1 PEMERIKSAAN KALSIUM DARAH (Metode CPC Photometric) A. Tujuan Instruksional Khusus 1. Mahasiswa akan dapat mengukur kadar kalsium darah dengan metode CPC photometric. 2. Mahasiswa akan dapat menganalisis hasil pemeriksaan kadar kalsium darah 3. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan kadar kalsium darah untuk menegakkan diagnosis 4. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan kadar kalsium darah untuk penelitian kimia darah B. Dasar Teori Kalsium adalah salah satu ion yang penting dalam tubuh. Kalsium di dalam tubuh terutama terdapat dalam tulang dan gigi. Sebagian kecil kalsium berupa ion di dalam cairan tubuh, termasuk darah, yang penting untuk pengaturan proses penjendalan darah, pengatur fungsi jantung, otot, saraf dan permeabilitas membran. Ion kalsium mengatur sejumlah reaksi fisiologis dan biokimiawi yang penting. Proses tersebut diantaranya mencakup eksitabilitas neuromuskuler, koagulasi darah, proses sekresi, integritas membran serta pengangkutan membran plasma, reaksi enzim, pelepasan hormon serta neurotransmitter dan kerja intrasel sejumlah hormon. Selain itu konsentrasi Ca 2+ dalam periosteum serta cairan ekstrasel diperlukan untuk proses mineralisasi tulang. Tubuh manusia di dalamnya terdapat kurang lebih 1 kg kalsium dan jumlah itu 99 % diantaranya dalam bentuk kristal hidroksiapatit bersama dengan fosfat yang merupakan komponen anorganik dan struktural skeleton. Namun hanya 1 % dari kalsium tulang yang dapat dipertukarkan secara bebas. Kalsium plasma terdapat dalam tiga bentuk, yaitu bentuk senyawa kompleks dengan asam organik, bentuk terikat protein, dan bentuk terionisasi. Bentuk yang terionisasi ini merupakan bentuk biologis-aktif. Toleransi terhadap penyimpangan kadar Ca 2+ dari kisaran normalnya yaitu 1,1-1,3 mmol/l sangat kecil, sehingga perlu pengendalian yang kaku terutama
2 dilakukan oleh banyak organ (hati, kulit, tulang, usus, dan paratiroid), banyak sistem hormon (PTH, kalsitriol serta kalsitonin). Kadar kalsium serum darah berbanding terbalik dan memiliki hasil kali yang tetap dengan kadar fosfor serum. Dalam keadaan normal hasil kalinya adalah 40, pada anak yang sedang tumbuh 50, sedang pada penderita rakhitis kurang dari 30. Keadaan dimana kadar kalsium lebih dari normal disebut hiperkalsemia dan dapat menyebabkan pengapuran-pengapuran ditempat yang tidak semestinya. Sebaliknya hipokalsemi dapat terjadi pada keadaan hipoparatiroidisme yang akan memberikan gejala tetani. C. Metode Pemeriksaan Metode CPC Photometric D. Alat dan Bahan Alat 1. Spuit 3cc 2. Torniquet 3. Vacuum tube red cap (Non EDTA) 4. Sentrifugator 5. Mikropipet (10 μl-100 μl) 6. Mikropipet (100 μl-1000 μl) 7. Yellow tip 8. Blue tip 9. Tabung reaksi 3 ml 10. Rak tabung reaksi 11. Spektrofotometer Bahan 1. Sampel (Serum) 2. Working reagen (R. Kalsium + Buffer) E. Cara Kerja Panjang gelombang : 570 (578) nm
3 Temperatur : 18-30 0 C 1. Persiapan sampel: a. Diambil darah probandus sebanyak 3 cc dengan menggunakan spuit. b. Darah dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, kemudian diambil serumnya untuk sampel. Masukan ke dalam Blanko Standar Test tabung reaksi Larutan kerja 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Serum - - 20 µl Standar - 20 µl - Campur homogen dengan vortex dan diamkan pada suhu kamar (18-30 0 C) selama 1 menit. Baca absorbance test dan absorbane standar terhadap blanko regensia pada panjang gelombang 570 (578) nm. Catatan: Pembuatan larutan kerja Campur bagian regensia 1 dengan 1 bagian regensia 2, diamkan pada suhu kamar (18-30 0 C) selama 20 menit sebelum digunakan. Larutan stabil selam 2 minggu pada suhu 2-8 0 C dan 1 minggu pada suhu kamar (18-30 0 C) F. Dasar Pemeriksaan Reagensia berdasarkan metode yang diajukan oleh Moorehead and Briggs. CPC berreaksi dengan kalsium dan magnesium dalam suasana alkalis menyusun senyawa yang berwarna ungu tua. Intensitas warna ungu tua yang terbentuk berbanding langsung dengan kadar kalsium dan dapat diukur dengan spektrofotometris dengan panjang gelombang antara 550 nm 580 nm dengan absorbance max pada 570 nm.
4 Calsium+o-Cresholphtalein alkalis calsium-cresolphthalein complexon Complexon complex (warna ungu) G. Perhitungan Kalsium (mg/dl)= Abs. Test x kadar standar Abs. standar H. Nilai Normal Kadar kalsium serum atau plasma : 8,5-10,5 mg/dl. Anak usia < 12 th mempunyai nilai normal yang lebih tinggi
5 PEMERIKSAAN FOSFAT ANORGANIK (Metode Fotometri UV Test) Tujuan Instruksional Khusus 1. Mahasiswa akan dapat mengukur kadar fosfat anorganik dengan metode fotometri UV test. 2. Mahasiswa akan dapat menganalisis hasil pemeriksaan kadar fosfat anorganik 3. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan kadar fosfat anorganik untuk menegakkan diagnosis 4. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan kadar fosfat anorganik untuk penelitian kimia darah Dasar Teori Senyawa fosfor berada dalam tubuh sebagai fosfat yaitu sebagai substansi anorganik pada tulang, tetapi juga didalam sel pada fosfolipid dan asam nukleat seperti adenosine trifosfat, yang meliputi transfer energi. Fosfor dalam plasma hadir sebagai kalsium fosfat, sehingga kadar fosfor dalam plasma sangat berhubungan erat dengan kadar kalsium. Pengukuran fosfat serum dan urin dapat untuk mendeteksi kerusakan pada ginjal, tulang dan kelenjar paratiroid. Kenaikan kadar fosfat anorganik dijumpai pada kondisi gagal ginjal, hipoparatiroidisme, pseudohipoparatiroidisme dan kehilangan kalsium fosfat dari tulang dan sel. Penurunan kadar fosfat anorganik terjadi pada malabsorbsi, hiperparatiroidisme dan defesiensi vit.d Metode Pemeriksaan Metode Photometric UV Test Prinsip Pemeriksaan
6 Alat dan Bahan Alat 1. Spuit 3 cc 2. Torniquet 3. Sentrifugator 4. Vacuum tube red cap (Non EDTA) 5. Tabung reaksi 3 ml 6. Rak tabung reaksi 7. Mikropipet (10 µl 100 µl) 8. Mikropipet (100 µl 1000 µl) 9. Yellow tip 10. Blue tip 11. Spektrofotometer Bahan 1. Serum, urin, plasma heparin 2. Working reagen Cara Kerja Blanko reagen Standar Serum Larutan standar - 10 µl Sampel - 10 µl Reagen 1000 µl 1000 µl 1000 µl
7 Dicampurkan agar homogen, diinkubasi selama 1 menit. Ukur absorbansi ( A) sampel dan standar terhadap blanko reagen dalam waktu max 60 menit dengan panjang gelombang 340 nm. Perhitungan konsentrasi fosfat anorganik : 10 X A sampel A standar Nilai Normal Kadar fosfat anorganik: Dewasa: 2,5-5,0 mg/dl atau 0,81-1,62 mg/dl Anak-anak: 4,0-7,0 mg/dl atau 1,30-2,26 mg/dl
8 PEMERIKSAAN Aktivitas Creatin Kinase N-Acetyl Cystein (CK NAC) (Metode enzimatik kinetik) Tujuan Instruksional Khusus 1. Mahasiswa akan dapat mengukur aktivitas CK NAC dengan metode enzimatik kinetik 2. Mahasiswa akan dapat menganalisis hasil pemeriksaan aktivitas CK NAC 3. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan akktivitas CK NAC untuk menegakkan diagnosis 4. Mahasiswa akan dapat menerapkan hasil pemeriksaan aktivitas CK NAC untuk penelitian kimia darah Dasar Teori Kreatinin kinase (CK) adalah enzim yang terdiri dari isoenzim terutama di otot berupa CK-M dan di otak berupa CK-B. CK pada serum berupa CK total berbentuk dimer yaitu CKMM, CKMB dan CKBB sebagai makroenzim. Peningkatan kadar CK diobservasi pada kerusakan otot jantung dan penyakit otot skeletal. CK terutama digunakan untuk monitoring infark miokardium dalam diagnosis bersama dengan pemeriksaan CKMB. Kerusakan miokard pada infark miokard menyebabkan dilepaskannya protein termasuk enzim sehingga CKMB, Mioglobin dan troponin kadarnya meningkat. CKMB merupakan enzim spesifik sebagai penanda kerusakan otot jantung, enzim ini meningkat dalam waktu 6-10 jam setelah nyeri dada dan kembali normal dalam 48-72 jam.
. 9
10 Metode Pemeriksaan Metode enzimatik kinetik Prinsip reaksi Creatin kinase + ADP CK creatin +ATP Glukosa + ATP HK ADP + G-6-phospate G-6-P +NAD G-6-PDH 6- phospoglukonat+ NADH + H + Alat dan Bahan Alat 1. Spuit 3 cc 2. Torniquet 3. Vacuum tube red cap 4. Sentrifugator 5. Tabung reaksi 3 ml 6. Rak tabung reaksi 7. Mikropipet (10 µl 100 µl) 8. Mikropipet (100 µl 1000 µl) 9. Yellow tip 10. Blue tip 11. Spektrofotometer Bahan 1. Serum, plasma heparin
11 2. Working reagen 1 ml Larutkan reagensia dengan pelarut aquabidest sesuai volume pada label botol campurkan dengan baik. Larutan stabil selama 30 hari pada suhu 2-8 0 C pada suhu kamar (18-30 0 C) Cara Kerja 1. Siapkan darah probandus 3 cc. buat sampel serum darah 25 µl 2. Darah dimasukkan ke dalam vacuum tube red cap dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, kemudian diambil serumnya untuk sampel. 3. Campurkan 1 ml working reagen dengan 25 µl serum 4. Hangatkan pada 37 0 C selama 5 menit 5. Baca abs. Test setiap 60 detik selama 3 menit terhadap blanko air pada panjang gelombang 340 nm. Hitung selisih nilai absorbancenya. (Abs test 2- Abs test 1) + (Abs tes 3- abs tes 2) = delta Abs tes menit 2 Faktor : 6592 Cara perhitungan Creatin kinase (U/L) = (delta Abs test/ menit) x faktor Nilai Normal Kadar Normal CK: Laki-laki : <160 U/L Perempuan: <130 U/L