Kolokium Liliani Isna Devi G34080057 Liliani Isna Devi, Achmad Farajallah, dan Dyah Perwitasari. 2011. Identifikasi Larva Famili Gobiidae dari Sungai Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode. Kolokium disampaikan Tanggal 10 Nopember 2011, Departemen Biologi FMIPA IPB PENDAHULUAN Latar Belakang Ikan Gobi merupakan anggota famili Gobiidae dengan ciri sirip ventral menyatu dan membentuk piringan penghisap. Hal ini memungkinkan mereka untuk tetap pada posisinya di perairan dengan arus yang deras (Kottelat M & Whitten AJ 1993). Famili Gobiidae dikelompokkan ke dalam spesies diadromous (bermigrasi antara laut dan air tawar) yang bersifat katadromous, yaitu bermigrasi dari air tawar ke laut untuk melakukan pemijahan. Di laut, telur akan menetas dan berkembang menjadi larva, dan selanjutnya akan berkembang menjadi dewasa di sungai. Keberadaan larva ikan terkait dengan parameter ph, temperatur, salinitas, kecepatan arus, plankton page 1 / 14
dan turbiditas (McDowall 2007). Daerah estuaria merupakan perairan yang subur dan berfungsi sebagai habitat untuk berlindung, mencari makan, zona reproduksi, zona asuhan, dan zona pembesaran bagi berbagai jenis ikan, baik jenis-jenis ikan yang menetap maupun migran. Komposisi jenis dan jumlah individu larva ikan di daerah estuari selalu berfluktuasi. Hal ini berkaitan dengan migrasi ikan yang mencari kondisi lingkungan sesuai dan dipengaruhi pula oleh kondisi pasang surut (Subiyanto et al. 2008). Identifikasi spesies dari larva ikan sulit dilakukan berdasarkan ciri morfologi yang biasa dilakukan secara konvensional. Selain itu, sebagian besar panduan identifikasi morfologi ikan berdasarkan pada ikan dewasa. Dalam penelitian yang direncanakan ini, kami akan mengaplikasikan metode identifikasi ikan menggunakan DNA Barcode. Penggunaan DNA Barcode sebagai pengenal suatu spesies dapat mengidentifikasi berbagai tingkat kehidupan hewan (Victor et al. 2009). DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan tepat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). Ruas DNA yang banyak digunakan sebagai barcode adalah sekitar 700 bp di bagian ujung 5 gen cytochrome oxidase 1 (COI) dalam genom mitokondria yang dapat mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Ward et al. 2005), baik interspesifik maupun intraspesifik (Hebert et al. 2003). Teknik ini tidak hanya mempunyai kegunaan yang potensial untuk mengidentifikasi spesies yang telah dikenali tapi juga dapat menemukan spesies baru (Hajibabaei et al. 2005), serta dapat mengungkapkan fenomena spesies cryptic. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies anggota famili Gobiidae dalam kumpulan ikan di estuari Sungai Kedurang, Bengkulu menggunakan DNA Barcode. Waktu dan Tempat page 2 / 14
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan November 2011 sampai Maret 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. BAHAN DAN METODE Sampel Ikan Kumpulan ikan yang diambil dari estuari sungai Kedurang Bengkulu merupakan koleksi Dr. Achmad Farajallah IPB. Kumpulan ikan diambil satu kali pada minggu kedua bulan Juli 2011 dan dua kali pada minggu keempat bulan Agustus 2011. Semua sampel disimpan dalam alkohol 70% yang mengandung EDTA 10 mm. Idenfifikasi sampel Kumpulan larva ikan disortir berdasarkan ada tidaknya sirip cakram ventral sebagai ciri pembeda anggota Famili Gobiidae. Penyortiran ikan lebih lanjut akan dilakukan berdasarkan bentuk kepala, bentuk tubuh, bentuk mata dan pola melanophore. Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel jaringan yang digunakan sebagai sumber DNA adalah jaringan otot dari seluruh bagian tubuh, terutama bagian tubuh belakang sejak anus sampai ekor. Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal tissue (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas gen CO1 mtdna akan dilakukan dengan menggunakan primer universal gen CO1 pada ikan ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik untuk setiap pasangan primer. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing page 3 / 14
Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai dengan desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genbank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data famili Gobiidae yang terdapat pada Genbank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Sedangkan analisis kekerabatan menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. DAFTAR PUSTAKA Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. Hajibabaei et al. 2005. DNA barcode distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971 Hebert PDN, Ratnasingham S, dan dewaard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96 99. Kottelat M, Whitten AJ. 2003. Freshwater Fishes of Weatern Indonesi and Sulawesi. Germany: Zoologische Staatssammlung. page 4 / 14
McDowall RM. 2007. On amphidromy, a distinct form of diadromy in aquatic organism. Fish and Fisheries 8: 1-13. Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Subiyanto, Ruswahyuni, Cahyono DG. 2008. Komposisi dan distribusi ikan pelagis di estuaria Pelawangan Timur, Segera Anakan, Cilacap. Saintek Perikanan 4:62-68. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Victor BC, Hanner R, Shivji M, Hyde J. 2009. Identification of the larval and juvenile stages of the Cubera Snapper, Lutjanus cyanopterus using DNA barcoding. Zootaxa 2215:24-36. Ward RD, Zemlak TS, Innes B, dan Last P. 2005. DNA Barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of The Royal Society 360: 1847-1857. Liliani Isna Devi, Achmad Farajallah, dan Dyah Perwitasari. 2011. Identifikasi Larva Famili Gobiidae dari Sungai Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode. Kolokium disampaikan Tanggal 10 Nopember 2011, Departemen Biologi FMIPA IPB page 5 / 14
PENDAHULUAN Latar Belakang Ikan Gobi merupakan anggota famili Gobiidae dengan ciri sirip ventral menyatu dan membentuk piringan penghisap. Hal ini memungkinkan mereka untuk tetap pada posisinya di perairan dengan arus yang deras (Kottelat M & Whitten AJ 1993). Famili Gobiidae dikelompokkan ke dalam spesies diadromous (bermigrasi antara laut dan air tawar) yang bersifat katadromous, yaitu bermigrasi dari air tawar ke laut untuk melakukan pemijahan. Di laut, telur akan menetas dan berkembang menjadi larva, dan selanjutnya akan berkembang menjadi dewasa di sungai. Keberadaan larva ikan terkait dengan parameter ph, temperatur, salinitas, kecepatan arus, plankton dan turbiditas (McDowall 2007). Daerah estuaria merupakan perairan yang subur dan berfungsi sebagai habitat untuk berlindung, mencari makan, zona reproduksi, zona asuhan, dan zona pembesaran bagi berbagai jenis ikan, baik jenis-jenis ikan yang menetap maupun migran. Komposisi jenis dan jumlah individu larva ikan di daerah estuari selalu berfluktuasi. Hal ini berkaitan dengan migrasi ikan yang mencari kondisi lingkungan sesuai dan dipengaruhi pula oleh kondisi pasang surut (Subiyanto et al. 2008). Identifikasi spesies dari larva ikan sulit dilakukan berdasarkan ciri morfologi yang biasa dilakukan secara konvensional. Selain itu, sebagian besar panduan identifikasi morfologi ikan berdasarkan pada ikan dewasa. Dalam penelitian yang direncanakan ini, kami akan mengaplikasikan metode identifikasi ikan menggunakan DNA Barcode. Penggunaan DNA Barcode sebagai pengenal suatu spesies dapat mengidentifikasi berbagai tingkat kehidupan hewan (Victor et al. 2009). DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan tepat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). Ruas DNA yang banyak digunakan sebagai barcode adalah sekitar 700 bp page 6 / 14
di bagian ujung 5 gen cytochrome oxidase 1 (COI) dalam genom mitokondria yang dapat mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Ward et al. 2005), baik interspesifik maupun intraspesifik (Hebert et al. 2003). Teknik ini tidak hanya mempunyai kegunaan yang potensial untuk mengidentifikasi spesies yang telah dikenali tapi juga dapat menemukan spesies baru (Hajibabaei et al. 2005), serta dapat mengungkapkan fenomena spesies cryptic. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies anggota famili Gobiidae dalam kumpulan ikan di estuari Sungai Kedurang, Bengkulu menggunakan DNA Barcode. Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan November 2011 sampai Maret 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. BAHAN DAN METODE Sampel Ikan Kumpulan ikan yang diambil dari estuari sungai Kedurang Bengkulu merupakan koleksi Dr. Achmad Farajallah IPB. Kumpulan ikan diambil satu kali pada minggu kedua bulan Juli 2011 dan dua kali pada minggu keempat bulan Agustus 2011. Semua sampel disimpan dalam alkohol 70% yang mengandung EDTA 10 mm. Idenfifikasi sampel Kumpulan larva ikan disortir berdasarkan ada tidaknya sirip cakram ventral sebagai ciri pembeda anggota Famili Gobiidae. Penyortiran ikan lebih lanjut akan dilakukan berdasarkan bentuk kepala, bentuk tubuh, bentuk mata dan pola melanophore. Ekstraksi dan Isolasi DNA page 7 / 14
Sampel jaringan yang digunakan sebagai sumber DNA adalah jaringan otot dari seluruh bagian tubuh, terutama bagian tubuh belakang sejak anus sampai ekor. Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal tissue (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas gen CO1 mtdna akan dilakukan dengan menggunakan primer universal gen CO1 pada ikan ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik untuk setiap pasangan primer. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai dengan desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genbank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data famili Gobiidae yang terdapat pada Genbank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Sedangkan analisis kekerabatan menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. DAFTAR PUSTAKA Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. page 8 / 14
Hajibabaei et al. 2005. DNA barcode distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971 Hebert PDN, Ratnasingham S, dan dewaard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96 99. Kottelat M, Whitten AJ. 2003. Freshwater Fishes of Weatern Indonesi and Sulawesi. Germany: Zoologische Staatssammlung. McDowall RM. 2007. On amphidromy, a distinct form of diadromy in aquatic organism. Fish and Fisheries 8: 1-13. Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Subiyanto, Ruswahyuni, Cahyono DG. 2008. Komposisi dan distribusi ikan pelagis di estuaria Pelawangan Timur, Segera Anakan, Cilacap. Saintek Perikanan 4:62-68. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Victor BC, Hanner R, Shivji M, Hyde J. 2009. Identification of the larval and juvenile stages of the Cubera Snapper, Lutjanus cyanopterus using DNA barcoding. Zootaxa 2215:24-36. Ward RD, Zemlak TS, Innes B, dan Last P. 2005. DNA Barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of The Royal Society 360: 1847-1857. page 9 / 14
Liliani Isna Devi, Achmad Farajallah, dan Dyah Perwitasari. 2011. Identifikasi Larva Famili Gobiidae dari Sungai Kedurang, Bengkulu melalui DNA Barcode. Kolokium disampaikan Tanggal 10 Nopember 2011, Departemen Biologi FMIPA IPB PENDAHULUAN Latar Belakang Ikan Gobi merupakan anggota famili Gobiidae dengan ciri sirip ventral menyatu dan membentuk piringan penghisap. Hal ini memungkinkan mereka untuk tetap pada posisinya di perairan dengan arus yang deras (Kottelat M & Whitten AJ 1993). Famili Gobiidae dikelompokkan ke dalam spesies diadromous (bermigrasi antara laut dan air tawar) yang bersifat katadromous, yaitu bermigrasi dari air tawar ke laut untuk melakukan pemijahan. Di laut, telur akan menetas dan berkembang menjadi larva, dan selanjutnya akan berkembang menjadi dewasa di sungai. Keberadaan larva ikan terkait dengan parameter ph, temperatur, salinitas, kecepatan arus, plankton dan turbiditas (McDowall 2007). Daerah estuaria merupakan perairan yang subur dan berfungsi sebagai habitat untuk berlindung, mencari makan, zona reproduksi, zona asuhan, dan zona pembesaran bagi berbagai jenis ikan, baik jenis-jenis ikan page 10 / 14
yang menetap maupun migran. Komposisi jenis dan jumlah individu larva ikan di daerah estuari selalu berfluktuasi. Hal ini berkaitan dengan migrasi ikan yang mencari kondisi lingkungan sesuai dan dipengaruhi pula oleh kondisi pasang surut (Subiyanto et al. 2008). Identifikasi spesies dari larva ikan sulit dilakukan berdasarkan ciri morfologi yang biasa dilakukan secara konvensional. Selain itu, sebagian besar panduan identifikasi morfologi ikan berdasarkan pada ikan dewasa. Dalam penelitian yang direncanakan ini, kami akan mengaplikasikan metode identifikasi ikan menggunakan DNA Barcode. Penggunaan DNA Barcode sebagai pengenal suatu spesies dapat mengidentifikasi berbagai tingkat kehidupan hewan (Victor et al. 2009). DNA Barcode telah menarik perhatian dunia sebagai sistem yang mengidentifikasi spesies secara cepat dan tepat dengan menggunakan urutan pendek DNA (Meier et al. 2006). Ruas DNA yang banyak digunakan sebagai barcode adalah sekitar 700 bp di bagian ujung 5 gen cytochrome oxidase 1 (COI) dalam genom mitokondria yang dapat mengidentifikasi hampir semua spesies hewan (Ward et al. 2005), baik interspesifik maupun intraspesifik (Hebert et al. 2003). Teknik ini tidak hanya mempunyai kegunaan yang potensial untuk mengidentifikasi spesies yang telah dikenali tapi juga dapat menemukan spesies baru (Hajibabaei et al. 2005), serta dapat mengungkapkan fenomena spesies cryptic. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi komposisi spesies anggota famili Gobiidae dalam kumpulan ikan di estuari Sungai Kedurang, Bengkulu menggunakan DNA Barcode. Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan November 2011 sampai Maret 2012 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, IPB. page 11 / 14
BAHAN DAN METODE Sampel Ikan Kumpulan ikan yang diambil dari estuari sungai Kedurang Bengkulu merupakan koleksi Dr. Achmad Farajallah IPB. Kumpulan ikan diambil satu kali pada minggu kedua bulan Juli 2011 dan dua kali pada minggu keempat bulan Agustus 2011. Semua sampel disimpan dalam alkohol 70% yang mengandung EDTA 10 mm. Idenfifikasi sampel Kumpulan larva ikan disortir berdasarkan ada tidaknya sirip cakram ventral sebagai ciri pembeda anggota Famili Gobiidae. Penyortiran ikan lebih lanjut akan dilakukan berdasarkan bentuk kepala, bentuk tubuh, bentuk mata dan pola melanophore. Ekstraksi dan Isolasi DNA Sampel jaringan yang digunakan sebagai sumber DNA adalah jaringan otot dari seluruh bagian tubuh, terutama bagian tubuh belakang sejak anus sampai ekor. Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal tissue (Geneaid). Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi ruas gen CO1 mtdna akan dilakukan dengan menggunakan primer universal gen CO1 pada ikan ( http://ibol.org/resources/barcode-library/). Kondisi PCR akan dioptimasikan untuk memperoleh ruas DNA target atau amplikon yang spesifik untuk setiap pasangan primer. Pengujian amplikon akan dilakukan dengan metode polyacrilamiide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang dilanjutkan dengan pewarnaan sensitive perak (Byun et al. 2009). Perunutan Produk PCR dan Analisis DNA Sequensing Amplikon yang berupa pita tunggal di atas gel poliakrilamid dan berukuran sesuai dengan desain primer akan dimurnikan untuk dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing. Proses PCR untuk sequencing menggunakan primer yang sama dengan page 12 / 14
amplifikasi sebelumnya dengan metode big dye terminator cycle sequencing. Runutan nukleotida yang diperoleh akan diedit kemudian saling disejajarkan dengan runutan nukleotida referensi dari Genbank menggunakan program Clustal W 1.8 yang terdapat dalam program MEGA versi 4.00 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida referensi diperoleh berdasarkan data famili Gobiidae yang terdapat pada Genbank dengan cara hasil sekuensing dijadikan input dalam BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Analisis keragaman nukelotida dan filogenetik dilakukan dengan menggunakan MEGA versi 4.00 berdasarkan model subtitusi Kimura-2-parameter. Sedangkan analisis kekerabatan menggunakan metode neighbour joining (NJ) dengan bootstrap 1000x. DAFTAR PUSTAKA Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. Hajibabaei et al. 2005. DNA barcode distinguish species of tropical Lepidoptera. PNAS 103: 968-971 Hebert PDN, Ratnasingham S, dan dewaard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96 99. Kottelat M, Whitten AJ. 2003. Freshwater Fishes of Weatern Indonesi and Sulawesi. Germany: Zoologische Staatssammlung. McDowall RM. 2007. On amphidromy, a distinct form of diadromy in aquatic page 13 / 14
organism. Fish and Fisheries 8: 1-13. Meier R, Shiyang K, Vaidya G, Peter. 2006. DNA barcoding and taxonomy in diptera: a tale of high intraspecific variability and low identification success. Systematic Biology 55(5): 715-728. Subiyanto, Ruswahyuni, Cahyono DG. 2008. Komposisi dan distribusi ikan pelagis di estuaria Pelawangan Timur, Segera Anakan, Cilacap. Saintek Perikanan 4:62-68. Tamura K, Dudley J, Nei M Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599. Victor BC, Hanner R, Shivji M, Hyde J. 2009. Identification of the larval and juvenile stages of the Cubera Snapper, Lutjanus cyanopterus using DNA barcoding. Zootaxa 2215:24-36. Ward RD, Zemlak TS, Innes B, dan Last P. 2005. DNA Barcoding Australia s fish species. Philosophical Transactions of The Royal Society 360: 1847-1857. page 14 / 14