Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous II. BIOSINTESIS SENYAWA FENOLIK Biosintesis senyawa fenolik sebagian besar terjadi di sitoplasma dan diawali melalui jalur shikimate (Gambar 2.1) (Wink 2010). Asam 3 dehidrosikimat merupakan produk antara jalur shikimate dari substrat karbohidrat yang penting dalam biosintesis senyawa fenolik. Asam galat (C6 C1, Gambar 1.3a) sebagai contoh, disintesis dari asam 3 dehidrosikimat (Gambar 2.2).. Asam galat kemudian dapat diubah menjadi β glukogallin. Senyawa antara ini kemudian mengalami galloilasi sehingga terbentuk penta O galloil glukosa. Galloilasi lebih lanjut terhadap penta O galloil tanin glukosa akan menghasilkan senyawa senyawa dari golongan yang dapat terhidrolisis, yaitu kelompok gallotanin dan ellagitanin (Cronizer et al. 2006). Gambar 2.1. Produk jalur shikimate dan asam malonat (Cronizer et al. 2006). 23
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous Di tanaman, asam 3 dehidrosikimat selain diubah menjadi asam galat juga digunakan untuk menyintesis L fenilalanin dan mulai memasuki jalur fenilpropanoid. Melalui bantuan enzim fenilalanin amonia liase, L fenilalanin dikonversi menjadi asam sinamat (C6 C3). Pada kondisi tanaman mengalami penyerangan oleh jamur, bakteri, atau virus, tanaman akan memproduksi asam salisilat (C6 C1) sebagai senjata pertahanan. Untuk menyintesis asam salisilat, asam sinamat dikonversi terlebih dahulu menjadi asam benzoat. Enzim asam benzoat 2 hidroksilase kemudian mengatalisi perubahan asam benzoat menjadi asam salisilat (Gambar 2.2) (Cronizer et al. 2006). Pada kondisi normal, asam sinamat diubah menjadi asam p koumarat (C6 C3, Gambar 1.5a) atau p koumaroil CoA dengan bantuan enzim sinamat 4 hidroksilase atau p koumarat:coa ligase. Asam p koumarat kemudian dikonversi menjadi asam kafeat (C6 C3). Pada awalnya, diketahui bahwa asam kafeat merupakan prekursor langsung untuk sintesis asam 5 Okafeoilquinat yang banyak terdapat di buah dan sayuran. Namun hasil penelitian di bidang biologi molekular terbaru menyebutkan bahwa rute utama dalam sintesis senyawa tersebut adalah melalui p koumaroil CoA (Gambar 2.2) (Cronizer et al. 2006). Asam kafeat yang didapat dari hasil konversi asam p koumarat kemudian diubah menjadi asam ferulat (C6 C3) dengan bantuan enzim asam kafeat/5 hidroksiferulat O metiltransferase. Asam ferulat yang terbentuk dapat diubah menjadi asam sinapat (C6 C3) melalui produk antara 5 hidroksiferulat (Gambar 2.2). Kedua asam tersebut, ferulat dan sinapat, merupakan prekursor untuk sintesis lignin (Cronizer et al. 2006). 24
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous FAL, fenilalanin amonia liase; AB2H, asam benzoat 2 hidroksilase; S4H, sinamat 4 hidroksilase; GT, galloiltransferase; 4CL, p koumarat:coa ligase; KOMT 1, asam caffeat/5 hydroksiferulat O metiltransferase; F5H, ferulat 5 hidroksilase; ACoAC. Gambar 2.2 Biosintesis fenolik (Cronizer et al. 2006). 25
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous SS, stilben sintase; KS, kalkon sintase; KR, kalkon reduktase; CHI, kalkon isomerase; IFS, isoflavon sintase; FNS, flavon sintase; F3H, flavanon 3 hidroksilase; FLS, flavonol sintase; F3 H, flavonol 3 hidroksilase; IOMT, isoflavon Ometiltransferase; DFR, dihidroflavonol 4 reduktase; LDOX, leukosianidin deoksigenase; LAR, leukosianidin 4 reduktase; ANR, antosianidin reductase. Gambar 2.3. Biosintesis flavonoid dan stilben (Cronizer et al. 2006). Flavonoid dan Stilben 26
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous Flavonoid dan stilben memiliki jalur yang sedikit berbeda dari senyawa fenolik lainnya. Jika senyawa fenolik lain hanya diawali dari jalur shikimate, maka pada biosintesis flavonoid dan stilben melibatkan juga produk dari jalur asam malonat (Gambar 2.1). Flavonoid (Gambar 1.7) memiliki dua cincin benzen yang dihubungkan oleh tiga buah atom karbon (C6 C3 C6). Cincin benzen B dan jembatan C3 pada flavonoid berasal dari p koumaril CoA yang merupakan produk turunan dari asam 3 dehidrosikimat dari jalur shikimate (Gambar 2.1). Produk dari jalur malonat, yaitu malonil CoA, digunakan sebagai cincin A pada flavonoid. Seperti halnya flavonoid, stilben juga merupakan produk hasil kondensasi p koumaril CoA dan malonil CoA (Cronizer et al. 2006). Malonil CoA dari jalur asam malonat didapat dari asetil CoA. Perubahan asetil CoA menjadi malonil CoA dibantu oleh enzim asetil CoA karboksilase. Sebenarnya asetil CoA dapat terbentuk di berbagai bagaian sel tumbuhan, seperti mitokondria, plastid, peroksisom, dan sitosol. Namun demikian, asetil CoA untuk sintesis malonil CoA pada biosintesis flavonoid dan stilben terbentuk di sitosol. Di sitosol, enzim ATP sitrat liase mengonversi sitrat, ATP, dan Co A menjadi asetil CoA, oksaloasetat, ADP, dan inorganik fosfat (Davies dan Schwinn 2006). A. Flavonoid Gambar 2.3 memperlihatkan tahapan tahapan biosintesis flavonoid. Kalkon sintase merupakan enzim yang mengatalis reaksi antara 1 molekul p koumaril CoA dengan 3 molekul malonil CoA membentuk narigenin kalkon. Pada beberapa tanaman, meskipun sangat jarang, malonil CoA yang digunakan untuk menyintesis kalkon ini dapat digantikan oleh kafeoil CoA atau feruloil CoA 27
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous (Davies dan Schwinn 2006). Jika enzim kalkon sintase berinteraksi dengan enzim kalkon reduktase, maka produk yang dihasilkan adalah 2 isoliquiritigenin. Perbedaan antara kedua senyawa tersebut (narigenin kalkon dan 2 isoliquiritigenin) yaitu tidak terdapatnya gugus 2 hidroksi pada 2 isoliquiritigenin. Narigenin kalkon dikonversi menjadi narigenin oleh enzim kalkon isomerase (CHI) tipe 1. Terdapat dua jenis enzim kalkon isomerase (CHI) pada tanaman, yaitu CHI tipe 1 dan CHI tipe 2. CHI tipe 1 adalah enzim yang terdapat di semua jenis tanaman, baik itu kacang kacangan maupun bukan kacang kacangan. Enzim ini hanya dapat mengonversi narigenin kalkon menjadi narigenin (flavanon, C15). Sebaliknya, enzim CHI tipe 2 yang hanya terdapat di tanaman kacang kacangan tidak hanya dapat mengonversi narigenin kalkon menjadi narigenin, namun juga dapat mengonversi 2 isoliquiritigenin menjadi liquiritigenin (flavon, C15) (Gambar 2.3) (Cronizer et al. 2006). Flavanon naringenin dan flavon liquiritigenin merupakan bahan baku untuk memproduksi falvonoid dari golongan isoflavon. Narigenin dan liquiritigenin berturut turut dikonversi menjadi isoflavon genistein dan daidzein oleh enzim flavon sintase. Metilasi pada atom karbon nomor 7 dan atom oksigen yang terikat di karbon nomor 4 (cara penomoran dapat dilihat pada Gambar 1.7c) pada daidzein menghasilkan senyawa isofalvon lainnya, secara berturut turut yaitu isoformonetin dan formononetin. Reaksi metilasi tersebut dikatalisis oleh enzim isoflavon Ometiltransferase (Gambar 2.3) (Cronizer et al. 2006). Reaksi oksidasi terhadap naringenin dapat menghasilkan senyawa flavonoid dari golongan flavon. Reaksi ini dibantu dengan enzim flavon sintase dan membutuhkan hadirnya NADPH serta 28
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous oksigen. Senyawa flavon yang dihasilkan yaitu apigenin (Gambar 2.3) (Cronizer et al. 2006). Selain menjadi substrat untuk senyawa dari golongan isoflavon dan flavon, naringenin juga digunakan sebagai subtrat untuk membetuk senyawa dari golongan dihidroflavonol/ flavanonol. Enzim flavanon 3 hydroksilase membantu terjadinya reaksi hidroksilasi naringenin pada atom karbon nomor 3 membentuk senyawa dihidrokaemferol (flavanonol). Hidroksilasi lebih lanjut terhadap dihidrokaemferol pada atom C nomor 3 yang dikatalisis oleh enzim flavonol 3 hidroksilase menghasilkan senyawa dihidroquersetin (flavanonol). Selain dihidroksilasi, dihidrokaemferol juga dapat dikonversi menjadi kaemferol yang merupakan senyawa dari golongan flavonol melalui pembentukan ikatan rangkap dengan katalis enzim flavonol sintase (Gambar 2.3) (Cronizer et al. 2006). Senyawa flavonoid dari golongan leukosianidin dibentuk dari dihidroquersetin dengan katalis enzim dihidroflavonol 4 reduktase. Golongan leukosianidin ini merupakan senyawa penting pada tanaman dalam memproduksi tanin terkondensasi. Enzim leukosianidin 4 reduktase secara langsung mengatalisis perubahan leukosianidin menjadi (+) katekin (golongan flavan 3ol). Isomer (+) katekin, yaitu ( ) epikatekin, merupakan senyawa dari golongan flavan 3ol yang banyak terdapat di tanaman, terutama teh. Berbeda dengan isomernya, ( ) epikatekin tidak secara langsung terbentuk dari leukosianidin. Pertama, dengan katalis enzim leukosianidin deoksigenase leukosianidin dikonversi terlebih dahulu menjadi sianidin (golongan antosianidin). Sianidin inilah yang kemudian diubah menjadi ( ) epikatekin oleh enzim antosianidin reduktase. Tanin terkondensasi didapat dari hasil polimerasi leukosianidin dan flavan 3ol (Cronizer et al. 2006). 29
Senyawa Fenolik pada Sayuran Indigenous Enzim enzim yang terlibat dalam biosintesis flavonoid pada umumnya merupakan enzim yang berlokasi di sitosol tanaman. Produk akhir dari biosintesis flavonoid tersebut kemudian diangkut menuju subselular atau extraselular. Flavonoid yang terlibat sebagai pigmen dalam tanaman kebanyakan diangkut menuju vakuola (Davies dan Schwinn 2006). B. Stilben Seperti halnya flavonoid, stilben juga disintesis dengan menggunakan satu molekul p komaroil CoA dan tiga molekul malonil CoA (Gambar 2.3). Jika dalam sintetis flavonoid enzim yang berperan dalam mengondensasi keempat molekul tersebut adalah enzim kalkon sintase, maka pada biosintesis stilben, enzim yang digunakan adalah stilben sintase. Enzim stilben sintase dan kalkon sintase memiliki struktur kimia yang sangat mirip sehingga dipercaya kedua enzim tersebut merupakan enzim dari golongan yang sama, yaitu enzim poliketida. Perbedaan pada kedua enzim tersebut adalah enzim kalkon sintase selalu terdapat di jaringan tanaman, sebaliknya enzim stilben sintase baru terbentuk jika terinduksi oleh tekanan lingkungan. Tekanan lingkungan yang dimaksud seperti radiasi sinar UV, trauma, dan infeksi (Cronizer et al. 2006). 30