Kasus Penderita Diabetes Recombinant Human Insulin Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB Sejak Banting & Best menemukan hormon Insulin pada tahun 1921, pasien diabetes yang mengalami peningkatan kadar gula akibat produksi insulin yang terganggu, telah diobati dengan insulin yang diperoleh dari kelenjar pankreas hewan. Hormon insulin, yang diproduksi dan disekresi oleh sel beta dari pulau langerhans pada pankreas, mengatur penggunaan dan penyimpanan makanan, khususnya karbohidrat. Masalah? Meskipun insulin babi dan sapi serupa dengan insulin manusia, komposisinya sedikit berbeda. Sebagai akibatnya, sistem imun dari sejumlah pasien memproduksi antibodi untuk melawan insulin, menetralkan aksinya dan menghasilkan reaksi inflamasi pada daerah suntikan. Selain efek samping di atas, timbul juga ketakutan adanya komplikasi jangka panjang yang terjadi akibat injeksi terus-menerus suatu bahan asing. Selain itu juga diproyeksikan akan terjadi penurunan produksi dari insulin yang dihasilkan oleh hewan.
Produksi protein human insulin dalam kultur bakteri Faktor ini mendorong peneliti untuk mencoba mensintesa Human Insulin dengan cara menyisipkan gen insulin pada vektor yang sesuai, yaitu sel bakteri E. coli (digunakan pada produk Humulin, Eli Lily) untuk menghasilkan insulin yang secara kimia identik dengan insulin yang terbentuk secara alami. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. Metode ini lebih dapat diandalkan daripada metode pembuatan insulin yang diperoleh dengan cara ekstraksi dan pemurnian insulin dari hewan. Selain menggunakan bakteri sebagai host, dapat juga digunakan host berupa ragi (yeast). 1. Suatu DNA kecil berbentuk lingkaran yang exist dalam bacteria, dikenal sebagai plasmid. Plasmid ini selanjutnya dimodifikasi agar disisipkan suatu urutan DNA manusia yang mengandung gen pembentuk proinsulin. Proinsulin adalah precursor untuk pembentukan insulin. 2. Plasmid yang telah mengandung gen proinsulin lalu disisipkan (transformasi) ke dalam Eschericia coli (E. coli) yang akan memproduksi human proinsulin. 3. Bakteri ini akan berkembang biak di dalam suatu fermentor yang berisi media produksi dan akan menghasilkan human proinsulin dalam jumlah besar 4. Selanjutnya Bakteri diinaktif kan dengan cara heat sterilization, proinsulin dipanen Struktur Insulin Secara kimia, insulin merupakan suatu protein yang kecil dan sederhana. Insulin terdiri dari 51 asam amino, 30 diantaranya menyusun 1rantaipolipeptidadan21asamaminomenyusunrantaikedua.Kedua rantai tersebut dihubungkan dengan ikatan disulfida (Gambar 1). 5. Proinsulin diambil lalu dengan cara memotong secara enzymatik akan dihasilkan human insulin. 6. Proses selanjutnya adalah sentrifugasi dan penghilangan sel2 yang tidak diperlukan. Pemurnian dilakukan dengan cara liquid chromatography dan crystallization Gambar 1.
Kode genetik dari insulin ditemukan dalam DNA pada bagian atas short arm dari kromosom ke-11. Kromosom ini mengandung 153 basa nitrogen (63 pada rantai A dan 90 pada rantai B). DNA (yang menyusun kromosom) terdiri dari 2 rantai helix yang saling berpilin, tersusun dari rantai nukleotida, setiap rantai tersusun dari gula deoksiribosa, fosfat, dan basa nitrogen. Ada 4 jenis basa yang berbeda, Adenin, Thymine, Cytosine, dan Gunanine. Sintesis dari protein tertentu seperti insulin ditentukan oleh susunan basa-basa tersebut yang berulang (Gambar 2) Gambar 2. Sintesis insulin diawali dengan proses transkripsi : Rantai ganda dari kromosom ke-11 dari DNA dibagi 2, mengekspos basa nitrogen yang tidak berpasangan, yang spesifik untuk produksi insulin (Gambar 3) Gambar 3. Menggunakan satu dari rantai DNA yang terekspos (Gambar 4.) sebagai template, messenger RNA membentuk proses transkripsi (Gambar 5.) Peranan rantai mrna, dimana basa nitrogen Thymine digantikan dengan Uracil, adalah untuk membawa informasi genetik, seperti informasi yang berhubungan dengan insulin, dari nukleus ke sitoplasma, dimana rantai mrna menempel pada ribosom (Gambar 6.) Gambar 4. Gambar 6. Gambar 5.
Basa nitrogen pada mrna dikelompokkan menjadi 3, dikenal sebagai kodon. molekul transfer RNA (trna), 3 basa tidak berpasangan yang berikatan dengan asam amino spesifik, dikenal sebagai anti kodon (Gambar 7) berpasangan dengan basa komplementer (kodon) pada mrna. Pembacaan mrna oleh trna pada ribosom dikenal sebagai translasi. Suatu rantai asam amino yang spesifik terbentuk oleh trna mengikuti kode yang telah ditentukan oleh mrna. Rantai basa dari mrna telah diterjemahkan menjadi susunan asam amino yang berikatan bersama-sama untuk membentuk protein spesifik seperti insulin. Vektor Vektor yang digunakan sebagai pabrik yang memproduksi insulin secara rekayasa genetika adalah berupa bakteri Escherichia coli, suatu bakteri gram negatif yang mendiami saluran pencernaan manusia (gambar 8). Gambar 8. Gambar 7. Sewaktubakteriituberkembangbiak,geninsulinbereplikasibersama dengan plasmid, suatu daerah sirkuler dari DNA (gambar 9). E. coli memproduksi enzim yang secara cepat mendegradasi protein asing seperti insulin. Dengan menggunakan strain mutan yang tidak memiliki enzim ini, masalah ini dapat dihindari. Gambar 9. Electron micrograph of the Vector s plasmid Pada E. coli, B-galaktosidase merupakan enzim yang mengendalikan transkripsi dari gen. Untuk membuat bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu diikatkan pada enzim ini. Enzim restriksi, yang secara alami diproduksi oleh bakteri, bertindak sebagai gunting biologik (biological scalpels) gambar 10, yang hanya mengenali bagian tertentu dari nukleotida, seperti bagian yang mengkode insulin. Gambar 10.
Dengan adanya restriction enzymes ini, dimungkinkan untuk memotong daerah DNA yang mengkode insulin dari satu kromosom organisme sehingga dapat diproduksi insulin. (Gambar 11). DNA ligase adalah enzim yang bekerja sebagai lem genetik (genetic glue) yang menempelkan kedua ujung nukleotida yang bebas menjadi satu. Pembuatan Human Insulin (Humulin, Eli Lilly) Tahap pertama adalah mensintesa secara kimia rantai DNA yang membawa urutan nukleotida spesifik yang mengkarakterisasi rantai polipeptida A dan B dari insulin (Gambar 12). Gambar 11. Gambar 12. Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai tersebut telah tersusun. Sebanyak 63 nukleotida diperlukan untuk mensintesa rantai A dan 90 nukleotida untuk rantai B, plus satu kodon pada ujung setiap rantai, menandakan akhir dari sintesis protein. Suatu antikodon, yang mengandung asam amino methionine, diletakkan pada awal setiap rantai yang memungkinkan pelepasan protein insulin dari asam amino sel bakteri. Gen rantai sintetik A dan B kemudian dimasukkan secara terpisah ke dalam gen enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dilakukan dalam plasmid vektor (gambar 13). Pada tahap ini, penting untuk meyakinkan bahwa kodon dari gen sintetik sesuai dengan kodon dari B-galaktosidase. Plasmid rekombinan kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli. Penggunaan praktis dari teknologi rekombinan DNA dalam sintesa human insulin memerlukan jutaan kopi dari bakteri yang plasmidnya telah digabungkan dengan gen insulin untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan sewaktu bakteri bereplikasi dengan B-galaktosidase dalam sel mengalami mitosis (gambar 14). Gambar 13. Gambar 14.
Protein yang terbentuk, terdiri dari sebagian B-galaktosedase, tergabung baik pada rantai A maupun B dari insulin (Gambar 15). Rantai A dan B kemudian diekstraksi dari fragmen B-galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai tersebut kemudian dicampur dan dihubungkan kembali dalam suatu reaksi yang membentuk jembatan disulfida, menghasilkan Humulin murni suatu insulin manusia sintetik (gambar 16) Gambar 16. Gambar 15. Implikasi Biologis dari Recombinan Human Insulin hasil rekayasa genetik Pada studi kimia dan farmakologi, human insulin telah terbukti tidak berbeda dari pancreatic human insulin. Pada awalnya, kesulitan utama yang dihadapi adalah kontaminasi dari sel inang (host cells), serta kontaminasi dari media fermentasi pada produk akhir. Kontaminasi ini telah dapat diatasi dengan dilakukannya proses pemurnian. Sewaktu produk akhir insulin diuji dengan sederetan test, tidak ada cemaran yang dapat terdeteksi. Seluruh prosedur sekarang dilakukan menggunakan sel ragi sebagai medium pertumbuhan, karena sel ragi dapat menghasilkan molekul insulin manusia yang hampir lengkap dan memiliki struktur 3 dimensi yang sempurna. Hal ini meminimalkan proses pemurnian yang komplek dan mahal.