Lokakarya Fungsiona/ Non Peneli6 1997 TEKNIK ISOLASI KUMAN MIKOPLASMA GALLISEPTICUM PADA AYAM Zulqoyah Layla Balai Penelitian Veteriner, Jalan R.E. Martadinata 30, Bogor 11614 PENDAHULUAN Mycoplasma gallisepticum (MG) adalah kuman yang menyebabkan terjadinya penyakit pernafasan menahun (PPM) pada ayam atau dikenal dengan penyakit chronic respiratory disease (CRD). Masa inkubasi penyakit berkisar antara 7-21 hari. PPM pada ayam dapat menyebabkan kematian yang tinggi apabila diikuti dengan infeksi sekunder, khususnya bakteri Escherichia coli, tetapi jika tidak diikuti dengan infeksi sekunder tingkat kematiannya rendah (Jordan, 1979 ; Yoder, 1991). Pada kondisi kompleks umumnya isolasi kuman MG sangat sulit dilakukan. Diagnosa yang termudah dapat dilakukan dengan serologi untuk mengetahui antibodi MG. Kuman MG pertama kali diisolasi oleh Nelson pada tahun 1935 dari seekor ayam yang terkena infeksi saluran pernafasan. Selanjutnya Adler dan (amamoto pada tahun 1956 menyatakan kombinasi Haemophilus gallinarum dan MG dapat menghasilkan penyakit yang menyerang saluran pernafasan dengan cepat dan bertahan untuk waktu yang lama. Menurut Razin dan Freundt (1984), kuman MG merupakan prokaryotik yang sangat kecil yang tidak memiliki dinding sel, tetapi selnya dikelilingi oleh membran plasma yang tipis. Diameter sel bervariasi antara 300-500 nm dan jika diberi pewarnaan gram akan menyerap warna gram negatif (Yoder, 1991). Untuk mengisolasi kuman MG diperlukan media spesifik yang memenuhi syarat pertumbuhannya, yaitu media yang kaya akan protein dan kolesterol, sedang untuk identifikasi kuman dapat dilakukan berbagai macam cara antara lain dengan uji biokimia atau uji hambatan pertumbuhan dengan menggunakan antisera MG. Pada tulisan ini akan diuraikan teknik isolasi kuman MG dari ayam dan cara pengidentifikasiannya dengan menggunakan uji hambatan pertumbuhan. Sampel BAHAN DAN METODE Sampel diperoleh dari ayam hidup yang diduga menderita PPM. Caranya yaitu dengan menggunakan kapas lidi steril untuk mengambil eksudat dari rongga hidung. 221
Lokakatya Fungsional Non Peneliti 1997 Antisera MG Antisera yang dipergunakan yaitu antisera MG dari kelinci. Caranya dengan menyuntikan antigen MG di bawah kulit pada beberapa tempat dan dilakukan beberapa kali sampai titer antibodi MG yang diharapkan cukup tinggi. Pembuatan antisera menggunakan isolat MG S6 yang diperoleh dari Australia dan dilakukan di Balai Penelitian Veteriner. Media Media yang dipergunakan terdiri dari media padat dan cair. Formulanya merupakan modifikasi dari Frey dkk. (1968). Media cair dibuat dari campuran Mycoplasma broth base (Difco), cystein HCI (BDH), thallous acetate (BDH), merah phenol dan aquabides. Campuran media ini sebelum disterilkan, diatur derajad keasamannya hingga mencapai ph 7,8. Untuk media padat, digunakan agar Nobel (Difco) tanpa penambahan glukosa dan merah phenol. Selanjutnya baik media cair maupun padat diperkaya dengan larutan penyubur yang sudah steril yaitu serum babi yang sudah diinaktifkan pada suhu 56 C selama 30 menit, larutan ekstrak yeast (Difco) dan larutan DNA (Koch Light). Selain penyubur tersebut juga ditambahkan antibiotika amoxycilin (Beecham P.I.) yang berfungsi untuk menghindari kontaminasi bakteri. Pada media padat selain diberi antibiotika juga ditambahkan aktidion (Up John) untuk menghindari kontaminasi jamur. Media cair yang telah komplit campurannya kemudian didistribusikan dalam botol Bijou's sebanyak 2 ml per botol, sedangkan media padat yang telah komplit campurannya didistribusikan pada cawan petri dengan isi 20 ml tiap petrinya. Media yang telah dibuat disimpan di dalam lemari pendingin sampai saat diperlukan. Peralatan Alat yang dipergunakan adalah kapas lidi steril, dawai platina, penyaring millipore, kapas, pembakar bunsen, kertas cakram steril yang telah diberi "digitonin" 1,5% dan kertas cakram steril yang telah diberi antisera MG, tabung yang kedap udara (dapat menggunakan bekas kaleng roti), lilin, mikroskop "disekting ", pengocok, botol bijou's, cawan petri, kabinet ruang steril dan inkubator dengan suhu 37 C. Cara Kerja Sampel diambil dari rongga hidung ayam hidup yang dicurigai menderita infeksi PPM dengan menggunakan kapas steril, kemudian dibiakkan dalam media cair dan diinkubasikan pada suhu 37 C. Setiap had diamati perubahan wama yang terjadi. Media biakan yang berubah warna dari merah menjadi merah kekuningan dan tidak keruh kemudian dibiakkan kembali pada media padat dengan diteteskan atau dengan menggunakan dawai. Jika biakan 22 2
Lokakarya Fungsionai Non Pene66 1997 pada media cair berubah warna menjadi merah kekuningan tetapi keruh, kemudian disaring dengan menggunakan penyaring "Millipore" dengan ukuran 300 nm. Setelah disaring kemudian sebanyak 0,2 ml dibiakkan kembali ke dalam media cair dan media padat. Media cair diinkubasikan langsung dalam inkubator dengan suhu 37 C, sedang biakan media padat dimasukkan ke dalam kaleng roti yang diberi kapas berair dan nyala lilin. Setelah kaleng ditutup rapat-rapat kemudian diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 C selama 5 sampai 14 hari. Pengamatan pertumbuhan koloni mikoplasma dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop "disekting ". Bentuk koloni MG kecil dengan penampang kurang dad 1 mm, berbentuk bundar dengan bagian tengah juga bundar berwarna lebih gelap yang disebut "bleb" berfungsi untuk perlekatan pada media. Bentuk ini sangat spesifik yang dikenal seperti telur mata sapi. Koloni ini terdiri dari ribuan sel mikoplasma, sehingga jika ingin dimurnikan diperlukan teknik kioning dengan cara mengambil satu koloni dengan menggunakan pipet Pasteur. Koloni yang sudah diambil ini kemudian ditanam kembali pada media cair, dikocok hingga merata denganmenggunakan pengocok kemudian ditanam pada media padat. Untuk mendapat koloni yang murni diperlukan sedikitnya 3 kali kioning. Deteksi Kuman Mikoplasma Untuk mengetahui apakah koloni yang dihasilkan mikoplasma atau "acholeplasma" maka koloni mikoplasma yang tumbuh diambil kembali satu koloni, kemudian dibiakan dalam media cair. Setelah tumbuh kemudian diencerkan dalam media cair lalu dituangkan pada media padat. Biakan pada media padat dibiarkan mengering di dalam kabinet ruang steril selama kurang lebih 5 menit. Setelah 5 menit, kertas cakram yang berisi "digitonin" diletakkan pada biakan media padat, kemudian dimasukkan di dalam kaleng roti lalu diinkubasikan pada suhu 37 C selama 5-7 hari. Jika terjadi hambatan lebih dari 5 mm maka koloni yang dibiakkan adalah kuman mikoplasma. Uji Hambatan Pertumbuhan Uji hambatan pertumbuhan dilakukan dengan cara seperti pada uji deteksi kuman mikoplasma, bedanya pada pengujian ini kertas cakram yang digunakan berisi antisera MG. Jika terjadi hambatan pertumbuhan Iebih dari 2 mm, maka koloni yang ditumbuhkan adalah kuman MG. HAS IL DAN PEMBAHASAN Isolasi kuman MG sering dikatakan menjengkelkan, karena tidak mudah berhasil untuk mengisolasinya. Teknik isolasi kuman mikoplasma yang diterapkan di laboratorium mikoplasma Balai Penelitian Veteriner sudah sering mengalami perubahan baik dari komposisi media maupun jenis media dasar. Saat ini tehnik isolasi mikoplasma boleh dikatakan sudah dapat dibakukan dan 2 2 3
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1997 keberhasilannya cukup tinggi. Pada penelitian ini isolasi kuman MG dilakukan dengan cara pengambilan eksudat dari rongga hidung ayam hidup dengan menggunakan kapas lidi steril. Kapas lidi ini kemudian dipupukkan pada media cair dan media padat. Dari hasil isolasi sering dijumpai kontaminasi bakteri sehingga diperlukan pemupukan ulang dengan cara disaring dengan menggunakan saringan Millipore ukuran 300 nm. Tehnik penyaringan ini juga tidak selalu memberikan hasil yang balk karena kuman mikoplasma yang ukurannya lebih besar dari 300 nm tidak dapat lolos lubang saringan. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 1. Darl 95 sampel yang diuji yang berasal dari 4 peterakan ayam potong komersial diperoleh 52 kuman mikoplasma yang belum diuji spesiesnya, diantaranya 17 memperlihatkan fermentasi glukosa. Dari 17 isolat tersebut setelah dilakukan uji hambatan pertumbuhan yang menggunakan antisera MG diperoleh 3 isolat MG. Kuman MG umumnya kecil, bulat dengan permukaan yang halus (Gambar 1). Tabel 1. Hasil isolasi kuman MG dad beberapa petemakan ayam Jumlah sampel Asal sampel Uji deteksi mikoplasma* Fermentasi glukosa Uji hambatan pertumbuhan dengan antisera MG 22 A 7/22 1/7 0/1 28 B 19/28 4/19 1/4 17 C 12/17 7/12 0/7 38 D 14/38 5/14 2/14 positif mikoplasma/jumlah sampel Gambar 1. Gambaran koloni Mycoplasma gallisepticum 224
Lokakarya Fungsional Non Penelid 1997 KESIMPULAN Dari hasil studi ini dapat ditarik kesimpulan bahwa tehnik isolasi mikoplasma dengan menggunakan kapas lidi steril yang dimasukkan ke dalam rongga hidung ayam hidup yang kemudian ditumbuhkan pada media mikoplasma cair dan agar dapat mengisolasi kuman mikoplasma. Hasil studi ini juga memperlihatkan bahwa tehnik uji hambatan pertumbuhan dapat mendeteksi 3 kuman Mycoplasma gallisepticum dari 17 kuman mikoplasma yang fermentasi glukosa. DAFTAR BACAAN Adler, H.E. and R. Yamamoto. 1956. Preparation of new pleuropneumonia like organism antigen for the diagnosis of chronic respiratory diseases by the agglutination test. Am. J. Vet. Res. 17 : 290-293. Frey, M.C., R.P. Hanson and D.P. Anderson. 1968. A medium for the isolation of avian mycoplasma. Am. J. Vet. Res. 29 : 2164-2171. Jordan, F.T.W. 1979. Avian Mycoplasmas. In : The Mycoplasmas volume II. Human and Animal Mycoplasmas. J.G. Tully and R.F. Whitcomb. Academic Press, New York, San Francisco, London. pp.1-40. Nelson, J.B. 1935. Cocco-bacilliform bodies associated with an infectious fowl cholera. Science 82 : 43-44. Razin, S. and E.A. Freundt. 1984. The Mycoplasmas. In : Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol.1. Ed.by N.L. Krieg and J.G. Holt. Williams and Wilkins. Baltimore/ London. pp.740-793. Yoder, H.W.Jr. 1991. Mycoplasma gallisepticum infection. In : Diseases of poultry. 9th ed. B.W. Calnek, H.J. Barnes, C.W. Beard W.M. Reid and H.W. Yoder Yr., eds. Iowa State Univ.Press, Ames, Iowa. pp. 198-212. 2 2 5