METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2010 sampai dengan Januari 2011 (Lampiran 1). Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah 12 mencit betina berumur tiga minggu, pakan, vaksin S. agalactiae yang diradiasi, antibiotik (Clavamox, dosis 250 mg/kgbb), obat-helmint (Albendazol 5%, dosis 10 mg/kgbb), anti protozoa (Flagyl, dosis 50 mg/kgbb), aquades, alkohol 70%, xylazine 10%, ketamin 2%, ether, xylol, parafin, Hematoxylin Eosin, Giemza, metanol, asam pikrat, asam nitrat, Buffered Neutral Formalin 10% (BNF), vitamin C dan B. Alat yang digunakan adalah kandang mencit, tempat pakan, kertas label, buku catatan, timbangan, kapas, tisu, syringe (1 ml, 5 ml, 10 ml), sonde lambung, tabung 50 ml, alumunium soil, stiroform, alas kandang, jarum pentul, botol air minum, gunting, pinset, gelas objek, kaca penutup, mortal, gelas piala, pipet kapiler, micropipet, ependorf, tissue cassette, pisau, benang, staples, mikrotom, cetakan parafin cair, inkubator, stopwacth, automatic tissue prosessor, mikroskop cahaya, camera digital dan eyepiece digital camera. Metode Penelitian Tahap Adaptasi Penelitian ini menggunakan 12 mencit betina berumur tiga minggu yang berasal dari indukan yang sama. Mencit ini dibagi ke dalam empat kelompok yaitu dibagi menjadi empat kelompok yaitu kelompok kontrol (tanpa perlakuan), kelompok vaksin (divaksinasi dengan vaksin S. agalactiae yang diradiasi), kelompok vaksin tantang (divaksinasi dengan vaksin S. agalactiae yang diradiasi
23 lalu ditantang S. agalactiae murni), dan kelompok tantang (diinfeksi dengan S. agalactiae murni). Adaptasi dilakukan selama dua minggu, diberi makan dan minum secara ad libitum. Pada hari pertama minggu pertama mencit diberi obat cacing (Albendazol) dengan dosis 10 mg/kgbb dan berselang dua hari mencit di beri antibiotik (Clavamox) dengan dosis 250 mg/kgbb selama lima hari berturut-turut. Pada hari pertama minggu kedua mencit kembali diberi obat cacing dengan dosis yang sama dengan dosis minggu pertama. Dua hari setelah itu mencit diberi anti jamur (Flagyl) dengan dosis 50 mg/kgbb selama lima hari berturut. Selama minggu kedua ini mencit di beri vitamin B dan C dengan dosis 60 IU/ml air minum. Semua pemberian obat cacing, antibiotik dan anti jamur dilakukan secara peroral. Tahap perlakuan Berikut skema tahap perlakuan selama lima minggu dalam penelitian ini : Minggu 1 2 3 4 5 darah booster 1 booster 2 booster 3 Nekropsi dan darah Vaksinasi dan dikawinkan Pada minggu ini mencit partus Gambar 12 Jadwal pada tahap perlakuan 1 hari sebelum nekropsi ditantang Pada minggu pertama dilakukan pengambilan darah melalui arteri sinus retro orbitalis pada mata (Gambar 13). Sebelum pengambilan darah, mencit dianestesi menggunakan xylamin (dosis 2 mg/kgbb) dan ketamin (dosis 10 mg/kgbb) dengan tujuan mudah handlingnya dan hewan tidak kesakitan pada saat pengambilan darah. Darah yang diambil diteteskan di atas gelas objek dan
24 dilanjutkan dengan pembuatan preparat ulas darah dengan cara mengulas darah di atas gelas objek dan dimasukkan ke dalam metanol selama 10 menit untuk difiksasi. Sampel darah tersebut diwarnai dengan pewarnaan Giemsa (1:9) selama 30 menit, dikeringkan dan ditutup dengan gelas penutup. darah dilakukan tiap minggu selama lima minggu. Gambar 13 darah melalui arteri sinus retro orbitalis Vaksinasi pertama dilakukan pada minggu I dan vaksin booster pada minggu ke-2, 3, 4. Vaksin diinjeksikan secara intra peritoneal sebanyak 0,2 ml/mencit dengan dosis 10 8 cfu/ml (Gambar 14a). Seminggu setelah mencitmencit ini partus atau minggu ke-5 dilakukan nekropsi dan sehari sebelumnya dilakukan uji tantang dengan meneteskan suspensi S. agalactie pada orificium externa kanal puting mencit sebanyak 50 µl tiap puting dengan dosis 10 8 cfu/ml (Gambar 14b). (a) (b) Gambar 14 (a) Vaksinasi. (b) Uji Tantang
25 Tahap Nekropsi Mencit dieuthanasi menggunakan xylazine dan ketamin dengan dosis berlebih dan pada saat dia teranesthesi dilakukan pengambilan darah melalui intracardial untuk pembuatan preparat ulas darah. Setelah mencit mati, rongga abdomen dibuka untuk pengambilan limpa, dan kaki kanan belakang mencit dipreparir untuk pengambilan os femur. Limpa dan os femur selanjutnya diproses untuk pembuatan sediaan histopatologi dengan pewarnaan HE. Pada saat nekropsi juga dilakukan pemeriksaan patologi anatomi limpa dan sumsum tulang dengan melihat apakah ada perubahan secara anatomi seperti ukurannya yang membesar, adanya perubahan bentuk, adanya perubahan konsistensi, dan perubahan secara patologi seperti adanya hemoragi, ulkus, erosi, perubahan warna, dan kemungkinan adanya tumor. Tahap Pembuatan Sedian Histopatologi Setiap organ dipotong (trimming) secara melintang setebal 0,5 cm, lalu dimasukkan ke dalam tissue cassette. Selanjutnya dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol konsentrasi bertingkat (70% hingga absolut) dalam automatic tissue prosessor selama 18 jam. Alat ini bekerja secara otomatis untuk menarik air dari jaringan dan dilanjutkan dengan infiltrasi parafin cair. Tahapan selanjutnya adalah proses embedding atau penanaman jaringan ke dala blok parafin kemudian disimpan dalam refrigator (4-6 0 C). Blok parafin dipotong setebal 5µm menggunakan mikrotom lalu diletakkan di atas gelas objek. Sediaan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam agar parafin meleleh dan jaringan melekat kuat pada gelas objek. Pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan HE melalui beberapa tahap yaitu deparafinisasi, rehidrasi, pewarnaan, pencucian, adan penutupan menggunakan gelas penutup. Pengamatan Histopatologi Ada tiga parameter yang dilihat dalam penelitian ini yaitu diferensial darah, ukuran dan jumlah pulpa putih limpa, dan luasan sumsum tulang. Diferensial darah dihitung di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Ini dilakukan dengan menghitung berapa jumlah masing-masing limfosit, monosit,
26 neutrofil, eosinofil, dan basofil sampai jumlah keseluruhannya 100 atau menghitung nilai dari leukosit. Dalam menghitung diferensial darah arah pandangnya bergerak zig-zag supaya dapat mencakup semua area pandang dan mencegah terhitungnya area pandang yang sama dua kali. Pengamatan preparat histopatologi limpa dan sumsum tulang dilakukan dengan pengambilan gambar menggunakan eyepiece digital camera dengan perbesaran 4x. Jumlah dan diameter pulpa putih pada limpa serta luas sumsum tulang dihitung dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ pada luasan 1,4 mm 2. ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/). Analisis Statistik Hasil perhitungan berupa jumlah sel leukosit (neutrofil, basofil, eusinofil, monosit, dan limfosit), pulpa putih, dan luas sumsum tulang dianalisis secara statistik menggunakan perangkat lunak SPSS 16.0 metode One Way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan yang nyata antara masing-masing kelompok.