ekstrak daun papaya (Carica papaya L.) 75%. 2) Ambil gel dengan menggunakan micro brush sekitar 0,01mm dan oleskan pada luka gingiva tikus satu kali sehari selama 7 hari. 3) Perlakuan tersebut terus dilakukaan dimulai pada hari ke-1 setelah 24 jam gingiva berkontak dengan hidrogen peroksida 35% sampai luka pada gingiva tikus (Sprague dawley) jantan sembuh sesuai dengan indikator atau parameter sembuhnya luka. d. Persiapan hewan uji Sebelum dilakukan perlakuan, hewan uji diadaptasikan (diaklimatisasi) selama 3 hari. Hewan uji yang berjumlah 33 ekor dibagi dalam 3 kelompok yaitu kelompok I (diaplikasikan kenalog) sebanyak 11 ekor, kelompok II ( perlakuan gel ekstrak daun papaya) konsentrasi 75% sebanyak 11 ekor, kelompok kontrol III (diaplikasikan aquades) sebanyak 11 ekor. Masing-masing kelompok dikandang yang berbeda dan diletakkan pada kondisi lingkungan yang sama serta diberi kode nomer. 2. Jalannya penelitian a. Induksi luka pada tikus (Sprague dawley) jantan Tikus yang sudah diadaptasikan dengan lingkungan laboratorium selama satu minggu diolesi hidrogen peroksida 35% menggunakan micro brush dan ditunggu hinga 24 jam. Luka yang akan nampak adalah luka melepuh berwarna keputihan yang diakibatkan dari iritasi
45 zat kimia yang tergolong sebagai luka bakar (Sjamsuhidayat dan Jong, 2012). Tiga puluh tiga ekor tikus dibagi menjadi 3 kelompok, yaitu kelompok kontrol positif diaplikasikan kenalog 10% (kelompok I), Kelompok perlakuan gel ekstrak daun papaya 75% (II), kelompok positif aplikasi aquades (kelompok III). Hari ke nol (0), 33 ekor tikus putih (Sprague Dwaley) jantan di beri perlukaan dengan mengoleskan hidrogen peroksida 35%, kemudian diberi perlakuan pada hari ke-1 yaitu setalah 24 jam pasca perlakuan hidrogen peroksida 35%. Pada masing-masing kelompok pada hari ke-1, ke-3, ke-5 dan ke- 7 setelah dibuat perlukaan ambil 1 ekor tikus secara random dari tiap kelompok perlakuan lalu diukur diameter luka menggunakan jangka sorong serta diambil foto luka nya dengan jarak foto yang disesuaika pada setiap kali foto, setelah itu tikus-tikus yang telah diukur dan di foto akan dikorbankan untuk diambil rahangnya (dekapitulasi rahang). b. Pemberian Perlakuan gel ekstrak Tikus yang sudah dikelompokkan dan diukur diameternya diberikan perlakuan sesuai kelompoknya. Kelompok I adalah kelompok hewan uji kontrol positif dengan diberikan kenalog. Kelompok II adalah kelompok hewan uji dengan kontrol positif yang diberikan aquades. Kelompok III adalah kelompok hewan uji diberi sediaan gel ekstrak daun papaya (Carica papaya L.). Pemberian setiap
46 perlakuan dilakukan setiap hari dengan volume 0,1 ml sampai luka pada tikus sembuh. c. Evaluasi luka Evaluasi luka dilakukan pada hari ke-1 sebelum diberi perlakuan menggunakan gel ekstrak daun papaya 75%, kenalog, dan aquades untuk melihat luka yang sedang mengalami inflamasi setelah 24 jam terkena hidrogen peroksida 35%, lalu diamati lagi pada hari ke- 1, ke-3, ke-5 dan ke-7 pasca diberi perlakuan. Jalannya evaluasi melalui pengamatan lama waktu penyembuhan luka dengan indikator pengecilan diameter luka (Rahman dkk.,2013). Selain itu juga dilakukan pengambilan foto dengan jarak kamera dan luka yang disamakan setiap kali diamati. d. Pembuatan preparat Organ rahang yang telah didekapitulasi kemudian dimasukkan ke formalin 10% untuk disimpan dan selanjutnya dibuat preparat. Metode pembuatan preparat histopatologi berdasarkan Dirjen Kesehatan Hewan (1999) adalah sebagai berikut : 1) Spesimen diambil segera setelah hewan mati, jika terlambat akan terjadi autolisis sehingga akan mengacaukan interpretasi. 2) Dilakukan pemotongan jaringan untuk spesimen agar berisi jaringan yang mengalami perubahan dari jaringan normal, penelitian ini menggunakan pemotongan melintang.
47 3) Tebal spesimen tidak boleh lebih dari 5mm untuk mempermudah penetrasi cairan fiksasi. 4) Spesimen difiksasi segera dengan formalin 10%. 5) Perbandingan volume spesimen dengan larutan formalin adalah 1:10, agar didapat hasil fiksasi yang sempurna. 6) Setiap kontainer spesimen diberi label yang berisi informasi tentang identitas hewan, tanggal pengambilan spesimen, macam spesimen dan bahan pengawet yang dipakai. 7) Kontainer tersebut harus tertutup rapat dan tidak boleh bocor. 8) Dihindarkan agar tidak membekukan jaringan yang akan dipilih dengan pemeriksaan histopatologi. Untuk melihat sel PMN maka digunakan perwarnaan dengan HE. Jaringan yang akan diberi pewarnaan diparafinisasi dengan menggunakan larutan Xylol dan alkohol yang dilanjutkan dengan proses rehidrasi dengan alkohol, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibilas dengan aquades lalu dilap. Kaca benda kemudian dimasukkan kedalam Hematoksilin Meyers dan dicuci dengan air mengalir serta dibilas dengan aquades. Proses pewarnaan dilanjutkan dengan memasukkan kaca benda ke dalam Mallory untuk pewarnaan dilanjutkan dengan memasukkan kaca benda ke dalam Mallory untuk pewarnaan Mallory, lalu pewarnaan dinilai dibawah mikroskop cahaya. Bila pewarnaan telah dianggap baik maka selanjutnya adalah proses dehidrasi dengan alkohol secara bertingkat kemudian dilap,
48 setelah itu, dimasukkan kedalam larutan Xylol dan terakhir objek glass ditutup dengan deck glass dan dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x. e. Pembacaan preparat histopatologi Kriteria penilaian histologi sel PMN dibuat berdasarkan jumlah sel nya. Dilihat dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 40x. dilakukan penjumlahan sel PMN dengan cara melihat pada 5 lapang pandang lalu di bagi sejumlah lapang pandangnya dan di ambil nilai rata-ratanya pada setiap sediaan preparat. H. Analisi Data 1. Uji normalitas yang digunakan adalah Saphiro Wilk karena sampel < 50 2. Jika distribusi data normal maka akan dilakukan analisa dengan uji One Way Anova. Perbedaan dianggap bermakna jika p >0,05 3. Jika distribusi data tidak normal maka akan dilakukan analisa dengan uji Kruskal Wallis. Perbedaan dianggap brmakna jika p>0,05 4. Uji lanjutan dengan menggunakan uji Least Significant Difference untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok I. Etik Penelitian Penelitian dilakukan dengan melindungi hak subyek selama proses penelitian, untuk itu peneliti mengajukan ethical clearance dan mendapatkan persetujuan dari Tim Komite Etik Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta bahwa penelitian dilakukan tidak melanggar kode etik penelitian.
49 Manfaat yang diharapkan adalah untuk membuktikan secara ilmiah tentang efektifitas gel ekstrak daun pepaya (Carica papaya L.) terhadap penurunan diameter luka pada proses penyembuhan luka pada gingiva tikus (Sprague Dawley) jantan akibat efek samping bleaching kandungan hidrogen peroksida 35%.