19 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah penelitian eksperimen, karena pada penelitian ini terdapat manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol (Nazir, 2003). B. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), dimana terdapat kelompok perlakuan dan kontrol dengan faktor lingkungan yang homogen (Nazir, 2003). Kelompok perlakuan terdiri dari empat kelas. Dimana kelompok kelas tersebut diberi perlakuan dengan pemberian ekstrak daun jati belanda sebesar 0,15 g/bb/ hari, 0,25 g/bb/hari dan 0,35 g/bb/ hari. Dengan kontrol negatif tidak diberikan maserat daun Jati Belanda. Lalu kemudian dikawinkan dengan mencit betina. Konsentrasi tersebut berdasarkan adaptasi dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yuliani (2012). Banyaknya pengulangan yang dilakukan (replikasi) diperoleh dari Federer, 1983 yaitu: T (r-1) 20 Keterangan: T = Jumlah perlakuan 4 (r-1) 20 n = Jumlah replikasi 4r-4 20 4r 24 r 6 Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah pengulangan yang dilakukan untuk setiap perlakuan ialah n > 6. Hasil tersebut menunjukan bahwah jumlah mencit yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 24 mencit jantan dan
20 24 mencit betina dara. Setiap kandang perlakuan masing-masing diisi dengan 6 ekor mecit jantan. Setelah pemberian maserat daun Jati Belanda mencit jantan dikawinkan dengan mencit betina dara. Pengawinan dilakakukan secara single mating (satu jantan satu betina). Berikut merupakan denah pengacakan mencit dan penempatan dalam kandang: Tabel 3.1. Pengaturan Pengacakan Mencit Jantan 1 2 3 4 5 6 D1 A5 B5 D5 D6 A3 7 8 9 10 11 12 C6 C2 A2 D3 B4 A1 13 14 15 16 17 18 B2 C4 D4 C3 D2 C1 19 20 21 22 23 24 D5 B2 B1 A4 A6 B6 Tabel 3.2. Peta Kandang Jantan Kandang Nomor Mencit A 2 6 9 12 22 23 B 3 11 13 20 21 24 C 7 8 14 16 18 19 D 1 4 5 10 15 17 Keterangan : A B C : Kontrol Negatif : Diberi maserat daun Jati Belanda dengan dosis 0,15 g/bb/hari : Diberi maserat daun Jati Belanda dengan dosis 0,25 g/bb/hari
21 D : Diberi maserat daun Jati Belanda dengan dosis 0,35 g/bb/hari Tabel 3.3. Pengaturan Pengacakan Mencit Betina 1 2 3 4 5 6 D6 A5 A6 B3 A4 B1 7 8 9 10 11 12 C1 D5 A2 A3 B3 D1 13 14 15 16 17 18 A1 C2 D4 B4 D2 C6 19 20 21 22 23 24 B6 B5 C3 D3 C4 C5 Tabel 3.4. Peta Kandang Betina Kandang Nomor Mencit A 2 3 5 9 10 13 B 4 6 11 16 19 20 C 7 14 18 21 23 24 D 1 8 12 15 17 22 Keterangan : A : Dikawinkan dengan Kontrol B : Dikawinkan dengan jantan yang diberi maserat daun Jati Belanda dengan dosis 0,15 g/bb/hari. C : Dikawinkan dengan jantan yang diberi maserat daun Jati Belanda dengandosis 0,25 g/bb/hari. D : Dikawinkan dengan jantan yang diberi maserat daun Jati Belanda dengandosis 0,35 g/bb/hari. C. Populasi dan Sampel
22 Populasi dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus L.) jantan dan betina galur Swiss Webster. Sedangkan sampel yang digunakan dalam penelitian adalah sperma mencit (Mus musculus L.), uterus dan anak mencit. D. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dimulai pada bulan mei hingga September 2013. Perlakuan, pemeliharan mencit, pengambilan sampel uterus, dan menghitung jumlah anak yang dilahirkan dilakukan di rumah hewan Kebun Botani Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Pembuatan maserat, penyiapan bahan yang diperlukan, dan pengambilan sampel serta pengamatan kualitas sperma dadilakukan di Laboratorium Fisiologi Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.Bandung E. Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan a. Persiapan Alat dan Bahan Dalam penelitian ini digunakan bernagai alat-alat dan bahan-bahan yang menunjang. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat pada Lampiran 12. b. Pembuatan Maserat Daun Jati Belanda (Guazuma umlifolia) Bubuk daun Jati Belanda didapat dari pemasok obat herbal Cina di daerah Pasar Baru, Bandung. Kemudian dilakukan maserasi dengan cara hydrolitic maseration atau maserasi hidrolisis. Yakni maserasi dengan menggunakan air sebagai pelarut bahan yang diekstraksi (Tandon, 2008). Pembuatan stok maserat dilakukan dengan cara melarutkan 1 bagian bubuk daun Jati Belanda ke dalam 10 bagian air. Kemudian didiamkan dalam wadah tertutup alumunium foil selama 24 jam pada suhu ruangan serta diberi agitasi 60 rpm. Setelah 24 jam, disaring dan residunya diperas. Setelah itu maserat cair diuapkan pada suhu 70 o C pada waterbath hingga berubah menjadi pasta. Pasta
23 kemudian disimpan dalam wadah tertutup dan dijadikan sebagai stok untuk dijadikan maserat (Indriani, 2006). Untuk masing-masing konsentrasi, dilakukan pengenceran dengan cara : a. Kontrol Negatif Mencit hanya diberi minum aquades setiap harinya b. 0,15 g/bb/hari 1,5 gram maserat dilarutkan dalam aquades hingga 10 ml. c. 0,25 g/bb/hari 2,5 gram maseratdilarutkan dalam aquades hingga 10 ml d. 0,35 g/bb/hari 3,5 grammaserat dilarutkan dalam aquades hingga 10 ml Penentuan dosis didasarkan pada penelitian Utomo (2008) yang menyatakan bahwa pemberian ekstrak sejumlah 6324 mg/bb/hari pada tikus putih tidak menyebabkan kematian. Jika dikonversi pada mencit, maka pemberian 903,5 mg/bb/hari atau setara dengan 0,9 g/bb/hari tidak menyebabkan kematian pada mencit (Yuliani, 2012). 2. Tahap Pelaksanaan a. Aklimatisasi Mencit Pemeliharaan hewan dilakukan di Rumah Hewan Kebun Botani Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI. Sebelum diberi perlakuan mencit di aklimatisasi pada suhu ruangan rata-rata 23-29 0 C. Periode eini dilaksanalan selama tujuh hari dengan tujuan agar hewan uji dalam keadaan kondisi lingkungan yang sama dengan kondisi linggkungan saat dia di beri perlakuan. Mencit-mencit di tempatkan pada kandang berukuran 40cm x30cm x12 cm berdasarkan perlakuan yang diberikan
24 dengan kepadatan enam ekor setiap kandang. Sama halnya dengan mencit jantan, mencit betina pun diaklimatisasi dalam kondisi yang sama. Selama aklimatisasi, semua kelompok diberi pakan mencit sejumlah 5 gram/ekor, dan minum secara ad libitum. Botol minuman dibersihkan tiap dua hari sekali dan diisi ulang dengan air yang baru apabila air telah habis. Kandang dibersihkan sebanyak 2 kali dalam 1 minggu untuk menjaga kebersihan dan kesehatan hewan uji. Keadaan selama aklimatisasi dan perlakuan dikontrol pada kisaran lingkungan yang tetap dengan tujuan agar hewan uji beradaptasi dengan kondisi yang akan ditempati selama percobaan. b. Penentuan Dosis Dosis yang diberikan pada penelitian ini terdiri dari 0,15 g/bb/hari, 0,2 5g/bb/hari, 0,35 g/bb/hari dan kontrol negatif yang tidak menggunakan maserat daun jati belanda. Dengan pertimbangan dari penelitian Utomo (2008) yang menyatakan bahwa pemberian ekstrak alkohol Jati Belanda sejumlah 6314 mg/kg BB tidak memberikan kematian pada tikus. Jika dikonversi pada mencit, maka pemberian 903,5 mg/bb/hari atau setara dengan 0,9 g/bb/hari tidak menyebabkan kematian pada mencit (Yuliani, 2012). Dosis optimum yang berpengaruh pada penurunan kualitas jumlah sperma adalah 0,25 g/bb/hari dari dosis 0,1 g/bb/hari, 0,15 g/bb/hari, 0,2 g/bb/hari, 0,25 g/bb/hari (Yuliani, 2012). c. Pemberian Maserat Daun Jati Belanda Pemberian maserat daun Jati Belanda dilakukan selama 14 hari menggunakan jarum gavage, dimana hewan percobaan dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan yaitu dengan dosis 0 g/bb/hari, 0.15 g/bb/hari/, 0.25 g/bb/hari dan 0,35 g/bb/hari. Maserat daun Jati Belanda yang diberikan sebanyak 0.5 ml/hari setiap harinya untuk masing-masing dosis perlakuan. d. Pemeriksaan Fase Estrus Pada Mencit
25 Pemeriksaan Fase Estrus pada mencit betina dilakukan dengan cara membuat preparat apusan vagina. Pertama ambil seekor mencit betina, kemudian pegang dengan tangan kiri, ibu jari dan telunjuk jari memegang tengkuknya atau leher dosrsal. Dengan jari tengah, jari manis, dan kelingking memegang badan ekor. Bagian vagina disemprotkan NaCl 0,9% menggunakan pipet yang tumpul, kemudian dihisap sampai 3 sampai 4 kali dengan hati-hati dan perlahan.cairan pada pipets dari hasil penyemprotan/pengisapan kemudian diteteskan ke gelas objek 1-2 tetes. Biarkan hingga kering dan tetesi dengan larutan pewarna eosin 1 %. Biarkan 5 sampai 10 menit, bilas dengan aquadest. Tutup dengan glass penutup dan amati dibawah mikroskop. Pada fase estrus ini ditandai dengan adanya sel kornifikasi atau sel epitel menanduk yang sangat banyak. Sel epitel dengan inti berdegenerasi. e. Pengawinan Mencit Jantan Yang Telah Diberi Perlakuan Dengan Mencit Betina Dara Pengawinan dilakukan pada mencit jantan yang telah diberi perlakuan dengan mencit betina yang sedang pada masa estrus. Satu ekor mencit jantan dari setiap dosis perlakuan ditempatkan dengan satu mencit betina yang sedang dalam masa estrus. Mencit betina diperiksa setiap harinya untuk menentukan kebuntingannya. Adanya sumbat vagina menandai telah terjadinya kopulasi dan dihitung sebagai umur kebuntingan 0 (H-0). Masa kebuntingan mencit berkisar selama19-21 hari. 3. Tahap Pengambilan Sampel Dan Analisis Kualitas Sperma a. Jumlah Anak Mencit Yang Lahir Penghitungan jumlah anak mencit dilakukan berdasarkan berapa jumlah anak mencit yang dilahirkan oleh induk betina mencit yang sebelumnya dikawinkan dengan induk jantan yang di beri perlakuan. H-0 kebuntingan ditetapkan pada saat
26 sudah terjadinya kopulasi antara mencit jantan dan mencit betina yang dapat dilihat dengan adanya sumbat vagina serta terdapatnya sperma pada apusan vagina mencit betina. Masa kebuntingan mencit betina berkisar selama 19-21 hari. b. Jumlah Tapak Implantasi Penghitungan jumlah tapak implantasi dilakukan dengan cara membedah mencit, memisahkan organ uterusnya. Organ uterus yang telah dipidahkan diberi larutan NaCl 0,9% kemudian di tetesi larutan Kalium Permangangat sebagai zat pewarna untuk memudahkan menghitung titik implantasi yang ada. Pembedahan dilakukan stelah mencit betina melahirkan. Untuk mencit yang tidak mengalami kelahiran di bedah pada hari ke 21 pasca terjadinya kopulasi. c. Penghitungan Konsentrasi Sperma Pengambilan sampel sperma dilakukan setelah perlakuan selama 14 hari. Hewan uji dimatikan dengan cara dislokasi leher kemudian dibedah dan dipisahkan organ reproduksinya. Suspensi sperma yang digunakan berasal dari cauda epididiymis. Organ reproduksi dipisahkan dari organ yang lainnya dan diletakan pada cawan petri berisi NaCl 0,9%, kemudian bagian cauda epididiymis dipisahkan dengan cara memotong bagian proksimal korpus epididimis dan bagian distal vas deferens. Bagian cauda epididiymis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9%. Cauda epididiymis dipotong-potong kemudian ditekan-tekan menggunakan sonde sehingga cairan pada epididimis tersebut keluar dan tersuspensi dengan NaCl 0,9% dan homogenkan suspensi yang telah didapat. Kemudian ambil suspensi sebanyak 10 µl lalu diteteskan ke dalam haemocytometer Neubauer lalu. Serta ditutup dengan cover glass untuk selanjutnya diamati dan dihitung konsentrasi sperma yang ada di bawah mikroskop cahaya (Machmudin, et al., 2008). Jumlah sperma/ml suspensi semen dari kauda epididimis dengan menggunakan rumus sebagai berikut.
27 Jumlah sperma=n/2x10 5 sperma/ml (Suparni, 2009) Keterangan: N=jumlah sperma pada kotak A, B, C, D, dan E (improved neubauer haemocytometer). A D E B C Gambar 3.1 Improved Neubauer(Haemocytometer) (Sumber: Perez, 2006) d. Pengamatan Motilitas Sperma Pengamatan motilitas spermatozoa dibagi dalam dua kriteria, krtiteria A (bergerak maju) dan B (bergerak di tempat) berdasarkan penampakan spermatozoa (Ashfahani, et al., 2008; Yatim, 1994). Penghitungan motalitas spermatozoa dihitung dengan cara menghitung presentase (%) per lima bidang pandang pada haemocytometer. e. Pengamatan Abnormalitas Sperma Pengamatan abnormalitas sperma dilakukan dengan cara pengamatan morfologi sperma dari lima bidang pandang pada haemocytometer dengan mikroskop binokuler pada pembesaran 400x. Kemudian dilakukan penghitungan dan menghitung jumlah presentase (%) jumlah sperma abnormal. Pengamatan morfologi
28 abnormalitas sperma kemudian dilanjutkan dengan cara pembuatan apusan sperma dengan pewarnaan eosin. Cairan suspensi yang telah diamati diteteskan pada kaca objek, kemudian dengan kaca objek lainnya smearsuspensi sperma. Hasil smeardidiamkan kering pada suhu ruangan kemudian difiksasi dengan alkohol 96%, kemudian dibiarkan hingga kering kembali. Hasil smearyang telah kering ditetesi dengan eosin 1%, kemudian dibiarkan mengering serta dibilas dengan menggunakan akuades. Preparat ditetesi minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 400x. f. Pengamatan Kecepatan Sperma Pengamatan kecepatan spermatozoa dilakukan dengan cara menghitung waktu yang diperlukan oleh 1 ekor sperma untuk menempuh 8 kotak (200 µm) Hemacytometer Nebauer. Setiap pengamatan kecepatan sperma dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan, yang berasal dari sperma yang bergerak lurus (Ashfahani, et al., 2008). 4. Analisis Data Data yang didapatkan diuji homogenitas dan normalitasnya. Uji normalitas menggunakan uji Test of Normality (Kolmogorov-Smirnov) dan uji homogenitas menggunakan Test of Homogeneity of Variances (Levene Statistic). Data yang terdistribusi normal dan bervarian homogen dianalisis secara statistik parametrik yaitu, Analisis varian (ANOVA). Sedangkan data non parametrik akan dilanjutkan dengan uji Kruskall-Wallis. Uji lanjutan yang di gunakan adalah post hocktukey HSD a. Analisis data menggunakan Software SPSS 20 for Windows. 5. Alur Penelitian
29 Urutan penjelasanprosedur penelitian yang dilakukan sebagai berikut : TAHAPAN Observasi Literatur Studi Lapangan Pembuatan Proposal TAHAPAN PRAPENELITIAN Pembuatan Maserat Daun Jati Belanda Persiapan Alat dan Bahan Aklimatisasi Persiapan Kandang Pemeliharaan mencit TAHAP PERLAKUAN Pemberian maserat Daun Jati Belanda terhadap mencit jantan (Dosis 0.0 g/bb/hari; 0.15 g/bb/hari; 0.25 g/bb/hari; 0.35 g/bb/hari sebanyak 0.5 ml/ekor mencit/hari selama 14 hari MengawinkanMencit Jantan dari Setiap Perlakuan dengnan Mencit Betina Dara. Penghitungan Jumlah Sperma, motilitas sperma dan abnormalitas sperm/ml suspensi semen Cauda epididiymis Menghitung Jumlah Titik ANALISIS DATA Pratiwi Wulandari, Implantasi 2014 dan Anak Lahir Universitas Pendidikan Indonesia repository.upi.edu PENYUSUNAN perpustakaan.upi.edu LAPORAN PENELITIAN (SKRIPSI)
30 Gambar 3.2. Alur Penelitian