22 BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental laboratoris dengan rancangan penelitian The Post Test-Only Control Group Design. 4.2 Populasi dan Sampel Penelitian 4.2.1 Populasi Penelitian Populasi dari penelitian ini adalah penderita karies dentin profunda di Rumah Sakit Gigi dan Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga pada Bulan September-Oktober Tahun 2012. 4.2.2 Sampel dan Kriteria Sampel Sampel dari penelitian ini yaitu bakteri campur yang terdapat dalam karies dentin profunda tanpa perforasi pada penderita dengan pulpitis reversible. 4.2.3 Teknik Pengambilan Sampel Sampel diambil menggunakan teknik selective random sampling. 4.2.4 Besar Sampel Besar sampel minimal ditentukan dengan menggunakan rumus Lemeshow (Suyatno, 2010): Keterangan: n = besar sampel δ = standar deviasi dari kelompok kontrol Z1-1 / 2 α = nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan tingkat kemaknaan 22 α (untuk α = 0,05 adalah 1,96) Z1-β = nilai pada distribusi normal standar yang sama dengan kuasa (power) sebesar diinginkan (untuk ß=0,10 adalah 1,28) µ1 = rata-rata hitung respon kelompok 1 µ2 = rata-rata hitung respon kelompok 2 22
23 Jumlah sampel minimal untuk tiap konsentrasi uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah 6 sampel. 4.3 Variabel Penelitian 4.3.1 Variabel bebas Ekstrak propolis Apis mellifera spp berbagai konsentrasi, yaitu konsentrasi 8%, 7,75%, 7,5%, 7,25%, 7%, 6,75%, 6,5%, 6,25% dan 6%. 4.3.2 Variabel terikat Jumlah koloni bakteri campur karies dentin profunda pada media Mueller Hinton agar yang ditunjukkan dalam colony forming unit (CFU). 4.3.3 Variabel terkendali Jenis propolis, metode ekstraksi, media pertumbuhan bakteri, peralatan yang digunakan selama penelitian, suhu dan lama waktu inkubasi 4.4 Definisi Operasional a. Daya antibakteri adalah kemampuan suatu bahan yang digunakan untuk membasmi bakteri yang dinyatakan dalam konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh minimal (KBM) bahan terhadap pertumbuhan bakteri. b. Ekstrak propolis adalah ekstrak propolis dari lebah Apis mellifera spp dari Perkebunan Rimba Raya di Lawang Kabupaten Malang yang diekstrak dengan metode maserasi. c. Bakteri campur karies dentin profunda adalah bakteri campur yang terdapat dalam karies dentin profunda tanpa perforasi pada penderita
24 dengan pulpitis reversible yang ditanam pada media cair BHIB (Brain Hearth Infusion Broth). d. Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) adalah konsentrasi terendah ekstrak propolis yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji sebanyak 90% dari jumlah bakteri yang berhasil tumbuh pada kontrol positif (Forbes, 2007). e. Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah ekstrak propolis yang dapat membunuh bakteri uji sebanyak 99,9% dari jumlah bakteri yang berhasil tumbuh pada kontrol positif (Forbes, 2007). f. Jumlah koloni bakteri campur karies dentin profunda pada media Mueller Hinton agar adalah hasil perhitungan jumlah koloni bakteri uji yang ditunjukkan dalam colony forming unit (CFU). g. Kontrol positif adalah media padat Mueller Hinton agar yang ditambah dengan bakteri uji tanpa penambahan ekstrak propolis. h. Kontrol negatif adalah media padat Mueller Hinton agar tanpa penambahan bakteri uji dan ekstrak propolis. 4.5 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya pada Bulan September-Oktober 2012. 4.6 Bahan dan Alat Penelitian 4.6.1. Bahan Adapun bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu propolis mentah Apis mellifera spp, bakteri campur karies dentin profunda, media Mueller Hinton agar, aquadest steril dan media BHIB (Brain Hearth Infusion Broth).
25 4.6.2. Alat Adapun alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu petridish, oese, spreader, brander, ekskavator, inkubator, mikropipet steril, tabung reaksi dan rak, spidol, kapas dan korek api 4.7 Cara Kerja 4.7.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 o C selama 30 menit. 4.7.2 Persiapan Sampel Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. 350 gram propolis mentah Apis mellifera spp dimaserasi dengan 650 gram etanol 70% pada wadah tertutup dan dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 80 rpm. Setelah 7 hari, maserasi dihentikan dan disaring. Residu dimaserasi kembali dengan etanol 70%. Setelah 24 jam, maserasi dihentikan dan disaring. Perlakuan maserasi selama 24 jam dilakukan secara berulang sampai 7 hari dimana warna etanol tidak mengalami perubahan warna. Dengan demikian, total waktu maserasi adalah 14 hari. Larutan etanol selanjutnya diuapkan sehingga didapat 50 ml ekstrak propolis dengan konsentrasi 11,54%. 4.7.3 Pengenceran Larutan Propolis Pembuatan formulasi larutan propolis dengan berbagai konsentrasi menggunakan metode pengenceran dengan menggunakan aquadest steril dengan rumus pengenceran: C 1 x V 1 = C 2 x V 2 C 1 dan V 1 merupakan konsentrasi dan volume awal, sedangkan C 2 dan V 2 adalah konsentrasi dan volume pengenceran yang di inginkan.
26 4.7.4 Persiapan Kultur Bakteri Campur Karies Dentin Profunda Sediaan bakteri campur karies dentin profunda dikultur langsung dari gigi penderita dengan karies dentin profunda dengan cara sebagai berikut: a. Lesi karies dentin profunda tanpa perforasi dibersihkan dari sisa makanan dengan cara berkumur terlebih dahulu, dan sisa makanan dalam lesi karies diambil menggunakan ekscavator, dan gigi tersebut di jaga tetap kering dari saliva saat pengambilan bakteri. b. Bakteri campur diambil dengan mengerok tipis jaringan dentin nekrotik menggunakan ekscavator steril, kemudian dimasukkan kedalam tabung BHIB (Brain Hearth Infusion Broth). c. Inkubasi selama 1 x 24 jam dengan suhu 37 o C. d. Setelah diinkubasi, bakteri distandardisasi dengan 0,5 Mc Farland (1,5 x 10 8 CFU/ml). 4.7.5 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal Ekstrak Propolis Terhadap Pertumbuhan Bakteri Karies Dentin Profunda Pengujian daya anti bakteri ekstrak propolis terhadap pertumbuhan bakteri campur karies dentin profunda dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode kontak langsung (Fitriannur, 2009). Dengan metode ini terjadi kontak langsung antara bakteri uji dengan ekstrak. Metode ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: a. Lakukan pengenceran pada ekstrak propolis. b. Sebanyak 0,7 ml suspensi bakteri ditanam dalam 5 ml ekstrak propolis berbagai konsentrasi uji. Kemudian inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam.
27 c. Setelah diinkubasi, lakukan strik subkultur pada media Mueller Hinton agar. Masing-masing kultur bakteri pada media BHIB diambil sebanyak 0,1 ml inokulum suspensi dari ekstrak propolis kemudian distrik pada media Mueller Hinton agar. d. Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam, kemudian amati pertumbuhan bakteri hasil strik. Hasil strik yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri di jadikan sebagai dugaan KHM. e. Ambil 0,1 ml inokulum dari 2 tabung diatas dugaan KHM, tabung dugaan KHM dan 2 tabung dibawah dugaan KHM kemudian masing-masing diratakan dengan cara swab pada media Mueller Hinton agar yang berbeda. f. Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam, kemudian amati jumlah koloni yang tumbuh. g. Kontrol positif dibuat dengan media padat Mueller Hinton agar yang ditambah dengan 0,1 ml suspensi bakteri bakteri uji tanpa penambahan ekstrak propolis. h. Kontrol negatif dibuat dengan media padat Mueller Hinton agar tanpa penambahan bakteri uji dan ekstrak propolis. i. Konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh minimal (KBM) ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media Mueller Hinton agar secara manual yang dinyatakan dengan colony forming unit (CFU) dan dibandingkan dengan kontrol positif dan kontrol negatifnya. Perhitungan tersebut diulang tiga kali oleh tiga pengamat yang berbeda
28 4.8 Pengecatan Gram Pada penelitian ini dilakukan pengecatan Gram untuk mengkonfirmasi kelompok bakteri yang tumbuh pada media tanam. Pengecatan Gram dilakukan menggunakan sampel bakteri dari kelompok kontrol positif dan kelompok konsentrasi hambat minimum untuk membedakan bakteri yang tumbuh tanpa atau dengan pemberian ekstrak propolis. 4.9 Perhitungan Statistik Data yang diperoleh dari hasil penelitian dikelompokkan, lalu ditabulasikan dan dianalisis dengan menggunakan program SPSS. Uji distribusi data dilakukan dengan uji statistik Shapiro Wilk. Untuk melihat apakah data yang terkumpul homogen, maka dilakukan uji homogenitas varian dengan uji statistik Levene s Test. Uji parametrik menggunakan tes One Way Anova dan tes post hoc LSD untuk melihat signifikansi perbedaan jumlah koloni bakteri antar kelompok penelitian.
29 4.10 Alur Penelitian Langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: Propolis Ekstrak maserasi Larutan propolis secara ekstrak Pembuatan larutan propolis berbagai konsentrasi dengan metode pengenceran Bakteri campur karies dentin profunda Tanam pada media cair BHIB Inkubasi suhu 37 o C, 1x24 jam Standardisasi dengan Mc Farland 0,5 0,7 ml Bakteri campur karies dentin profunda + 5 ml ekstrak propolis konsentrasi uji Inkubasi suhu 37 o C, 1x24 jam Strik pada media MH untuk memperoleh dugaan KHM Kontrol negatif 0,1ml inokulum dari tabung diatas dugaan KHM, tabung dugaan KHM dan 2 tabung dibawah dugaan KHM Subkultur pada media padat Mueller Hinton agar Kontrol positif Inkubasi suhu 37 o C, 1x24 jam Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada media Mueller Hinton agar secara manual yang dinyatakan dengan colony forming unit (CFU) oleh 3 pengamat berbeda Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) Penentuan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)