J. Sains MIPA, Desember 2010, Vol. 16, No. 3, Hal.: 149-154 ISSN 1978-1873 PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITAS ph ENZIM PROTEASE DARI Bacillus subtilis ITBCCB148 Yandri*, Milya Purnamasari, Nurhasanah Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung Bandar Lampung *E-mail: yandrias@unila.ac.id ABSTRACT The objective of the research is to study the effect of sorbitol to ph stability of a local bacteria isolate Bacillus subtilis ITBCCB148 protease. The results showed that optimum ph of purified enzyme was 7.5, stable at ph range of 6.0-8.0. The enzyme after added of sorbitol has optimum ph at 7,5 and stable at ph range 6,0 9,0. The stability test of the purified enzyme at 60 C showed residual activity was 22%, and t ½ = 178 minutes. In this condition, addition of 0.5 M, 1 M and 1,5 M sorbitol concentration to the enzyme gave residual activity were 46%, t ½ = 330 minutes; 44%, t ½ = 315 minutes, and 45%, t ½ = 315 minutes respectively. Keywords: sorbitol, B. subtilis ITBCCB148, enzyme stability ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan sorbitol terhadap stabilitas ph enzim protease dari Bacillus subtilis ITBCCB148. Hasil penelitian menunjukkan enzim hasil pemurnian mempunyai ph optimum 7,5 dan stabil pada rentang ph 6,0 8,0. Uji stabilitas protease tersebut pada suhu 60 0 C dan ph 7,5 selama 360 menit masih menunjukkan aktivitas sisa 22%, t ½ = 178 menit. Enzim setelah penambahan sorbitol mempunyai ph optimum 7,5 dan stabil pada rentang ph 6,0 9,0. Uji stabilitas enzim setelah penambahan sorbitol pada suhu penyimpanan 60 0 C dan ph 7,5 selama 360 menit menunjukkan : sorbitol 0,5 M mempunyai aktivitas sisa 46%, t 1/2 = 330 menit; sorbitol 1 M mempunyai aktivitas sisa 44%, t 1/2 = 315 menit; sorbitol 1,5 M mempunyai aktivitas sisa 45%, t 1/2 = 315 menit. Kata kunci: sorbitol, B. subtilis ITBCCB148, stabilitas enzim 1. PENDAHULUAN Protease merupakan enzim yang berfungsi menghidrolisis ikatan peptida pada protein menjadi oligopeptida dan asam amino 1). Enzim protease memegang peranan penting dalam berbagai reaksi biokimia yang terjadi dalam organisme hidup termasuk degradasi prtoein menjadi asam-asam amino dan peptida sehingga dapat digunakan sebagai nutrien. Juga berperan dalam proses pembentukan spora, modifikasi enzim, dan sekresi berbagai enzim-enzim protein. Pada umumnya protease merupakan enzim monomer degan berat molekul sekitar 15 45 kda 2). Sebagian besar enzim secara cepat dan irreversible kehilangan aktivitas katalitiknya pada ph yang jauh dari kisaran ph optimal pada reaksi enzimatik. Ketidakaktifan enzim pada ph tersebut terjadi karena unfolding dari molekul protein sebagai suatu hasil dari alterasi kesetimbangan elektrostatik dan ikatan hidrogen 3). Begitu juga halnya pada suhu tinggi, enzim akan mengalami denaturasi yang membuat enzim menjadi inaktif. Terganggunya aktivitas enzim secara langsung berhubungan dengan perubahan struktur tersier dari molekul protein enzim 4), yang dapat menyebabkan rendahnya stabilitas enzim. Beberapa cara untuk meningkatkan stabilitas enzim yaitu teknik imobilisasi, modifikasi kimia, rekayasa molekuler, dan penambahan aditif. Penggunaan aditif lebih sering dipilih karena relatif lebih mudah dan biayanya relatif lebih murah 5). Secara umum, senyawa aditif digolongkan ke dalam substrat dan senyawa sejenis, golongan senyawa bermuatan dan polimer, golongan senyawa organik kecil tak bermuatan seperti sorbitol (alkohol polihidrat). Sorbitol yang diketahui reaktif adalah yang mengandung tiga karbon atau lebih. Etilen glikol yang mengandung dua atom karbon dan gugus hidroksil menunjukkan sifat di antara senyawa sorbitol dan 2010 FMIPA Universitas Lampung 149
Yandri dkk... Pengaruh Penambahan Sorbitol senyawa sejenis yang lebih hidrofobik. Senyawa-senyawa ini menimbulkan hidrasi air sehingga konformasi protein terjaga dari kemungkinan membuka. Penggunaan golongan alkohol ini memiliki beberapa kelebihan antara lain: meningkatkan stabilitas (daya awet) enzim, sifatnya yang menarik air (hidrofilik) dapat menurunkan aktivitas air, dan penambahan senyawa alkohol dapat meningkatkan interaksi hidrofobik di antara molekul protein enzim 4). Dengan demikian diharapkan aplikasi enzim pada proses-proses industri dapat semakin berkembang. Bacillus subtilis ITBCCB148 mampu menghasilkan enzim protease dan memiliki aktivitas optimum pada suhu 47 o C dan ph 8,0 6). Aktivitas enzim protease ini masih dapat berubah karena pengaruh ph yang jauh dari ph optimum. Karena aktivitas enzim secara langsung berhubungan dengan stabilitas enzim, maka perlu dilakukan penambahan aditif seperti sorbitol untuk meningkatkan stabilitasnya. Oleh karena itu, pada penelitian ini dipelajari pengaruh penambahan sorbitol terhadap stabilitas enzim protease dari bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148. Untuk mencapai tujuan tersebut maka dilakukan beberapa tahapan, yaitu : produksi enzim; pemurnian enzim yang terdiri dari fraksinasi dengan garam ammonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom penukar ion CM-Sephadex C-50; pengujian aktivitas protease dengan metode Kunitz; karakterisasi enzim, dan uji stabilitas enzim protease. Peningkatan waktu paruh, dan rentang ph kerja enzim setelah penambahan sorbitol menunjukkan bahwa enzim ini lebih stabil daripada enzim sebelum penambahan sorbitol. 2. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Universitas Lampung (mulai bulan Maret 2007 Juli 2007). 2.1. Prosedur Penelitian 2.1.1. Produksi Enzim Protease Tahap produksi protease meliputi : penentuan lama waktu inkubasi untuk mendapatkan enzim dengan aktivitas tertinggi, penentuan suhu optimum, dan penentuan ph optimum media fermentasi. Media fermentasi yang digunakan adalah media yang mengandung pepton 0,5%, ekstrak ragi 0,15%, glukosa 0,036%, dan NaCl 0,25% 7). 2.1.2. Isolasi dan Pemurnian Enzim Protease Isolasi dan pemurnian dilakukan beberapa tahap, yaitu : pemisahan cairan enzim dari sel dengan sentrifuga dingin sehingga diperoleh ekstrak kasar enzim, pengendapan dengan garam amonium sulfat dengan berbagai tingkat kejenuhan, kromatografi kolom penukar ion, dan kromatografi kolom penyaringan molekul 7). 2.1.3. Uji aktivitas Protease dan Penentuan Kadar Protein Pengujian aktivitas protease dilakukan dengan metode Kunitz modifikasi 8). Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry 9). 2.1.4. Karakterisasi enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan sorbitol Karakterisasi enzim hasil pemurnian dan setelah penambahan sorbitol meliputi: penentuan ph dan suhu optimum, penentuan stabilitas enzim. 1. Penentuan ph optimum enzim setelah penambahan sorbitol Larutan sorbitol (sorbitol) ditambahkan kepada enzim dengan perbedaan konsentrasi (0,5 M, 1M, dan 1,5 M). Sebanyak 1 ml campuran ditambahkan 1 ml substrat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada ph 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; dan 9,0 dalam waterbath. 2. Penentuan suhu optimum enzim setelah penambahan sorbitol Larutan sorbitol (sorbitol) ditambahkan kepada enzim dengan perbedaan konsentrasi (0,5 M, 1 M, dan 1,5 M). Sebanyak 1 ml campuran ditambahkan 1 ml substrat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 40, 45, 50, 55, 60, 65 dan 70 0 C dalam waterbath. 150 2010 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Desember 2010, Vol. 16, No. 3 3. Pengaruh sorbitol terhadap stabilitas enzim protease Campuran enzim dan sorbitol (0,5 M, 1 M, dan 1,5 M). diinkubasi pada ph dan suhu optimumnya selama 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, dan 360 menit setelah itu dilakukan uji aktivitasnya. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Pengaruh sorbitol terhadap ph optimum Aktivitas enzim sebelum dan setelah penambahan sorbitol pada berbagai ph dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1. ph optimum enzim setelah penambahan sorbitol (sorbitol sebelum penambahan sorbitol. 0,5 M, 1 M, dan 1,5 M), dan enzim Gambar 1 menunjukkan ph optimum enzim setelah penambahan sorbitol memiliki aktivitas yang sama dengan enzim sebelum penambahan sorbitol yaitu, ph 7,5 dengan aktivitas 100%. Enzim setelah penambahan sorbitol meningkat stabilitasnya terhadap ph dibandingkan dengan enzim sebelum penambahan sorbitol. Enzim ini stabil terhadap ph antara 6,0 9,0. Aktivitas (%) enzim hasil penambahan sorbitol (sorbitol 0,5 M) pada ph 6,0 adalah 82%, sedangkan pada ph 9,0 adalah 78%; sorbitol 1 M pada ph 6,0 adalah 66%, sedangkan pada ph 9,0 adalah 93%; dan sorbitol 1,5 M pada ph 6,0 adalah 45%, sedangkan pada ph 9,0 adalah 89%. Aktivitas (%) enzim sebelum penambahan sorbitol pada ph 6,0 adalah 75%, sedangkan pada ph 9,0 adalah 82%. Hasil ini menunjukkan enzim dengan sorbitol lebih stabil terhadap ph basa dibandingkan dengan enzim sebelum penambahan sorbitol. Peningkatan stabilitas enzim hasil penambahan sorbitol (sorbitol 0,5 M; 1 M; dan 1,5 M) terhadap ph diperkirakan karena atom hidrogen dari molekul enzim terutama yang terpapar ke permukaan berikatan dengan sorbitol sehingga terjadi perubahan muatan pada struktur enzim. Menurut Zubay 10), pengaruh ph pada aktivitas beberapa enzim tergantung pada pka dan ionisasi gugus pada enzim serta substrat yang terlibat dalam reaksi. Sementara sensifitas ph suatu enzim umumnya diindikasikan oleh gugus yang dapat terionisasi pada sisi reaktif enzim. Gugus yang terionisasi ini merupakan penentu beberapa perubahan struktur tersier dari enzim yang mempengaruhi sisi aktif enzim. 3.2. Pengaruh sorbitol terhadap suhu optimum Aktivitas (%) enzim sebelum dan setelah penambahan sorbitol pada berbagai suhu dapat dilihat pada Gambar 2. Suhu optimum enzim hasil penambahan sorbitol berdasarkan pada Gambar 2 adalah 60 0 C dengan aktivitas (%) enzim adalah 100%. Suhu optimum ini sama dengan suhu optimum enzim sebelum penambahan sorbitol. Walaupun tidak terjadi perubahan suhu optimum, tetapi aktivitas enzim setelah penambahan sorbitol pada suhu yang lebih tinggi menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan enzim sebelum penambahan sorbitol. 2010 FMIPA Universitas Lampung 151
Yandri dkk... Pengaruh Penambahan Sorbitol Gambar 2. Suhu optimum enzim setelah penambahan sorbitol (sorbitol 0,5 M; 1 M; dan 1,5 M), dan suhu enzim sebelum penambahan sorbitol. 3.3. Pengaruh sorbitol terhadap stabilitas ph enzim protease Aktivitas sisa enzim sebelum penambahan sorbitol dan enzim setelah penambahan sorbitol (sorbitol 0,5; 1; dan 1,5 M) ditentukan dengan menginkubasi masing-masing enzim tersebut pada suhu 60 0 C dan ph 7,5 selama 360 menit. Pada interval waktu tertentu masing-masing enzim ditentukan aktivitasnya. Kurva uji stabilitas enzim sebelum penambahan sorbitol dan enzim setelah penambahan sorbitol dapat dilihat pada Gambar 3. A k tiv ita s ( % ) 120 100 80 60 40 20 0 Enzim hasil pemurnian Sorbitol 0.5 M Sorbitol 1M Sorbitol 1.5 M 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 Waktu (menit) Gambar 3. Stabilitas enzim dinyatakan dengan aktivitas sisa (%) enzim sebelum penambahan sorbitol dan enzim setelah penambahan sorbitol (sorbitol 0,5 M; 1 M; dan 1,5 M) pada suhu 60ºC dan ph 7,5 terhadap waktu. Gambar 3 di atas menunjukkan aktivitas sisa masing-masing enzim pada suhu 60ºC dan ph 7,5 selama 360 menit. Enzim sebelum penambahan sorbitol mempunyai aktivitas sisa sebesar 22%, dan enzim setelah penambahan sorbitol (sorbitol 0,5 M; 1 M; dan 1,5 M) mempunyai aktivitas sisa berturut-turut : 46%, 44%, dan 45%. Hasil ini menunjukkan bahwa stabilitas enzim setelah penambahan sorbitol jauh lebih tinggi dibandingkan dengan enzim sebelum penambahan sorbitol. Suhartono 5), melaporkan bahwa stabilisasi 152 2010 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains MIPA, Desember 2010, Vol. 16, No. 3 enzim terjadi jika interaksi zat aditif lebih kuat dengan molekul air daripada dengan enzim, sehingga terbentuk cluster yang mencegah unfolding. 3.4. Waktu paruh Semua enzim setelah penambahan sorbitol meningkat waktu paruhnya hingga dua kali dibandingkan enzim sebelum penambahan sorbitol. Menurut Stahl 11) stabilitas enzim ditentukan dengan menentukan waktu paruh dari enzim tersebut. Pada penelitian ini, enzim dengan penambahan sorbitol 0,5 M mampu meningkatkan waktu paruh dari 178 menit menjadi 330 menit, enzim dengan penambahan sorbitol 1 M mampu meningkatkan waktu paruh dari 178 menit menjadi 315 menit, dan enzim dengan penambahan sorbitol 1,5 M mampu meningkatkan waktu paruh dari 178 menit menjadi 315 menit. Hasil ini menunjukkan penambahan sorbitol dapat meningkatkan waktu paruh enzim yang berarti dapat meningkatkan stabilitas enzim terhadap ph. 4. KESIMPULAN DAN SARAN Enzim hasil pemurnian mempunyai ph optimum 7,5 dan stabil pada rentang ph 6,0 8,0; suhu optimum 60 0 C. Uji stabilitas protease tersebut pada suhu 60 0 C dan ph 7,5 selama 360 menit masih menunjukkan aktivitas sisa 22%, t ½ = 178 menit. Enzim setelah penambahan sorbitol mempunyai ph optimum 7,5 dan stabil pada rentang ph 6,0 9,0. Uji stabilitas enzim setelah penambahan sorbitol pada suhu penyimpanan 60 0 C dan ph 7,5 selama 360 menit menunjukkan : sorbitol 0,5 M mempunyai aktivitas sisa 46%, t 1/2 = 330 menit, sorbitol 1 M mempunyai aktivitas sisa 44%, t 1/2 = 315 menit; sorbitol 1,5 M mempunyai aktivitas sisa 45%, t 1/2 = 315 menit. Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian ini, untuk penelitian selanjutnya disarankan untuk menggunakan senyawa poliol selain sorbitol untuk lebih meningkatkan kestabilan enzim protease. DAFTAR PUSTAKA 1. Kamelia, R., Muliawati, S. dan Dessy, N. 2005. Isolasi dan Karakterisasi Protease Intaselular Termostabil dari Bakteri Bacillus stearothermophilus RP 1. Departemen Kimia ITB. Bandung. 2. Fujiwara, N. and Masui, A. 1993, Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilica nd thermophilic Bacillus sp., J. Biotech., 30, 245-256. 3. Kazan, D., Haluk, E. and Altan, E. 1996. Stabilizalition of Penicilin G Aclyase Against ph by Chemical Cross-Linking. Process Biochemistry Vol. 31. No. 2. pp. 135-140. 4. Suhartono, M. T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen DIKTI, PAU Bioteknologi IPB. Bogor. 322 halaman. 5. Suhartono, M. T. 1993. Telaah Formulasi Aditif di Dalam Peningkatan Daya Simpan Protease Bacillus sp. Laporan Penelitian IPB. Bogor. 6. Sariningsih, R. 2000. Produksi Enzim Protease Oleh Bacillus ITBCCB148. Skripsi. Universitas Padjajaran. Bandung. 7. Yandri, Herasari, D. dan Suhartati, T. 2007, Isolasi, pemurnian dan karakterisasi enzim protease termostabil dari bakteri isolat lokal Bacillus subtilis ITBCCB148, Jurnal Sains MIPA, Edisi khusus, 13 (2), 100-106. 8. Yamaguchi, T., Yamashita, Y., Takeda, I. and Kiso, H. (1982), Proteolytic enzymes in green asparagus, kiwi fruit and miut: occurence and partial characterization, Agric. Biol. Chem., 46, 1983-1986. 2010 FMIPA Universitas Lampung 153
Yandri dkk... Pengaruh Penambahan Sorbitol 9. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein measurment with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193-265. 10. Zubay, G. 1983, Biochemistry, Collier Macmillan, Canada, 277. 11. Stahl, S. 1999, Thermophilic Microorganisms: The Biological Background for Thermophily and Thermoresistance of Enzymes in Thermostability of Enzymes (Gupta, M.N. editor), Springer Verlag, New Delhi, 59-60. 154 2010 FMIPA Universitas Lampung