BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN 2.5 Jenis Penelitian laboratoris. Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental 2.6 Sampel 2.6.1 Jenis dan Kriteria Sampel Penelitian ini menggunakan hewan coba marmot (Cavia cobaya) dan sampel yang digunakan mempunyai kriteria sebagai berikut: 1. Jenis kelamin jantan. 2. Usia 2-4 bulan. 3. Berat badan berkisar antara 250-300 gram 4. Kondisi fisik sehat untuk dijadikan sampel Pembagian kelompok sampel dilakukan secara random setelah didapatkan sampel yang homogen sesuai dengan kriteria di atas sehingga tiap subyek penelitian memiliki kesempatan yang sama untuk menempati masing-masing kelompok. 2.6.2 Besar Sampel Besar jumlah sampel hewan coba dalam tiap kelompok didapat berdasarkan rumus (Lemeshow, 1990): 22
Keterangan: N δ = jumlah sampel = standard deviasi kontrol Z 1-α = harga standart normal (tergantung harga α; α = 0,05) = 1,64 Z 1-β = besar kekuatan penelitian (harga β = 0,10) = 1,282 µ 1 = rata-rata kelompok perlakuan I µ 2 = rata-rata kelompok perlakuan II Penelitian ini menggunakan 4 kelompok yakni kelompok kontrol, kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak binahong masing-masing konsentrasi 80%, 40%, dan 20%, dengan besar jumlah sampel sebanyak 7 ekor marmut untuk masing-masing kelompok. 2.7 Variabel Penelitian 1. Variable bebas : Konsentrasi gel ekstrak binahong 2. Variable tak bebas : Jumlah sel fibroblas dan pembuluh darah kapiler 3. Variable terkendali : a. Umur dan jenis kelamin hewan coba b. Berat badan hewan coba c. Teknik pencabutan pada hewan coba : d. Makanan dan lingkungan kandang e. Teknik pemberian ekstrak binahong 23
2.8 Definisi Operasional Variabel 4.4.1 Gel Ekstrak Binahong Gel ekstrak daun binahong adalah ekstrak etanol daun binahong yang telah dicampur dengan bahan pembuat gel CMC Na (Carboxy Methyl Cellulose Natrium) yang sudah dibuat homogen. 4.4.2 Jumlah Sel Fibroblas dan Pembuluh Darah Kapiler Jumlah sel fibroblas dan pembuluh darah kapiler dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin yang diamati adalah yang terlihat pada sediaan preparat soket bekas pencabutan gigi marmut dengan pengecatan Hematoksilin Eosin yang diamati pada hari ke-4 setelah perlakuan dengan menggunakan mikroskop cahaya pada pembesaran 400 kali. 4.5 Lokasi dan Lama Penelitian 4.5.1 Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan pada tanggal 14 November 2012 di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya. Pembuatan preparat HPA soket pasca pencabutan gigi marmut dibuat di Laboratorium Patologi Anatomi GDC (Gedung Diagnostic Center) RSUD Dr.Soetomo Surabaya. Pembacaan preparat, penghitungan jumlah sel fibroblas dan pembuluh darah kapiler dilakukan di Ruang Praktikum C Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga. 24
4.5.2 Lama Penelitian Penelitian ini dilakukan selama 2 bulan. 4.6 Alat dan Bahan 4.6.1 Alat 1. Timbangan 2. Kandang untuk marmut 3. Tang dan elevator khusus yang steril untuk mencabut gigi marmut 4. Pinset dental 5. Syringe 2,5 cc steril 6. Gunting 7. Kapas 8. Needle holder untuk menjahit 9. Benang silk untuk menjahit 10. Nierbeken 11. Jarum 16 G 12. Kotak kaca sebagai ruang pembiusan 13. Peralatan pencetak untuk blok paraffin 14. Rotary microtom 15. Mikroskop cahaya 25
Gambar 4.1 Peralataan untuk Mencabut Gigi Marmut beserta Alat Suturing 4.6.2 Bahan 1. Gel ekstrak binahong 2. Aquades steril 3. Basis gel 4. Larutan buffer formalin untuk fiksasi sediaan 5. Alkohol 95% 6. Povidone Iodine 7. Eter 10% 8. Bahan pewarna sediaan 9. Hematoksilin Eosin 4.7 Cara Kerja 4.7.1 Cara Pembuatan Gel Ekstrak Binahong a. Kelompok kontrol: menggunakan basis gel Carboxy Methyl Celulosa Natrium (CMC Na) 26
b. Kelompok I : membuat gel binahong 80% dari binahong sebanyak 8000 miligram dalam 2 gram CMC Na. c. Kelompok II : membuat gel binahong 40% dari binahong sebanyak 4000 miligram dalam 6 gram CMC Na. d. Kelompok III : membuat gel binahong 20% dari binahong sebanyak 2000 miligram dalam 8 gram CMC Na. Gambar 4.2 Proses Pembuatan Gel Ekstrak Binahong 4.7.2 Pengelolaan Hewan Coba Marmut dipelihara selama seminggu untuk beradaptasi dalam kandang berukuran 60 cm x 65 cm x 80 cm untuk (7 ekor marmut) dan ditempatkan pada ruangan yang cukup udara dan cahaya agar tidak lembab, jauh dari keramaian, dan dihindarkan dari paparan sinar matahari secara langsung. Marmut diberi makanan yang mengandung banyak serat, umbi, jagung, dan sayuran hijau lainnya yang segar. Setelah itu dilakukan penimbangan berat badan untuk memenuhi kriteria sampel. 27
Gambar 4.3 Kandang dan Hewan Coba pada Tiap Perlakuan 4.7.3 Pencabutan Gigi Hewan Coba 1. Pencabutan gigi insisivus kiri rahang bawah pada marmut dilakukan dengan menggunakan modifikasi dari needle holder di bawah efek anestesi eter 10% secara inhalasi. Gambar 4.4 a) Hewan Coba yang Dianestesi secara Inhalasi; b) Pencabutan Gigi Insisivus Kiri dan pengaplikasian gel ekstrak binahong 28
2. Pada kelompok kontrol, gel CMC Na diberikan pada luka soket bekas pencabutan 3. Marmut diberi gel ekstrak binahong konsentrasi 20% pada kelompok I, konsentrasi 40% pada kelompok II, dan konsentrasi 80% pada kelompok III pada soket bekas pencabutan hingga memenuhi soket. 4. Setelah dilakukan pencabutan dan perlakuan, soket bekas pencabutan pada hewan coba dijahit, kemudian hewan coba dikembalikan ke kandang dengan memperhatikan kesehatan hewan coba. 5. Setelah hari ke-4, kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dilakukan pengambilan tulang bekas soket pencabutan pada mandibula dan melepasnya dari angulus mandibula dibawah efek anestesi dengan eter 10% dan kemudian mandibula dikeluarkan. Setelah itu, jasad marmut dikuburkan. 4.7.4 Pembuatan Sediaan Sediaan dibuat di GDC Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Soetomo Surabaya dengan menggunakan pengecatan Hematoksilin Eosin. a. Mandibula yang telah diambil dari hewan coba dimasukkan dalam formalin buffer 10% dan direndam selama 24 jam dengan ketentuan seluruh bagian potongan terendam minimal 1/3 bagian formalin pada suhu -80 0 C. b. Dekalsifikasi untuk menghilangkan kalsium secara bertahap dengan direndam dalam asam nitrat 2,5% dilakukan terlebih dahulu hingga 29
jaringan tulang mandibula menjadi lunak. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1x24 jam untuk menghilangkan asam. c. Hasil potongan mandibula yang telah didekalsifikasi dimasukkan dalam formalin buffer 10% selama 24 jam pada suhu yang sama. d. Bahan biopsi diiris menjadi potongan bahan yang berukuran 1 X 1 X ½ cm kemudian dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol secara bertahap masing-masing selama 15 menit sebagai berikut; Alkohol 70% Alkohol 80% Alkohol 90% Alkohol 95% Alkohol 99% Alkohol 100% e. Clearing untuk menjernihkan jaringan dilakukan dengan memasukkan bahan yang telah didehidrasi tersebut ke dalam larutan xylol 2 X 30 menit. f. Embedding dilakukan untuk menanam jaringan pada paraffin solid, dilakukan dengan cara mengkondisikan jaringan dan bahan embedding dalam suhu 60 0 C. Alat cetak dari logam berbentuk L disiapkan dengan diberikan gliserin agar bahan mudah dilepas setelah dicetak, lalu bahan embedding dituang ke dalam alat pencetak sesuai volume yang cukup, dan jaringan ditanam ke dalam paraffin dengan menggunakan pinset. g. Alat pencetak yang telah terisi paraffin dan jaringan didinginkan pada alat pendingin. Bila suda mengeras paraffin bisa dilepas dari alat pencetak sehingga terbentuk blok paraffin. h. Pembuatan blok parafin kemudian sediaan disayat dengan rotary microtome dengan ketebalan sekitar 5µ. Sayatan yang diperoleh 30
diletakkan pada water bath agar sayatan dapat mengembang dengan baik lalu tiriskan. i. Sediaan di cat dengan HE (Hematoksilin Eosin) menurut metode Harris, sebagai berikut: Deparafinasi dilakukan dengan xylol sebanyak 3 X 5 menit Sisa xylol dicuci dengan alkohol 90% selama 2 X 1 menit Sisa alkohol dicuci dengan menggunakan air mengalir selama 15 untuk menghilangkan alcohol dan jaringan terisi air secara sempurna Pengecatan dengan HE selama 5 menit Alkohol asam dan air amonia Counter stain dengan eosin selama 15 detik sampai 2 menit Cuci dengan alkohol 2 X 1 menit Xylol 2 X 2 menit Sediaan ditetesi dengan balsam Canada dan ditutup dengan gelas penutup Setelah itu sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 kali. 4.8 Prosedur Pengambilan Data Replikasi sebanyak 4 potongan jaringan pada masing-masing sampel diletakkan dalam satu gelas objek. Pengamatan sel fibroblas dan pembuluh darah kapiler dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 kali dan kemudian dibuat foto preparat. Penghitungan jumlah fibroblas dan pembuluh darah kapiler dilakukan pada 1/3 daerah apikal soket dan dihitung 31
secara manual melalui foto dengan bantuan grateculae. Hasil penghitungan jumlah fibroblas dan pembuluh darah kapiler dibagi 4 sesuai dengan jumlah replikasi untuk memperoleh jumlah rata-rata fibroblas dan pembuluh darah kapiler pada tiap-tiap sampel pada masing-masing kelompok. Penghitungan total rata-rata sampel tiap kelompok kemudian dibagi dengan jumlah sampel dalam tiap kelompok untuk memperoleh jumlah rata-rata fibroblas dan pembuluh darah kapiler dalam tiap kelompok (Khoswanto, 2010). 32
4.9 Alur Penelitian Besar seluruh sampel marmut Negatif dengan Perlakuan 20% dengan Perlakuan 40% dengan Perlakuan 80% Anastesi dengan Eter 10% Pencabutan gigi insisivus bawah Negatif dengan Perlakuan 20% dengan Perlakuan 40% dengan Perlakuan 80% Soket diisi gel CMC Na dengan ekstrak binahong konsentrasi 0% hingga penuh Soket diisi gel ekstrak binahong konsentrasi 20% hingga penuh Soket diisi gel ekstrak binahong konsentrasi 40% hingga penuh Soket diisi gel ekstrak binahong konsentrasi 80% hingga penuh Soket tersebut dijahit Seluruh marmut pada tiap kelompok dikembalikan untuk dipelihara kembali Pada hari ke-4 eter 10% dosis letal dekapitulasi mandibula Hewan coba dikuburkan secara layak Pembuatan sediaan (pengecatan HE) Pengamatan sediaan dengan mikroskop Analisa data 33