II. METODELOGI PENELITIAN 2.1. Metode Pengumpulan Data 2.1.1. Lokasi dan Waktu Penelitian Sampel nasi bungkus diambil dari penjual nasi bungkus di wilayah sekitar kampus Universitas Udayana Bukit Jimbaran. Area pengambilan sampel dibagi dalam 5 wilayah yang bertujuan agar keseluruhan wilayah kampus Universitas Udayana Bukit Jimbaran dapat terwakili. Pembagian wilayah dapat dilihat pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil survei, wilayah kampus Universitas Udayana Bukit Jimbaran terdapat 23 warung yang menjual nasi bungkus. Wilayah pertama terdapat 3 warung, wilayah kedua terdapat 4 warung, wilayah ketiga terdapat 4 warung, wilayah keempat terdapat 6 warung, dan wilayah kelima terdapat 6 warung. Analisis total mikroba, Coliform, dan Escherichia coli sampel nasi bungkus, dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Periode pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Maret- April 2011. 2.1.2. Metode Penelitian 2.1.2.1. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain media NA (Nutrient Agar), LB (Lactose broth), BGBB (Briliant Green Bile 2% Broth), EMBA (Eosin Metylene Blue agar), pewarna gram, aquades steril. Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini meliputi cooler box, cawan petri, timbangan digital, jarum ose, pipet mikro, gelas ukur, mortar dan pestle, kertas label, tabung reaksi, pisau steril, dan pinset steril. 2.1.1.2. Metode Pengambilan Sampel Sampel nasi bungkus diambil sebanyak dua kali yaitu pagi hari pukul 08.00 WITA dan siang hari pukul 13.00 WITA. Metode pengambilan sampel dilakukan 5
secara acak (Random sampling) dengan menggunakan kertas lotere (sampling acak sederhana). Setiap pembagian wilayah akan mempunyai peluang yang sama untuk dijadikan sebagai tempat pengambilan sampel (Kusriningrum, 2009). Keseluruhan warung pada setiap wilayah pengambilan sampel diberikan nomor undian, diambil 2 sampel yang berasal dari satu warung. Dilakukan pengambilan sampel sebanyak 3 kali ulangan sehingga didapatkan total 30 sampel nasi bungkus, sampel terdiri atas 15 sampel pagi hari dan 15 sampel siang hari. Sampel di ambil secara aseptik dan dimasukkan kedalam cooler box yang telah diisi dengan es batu agar sampel tidak terkontaminasi oleh bakteri lain. Selanjutnya dilakukan analisis total mikroba, Coliform, dan Escherichia coli di Laboratorium mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA UNUD. 2.2. Metode Pengerjaan Sampel 2.2.1. Analisis Total Mikroba. Analisis total mikroba dilakukan dengan menggunakan metode TPC (Total Plate Count) dengan menggunakan 6 kali seri pengenceran (Ramona dkk, 2007 dan Soemarno, 2000). Sampel nasi bungkus selanjutnya diambil per bagian komponen penyusunnya, meliputi nasi dan lauk pauk sehingga semua komponen terwakili. Sampel dihancurkan dengan mortar dan pestle steril, ditimbang sebanyak 10 gram dan dimasukkan kedalam botol yang berisi aquades 90 ml sehingga didapatkan pengenceran 10 kali. Disiapkan 5 tabung reaksi yang berisi aquades steril dan setiap tabung reaksi diberikan label 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, dan 10-6 yang menandakan faktor pengenceran. Disiapkan 6 cawan petri steril, tabung reaksi 1 diisi dengan sampel sebanyak 1 ml yang berasal dari botol pengenceran 10 kali, dihomogenkan dan didapatkan pengenceran 100 kali. Tabung reaksi 1 diambil sampel sebanyak 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi 2 dan dihomogenkan, didapatkan pengenceran 1000 kali. Selanjutnya dilakukan cara yang sama sampai dengan tabung reaksi 5 (pengenceran 1000000 kali). 6
Dari masing-masing tabung reaksi tersebut, diambil sampel sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada cawan petri yang telah disediakan dan disesuaikan dengan label yang sama antara tabung reaksi dan cawan petri. Cawan petri yang telah terisi sampel, kemudian diisi dengan media NA sampai dengan permukaan dasar cawan petri tertutup oleh media (± 15-20 ml). Cawan petri digoyang-goyangkan agar media dan sampel merata, dibiarkan beberapa saat sampai padat, kemudian diinkubasi pada inkubator pada suhu 37º C selama 24 jam dalam keadaan terbalik Pembacaan sampel yang positif dilakukan dengan cara menghitung koloni yang tumbuh pada media NA, 1 koloni yang muncul dianggap sebagai 1 sel mikroba. Rentang perhitungan total mikroba antara 30-300, hasil perhitungan kemudian dirata-ratakan. Total mikroba dihitung dengan rumus sebagai berikut : Koloni per gram = Jumlah koloni per cawan 1 Faktor pengenceran 2.2.2. Analisis Bakteri Coliform dan Escherichia coli. Metode yang digunakan dalam analisis bakteri Coliform dan Escherichia coli adalah metode MPN (Most Probable Number) seri 333. Metode MPN terdiri atas tiga langkah yaitu uji dugaan (presumptive test), uji penetapan (Confirmative test), dan uji pelengkap (compeleted test) (Ramona dkk, 2007 dan Dwijoseputro, 2003). Sampel nasi bungkus selanjutnya diambil per bagian komponen penyusunnya, meliputi nasi dan lauk pauk sehingga semua komponen terwakili. Sampel dihancurkan dengan mortar dan pestle steril, ditimbang sebanyak 10 gram dan dimasukkan kedalam botol yang berisi aquades 90 ml sehingga didapatkan pengenceran 10 kali. Sampel diambil dengan pipet ukur sebanyak 10 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang berisi media LB konsentrasi ganda. Selanjutnya diambil sampel sebanyak 1 ml dan dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi yang berisi media LB konsentrasi tunggal, diambil sampel sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi yang berisi dengan media LB konsentrasi tunggal. Tabung reaksi 7
selanjutnya diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37º C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya gas pada tabung durham. Dicatat tabung reaksi yang positif Coliform, kemudian dicocokkan dengan tabel MPN 333 (Lampiran 6). Uji penetapan (Confirmative test) dilakukan dengan cara memasukkan sampel yang diduga positif Coliform kedalam media BGBB sebanyak 1-2 ose. Sampel yang telah ditanam pada media BGBB kemudian diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37º C selama 24 jam. Hasil positif ditandai dengan adanya gas pada tabung durham. Pembacaan hasil uji penetapan dilakukan dengan cara menghitung jumlah tabung yang menunjukkan adanya gas pada tabung durham, kemudian dicocokkan dengan tabel MPN 333 (Lampiran 6). Uji penetapan dilanjutkan untuk analisis bakteri Escherichia coli. Uji penetapan dilakukan dengan cara mengambil 1-2 ose pada media BGBB yang positif Coliform, selanjutnya ditanam pada cawan petri yang berisi media Eosin Metylene Blue agar (EMBA) dengan metode cawan gores. Cawan petri yang berisi media EMBA dibagi menjadi beberapa bagian, disesuaikan dengan jumlah tabung BGBB yang positif. Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada suhu 37º C selama 24 jam. Sampel yang diduga positif Escherichia coli ditunjukkan dengan adanya koloni ukuran sedang, berwarna hijau metalik, keping, atau sedikit cembung (Soemarno, 2000). Hasil sampel yang diduga positif Escherichia coli dicatat, kemudian dicocokkan dengan tabel MPN 333 (Lampiran 6). Uji pelengkap (Completed test) dilakukan untuk melengkapi analisis Escherichia coli. Uji pelengkap dilakukan dengan metode pewarnaan gram terhadap bakteri yang diduga Escherichia coli dari media EMBA. Uji pelengkap yang positif ditandai dengan bakteri gram negatif, berwarna merah (safranin) dan sel berbentuk batang dengan perbesaran 1000 kali di bawah mikroskop (Soemarno, 2000). 2.2.3. Pengamatan Makroskopis Koloni yang tumbuh diamati secara makroskopis meliputi bentuk, ukuran, tekstur dan warna koloni dengan berpedoman pada buku petunjuk Isolasi dan Identifikasi bakteri Soemarno (2000). 8
2.2.4. Pengamatan Mikroskopis Pengamatan Mikroskopis dilakukan dengan cara membuat preparat bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan gram. Apusan bakteri dibuat pada kaca objek yang kering dan bersih. Kemudian kaca objek difiksasi di atas api bunsen dan diwarnai dengan larutan kristal violet selama 1 sampai 1,5 menit. Setelah itu kaca objek dicuci dengan air suling dan ditetesi dengan larutan lugol serta dibiarkan selama 1 menit. Kaca objek dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus kurang lebih selama 30 detik. Kemudian dicuci dengan air dan diwarnai dengan safranin selama 5 sampai 15 menit lalu dicuci lagi dengan air. Setelah itu kaca objek dikeringkan di udara atau diatas api bunsen, kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali (Hadioetomo, 1991). 2.3. Metode Pengolahan Data Data yang diperoleh selanjutnya diolah secara deskriptif komparatif yaitu dibandingkan dengan Peraturan BPOM RI Nomor HK.00.06.1.52.4011 tahun 2009 tentang penetapan batas maksimum cemaran mikroba dan zat kimia dalam makanan (Lampiran 3). 9