II. METODELOGI 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November sampai dengan Desember 2011 di Laboratorium Lingkungan dan Laboratorium Kesehatan Ikan, Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 2.2 Alat dan Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu ikan nila BEST berukuran 2-3 cm dengan bobot 0,26 gram/ekor, minyak cengkeh, dan plastik packing berukuran 40x60 cm yang salah satu ujung plastik diikatkan zeolit serta karbon aktif dengan dibungkus kain kasa, dan sisi ujung plastik lainnya diikatkan kran. Wadah yang digunakan pada saat pemuasaan ikan yaitu akuarium berukuran 50x40x30 cm, sedangkan pada pemeliharaan ikan pascatransportasi yaitu akuarium berukuran 100x50x50 cm. 2.3 Tahap Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu tahap pendahuluan dan utama. Pada tahap pendahuluan dilakukan penentuan kemampuan puasa ikan, tingkat konsumsi oksigen, laju eksresi amoniak, penentuan kapasitas zeolit dan karbon aktif dalam penyerapan TAN, serta penentuan toleransi ikan nila BEST terhadap dosis optimum pencampuran minyak cengkeh dalam air. Tahap penelitian utama yaitu penentuan kepadatan optimum ikan nila BEST pada transportasi tertutup, kualitas air, kelangsungan hidup ikan selama pemeliharaan dan laju pertumbuhan harian ikan pada saat pemeliharaan pascatransportasi. 5
2.4 Prosedur Kerja 2.4. 1 Penelitian Pendahuluan (Supriyono et al. 2007) 2.4.1.1 Tingkat Kelangsungan Hidup Ikan Selama Pemuasaan Penentuan puasa ikan dilakukan dengan tujuan mengetahui tingkat kelangsungan hidup ikan nila BEST tanpa diberi pakan. Hal ini berguna pada saat transportasi dilakukan, apabila terjadi kematiaan bukan karena kelaparan. Penentuan puasa ikan dilakukan dengan cara menyiapkan 3 buah akuarium berukuran 50x40x30 cm yang telah dibersihkan dan dikeringkan selama 1 hari kemudian diisi air dengan tinggi air 20 cm yang diaerasi selama 2 hari, lalu dimasukkan ikan uji sebanyak 30 ekor/akuarium. Pengamatan tingkah laku ikan uji dilakukan setiap hari selama tujuh hari dan mencatat pada hari keberapa ikan mulai mengalami lemas dan mengalami kematian. 2.4.1.2 Tingkat Konsumsi Oksigen Pengukuran tingkat konsumsi oksigen (TKO) dilakukan dengan pengukuran bobot ikan nila BEST. Ikan nila BEST dimasukkan ke dalam toples 3 yang sebelumnya telah diisi air hingga penuh, kemudian toples ditutup rapat. Jumlah ikan nila BEST yang dimasukkan sebanyak 6 ekor yang bobot rata-ratanya 0,26 g/ekor. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan. Jumlah oksigen terlarut dalam toples diukur setiap 6 jam menggunakan DO meter. 2.4.1.3 Laju Eksresi Amoniak Pengukuran laju eksresi amoniak ikan bertujuan untuk menghitung jumlah amoniak yang dieksresikan ikan tiap satuan waktu, sehingga dapat diketahui jumlah akumulasi amoniak pada waktu tertentu. Percobaan ini dilakukan dengan menyiapkan 3 toples bervolume 3 L yang telah dibersihkan dan dikeringkan selama 1 hari, kemudian diisi air hingga penuh. Ikan uji ikan nila BEST dengan bobot rata-rata 0,26 gram dimasukkan ke dalam wadah masing-masing 10 ekor/toples. Kemudian dilakukan pengambilan sampel air sebanyak 30 setiap 24 jam selama 48 jam untuk mengukur suhu, ph, dan konsentrasi total amoniak nitrogen (TAN). 2.4.1.4 Kapasitas Serap Zeolit dan Karbon Aktif Terhadap Amoniak 6
Pengukuran kemampuan serap zeolit dan karbon aktif pada NH 3 dapat dilakukan dengan mengukur tingkat serap bahan aktif tersebut dalam larutan TAN. Tahapan pada proses ini diawali dengan penyiapan dua botol plastik yang salah satu bagian tutup botol dilubangi dengan jarum. Bagian leher botol diisi dengan zeolit dan karbon aktif masing-masing sebanyak 20 gram. Larutan TAN dengan konsentrasi 10 dialirkan ke dalam botol yang berisi karbon aktif dan zeolit. Pengambilan sampel air sebanyak 30 dilakukan pada setiap menit selama 8 menit, kemudian dilakukan pengukuran TAN, nilai ph, dan suhu pengujian ini dilakukan masing-masing 3 ulangan. 2.4.2 Penelitian Utama 2.4.2.1 Penentuan Dosis Optimum Minyak Cengkeh pada Transportasi Tertutup Ikan Nila BEST Ikan uji dengan bobot 0,26 g/ekor dipuasakan selama 2 hari, kemudian disiapkan 8 lembar kantong plastik dan karet pengikat, salah satu ujung plastik dipasang keran untuk mengambil sampel air dan ujung yang lain dipasang kemasan zeolit dan karbon aktif. Selanjutnya kantong plastik diisi dengan air masing-masing 1,5 dan ikan uji dengan bobot 0,26 g/ekor dimasukkan ke dalam kantong plastik dengan kepadatan 700 ekor per kantong dengan minyak cengkeh 12, 24, 36, dan 48 Masing-masing perlakuan terdiri dari 2 ulangan. Setiap kantong diisi oksigen dengan perbandingan 1:3 dan diikat dengan karet gelang dan dimasukkan ke dalam kotak Styrofoam. Selanjutnya dimasukkan es batu ke dalam kotak Styrofoam agar suhu stabil sekitar 20 o C, kemudian ditutup. Pengamatan keadaan ikan dilakukan setiap 4 jam dan pengambilan sampel air sebanyak 70 /kantong setiap 4 jam. Pengamatan dan pengambilan sampel dihentikan hingga 24 jam. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara membuka keran yang sudah dipasang di ujung plastik sehingga air yang ada di dalam plastik dapat keluar tanpa mengalami difusi udara dari luar packing. Proses transportasi dilakukan secara simulasi di laboratorium, yaitu disimpan di boks Styrofoam yang diberi guncangan pada setiap pengamatan. 7
2.4.2.2 Tingkat Kelangsungan Hidup Derajat kelangsungan hidup (SR) adalah perbandingan jumlah ikan yang hidup dihitung (Nt) dan jumlah ikan pada awal tebar dicatat. Perhitungan SR digunakan rumus dari Godart (1996): Nt SR = N0 x100% Keterangan: SR = tingkat kelangsungan hidup (%) Nt = jumlah ikan akhir (ekor) N0 = jumlah ikan awal (ekor) 2.4.2.3 Total Amoniak Nitrogen (TAN) dan Amoniak (NH 3 ) Nilai TAN didapatkan dari perbandingan nilai absorban dan standar kemudian dilakukan konsentrasi larutan standar yang digunakan TAN = Abs. Sampel - Abs. Blanko Abs. Standar - Abs. Blanko x [Standar] NH 3 = nilai TAN dikalikan dengan persentase amoniak yang tidak terionisasi berdasarkan nilai ph dan suhu. Tabel 1. Persentase Amoniak Tidak Terionisasi (NH 3 ) pada ph dan Suhu yang Berbeda (Boyd 1990) Suhu ( o ph C) 6,5 7 7,5 8 8,5 18 0,1 0,3 0,9 2,9 8,5 20 0,1 0,3 1,1 3,3 9,8 22 0,1 0,4 1,2 3,8 11,2 24 0,1 0,5 1,4 4,4 12,7 26 0,2 0,5 1,7 5,0 14,4 28 0,2 0,6 1,9 5,8 16,2 2.4.2.4 Pemeliharaan Ikan Nila BEST Pascatransportasi Pemeliharaan ikan dilakukan selama 7 hari setelah packing dibongkar. Ikan dipelihara di dalam akuarium dengan dimensi 100x50x50 cm yang telah dicuci dan dikeringkan selama 3 hari. Sumber air yang digunakan yaitu berasal dari air tandon laboratorium lingkungan dan diberi perlakuan dengan menggunakan filter fisik melalui sistem pengendapan. Akuarium diisi air dengan ketinggian 45 cm dan diaerasi selama 3 hari. 8
Ikan dipelihara dengan pemberian pakan berupa pellet at satiation. Penyiponan dilakukan setiap pagi dan sore dengan pergantian air sebanyak 20% setiap hari. Pengukuran laju pertumbuhan harian dilakukan dengan mengukur bobot ikan awal dan bobot ikan akhir sedangkan kelangsungan hidup ikan selama pemeliharaan yaitu setiap hari dengan mengamati kondisi ikan. 2.4.2.5 Laju Pertumbuhan Harian Bobot Harian Laju pertumbuhan bobot harian (α) ditentukan berdasarkan selisih bobot rata-rata akhir (Wt) dengan bobot rata-rata awal (Wo) pemeliharaan kemudian dibandingkan dengan waktu pemeliharaan (t) dengan rumus dari Huisman (1989): α = wt ( t 1) x100% w0 2.4.2.6 Oksigen Terlarut (DO), Karbon Dioksida (CO 2 ), Derajat Keasaman, dan Suhu Parameter kualitas air yang meliputi oksigen terlarut, karbon dioksida, derajat keasaman dan suhu diukur setiap 4 jam selama 24 jam. 2.4.2.7 Rancangan Percobaan Rancangan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan empat perlakuan yaitu: 1) 20 gram zeolit + 10 gram C-aktif + 12 minyak cengkeh + 700 e nila BEST 2) 20 gram zeolit + 10 gram C-aktif + 24 minyak cengkeh + 700 e nila BEST 3) 20 gram zeolit + 10 gram C-aktif + 36 minyak cengkeh + 700 e nila BEST 4) 20 gram zeolit + 10 gram C-aktif + 48 minyak cengkeh + 700 e nila BEST Masing-masing perlakuan terdiri dari 2 ulangan. Model rancangan yang digunakan yaitu: Yij = µ + τi + εij (Steel dan Torrie 1982) Keterangan: Yij = Data hasil pengamat pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai tengah data τ i = pengaruh perlakuan ke-i ε ij = kesalahan percobaan pada perlakuan ke-j dan ulangan ke-i 9
2.4.2.8 Pengumpulan Data Adapun data yang dikumpulkan dalam penelitian ini adalah data tingkat kematian ikan, data kualitas air (oksigen terlarut, CO 2, nilai ph, suhu, dan total amoniak nitrogen), dan bobot ikan. Data tersebut akan digunakan untuk menghitung parameter yang diamati meliputi derajat kelangsungan hidup, pertumbuhan bobot harian, dan NH 3. 2.4.2.9 Analisis Data Analisis data menggunakan analisis ragam (Anova) dengan uji F pada selang kepercayaan 95% menggunakan program Ms.Excel 2007 dan SPSS 17.0. Apabila berpengaruh nyata, untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan diuji dengan menggunakan uji Tukey. Adapun parameter yang dianalisis adalah tingkat kelangsungan hidup dan nilai kualitas air selama proses transportasi seperti total amoniak nitrogen (TAN), oksigen terlarut (DO), karbon dioksida (CO 2 ), derajat keasaman (ph), dan suhu. Selain itu, laju pertumbuhan harian dan tingkat kelangsungan hidup pascatransportasi. 2.4.2.10 Histologi Tahap histologi merupakan tahapan pengamatan sel pada benih yang ditransportasikan. Tahap ini diawali dengan mematikan benih dan diambil bagian insangnya. Setelah itu, insang tersebut difiksasi dengan larutan Bouin s selama 48 jam. Tahap selanjutnya yaitu tahap dehidrasi, di mana air dalam sel dikeluarkan dengan cara direndam dalam bahan kimia dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Pertama-tama, jaringan yang dipilih direndam alkohol 70% selama 48 jam, lalu dilanjutkan dengan direndam berturut-turut dengan alkohol 80%, 90%, dan 95% dengan masing-masing perendaman adalah 2 jam. Selanjutnya jaringan tersebut direndam dalam alkohol 100% selama 1 jam. Kemudian di clearing. Pada tahap ini jaringan yang telah direndam sebelumnya di dalam alkohol 100%, direndam di dalam alkohol - xylol, xylol I, xylol II, dan xylol III selama 30 menit untuk setiap bahan perendaman. Tahapan selanjutnya adalah impregnasi. Tahapan ini dilakukan dengan merendam jaringan dari tahapan sebelumnya dengan parafin cair di dalam oven. Pengulangan dilakukan 10
sebanyak 3 kali dalam tahapan ini dan dilakukan selama 45 menit untuk setiap perendaman. Setelah itu, dilakukan tahap bloking yaitu mencetak jaringan agar lebih mudah dipotong. Pemotongan jaringan dilakukan dengan mikrotom dan selanjutnya potongan tersebut disusun pada gelas objek. Tahap berikutnya adalah tahapan pewarnaan yang dilakukan dengan dihidrasi terlebih dahulu. Gelas preparat tersebut direndam dengan xylol sebanyak 2 kali dengan lama perendaman 1 menit untuk setiap xylol, lalu alkohol 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50%, masing-masing 2 menit kemudian direndam dengan akuades. Setelah itu, jaringan pada gelas preparat tersebut direndam dengan pewarna hematoksilin selama 3 menit lalu dibilas dengan air. Tahapan berikutnya adalah tahap dehidrasi yang dilakukkan dengan perendaman gelas objek tersebut di dalam alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan 100% sebanyak 2 kali dan selama 2 menit untuk perendaman. Perendaman selanjutnya adalah xylol sebanyak 3 kali selama 2 menit untuk setiap perendaman. Setelah itu preparat diberi perekat berupa entelan dan dilekatkan dengan gelas penutup kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 40 o C selama 24 jam. Setelah itu diamati dengan mikroskop. 11