II. METODE PENELITIAN 2.1 Persiapan Ikan Uji Ikan nila (Oreochromis niloticus) BEST didatangkan dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor yang berukuran rata-rata 5±0,2g, dipelihara selama ± 40 hari sampai mencapai ukuran rata-rata 15±0,3g di dalam bak semen berdimensi 3x2x0,8 m 3. Ikan diberi makan dengan pakan komersial (FF 999) yang mengandung 38% protein, diberikan setiap 3 kali sehari sebanyak 3-5% dari bobot tubuh. Sebelum memulai penelitian, 3 ikan dipilih secara acak untuk dilakukan nekropsi (Giordano et al. 2010) (Lampiran 1). Ginjal dan otak diambil untuk pemeriksaan bakteriologis, bertujuan verifikasi bahwa ikan nila yang digunakan tidak mengandung bakteri Streptococcus agalactiae. 2.2 Pengujian Kerentanan Ikan Nila Terhadap Infeksi Bakteri S. agalactiae Pengujian kerentanan ikan nila terhadap bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik dilakukan dengan menggunakan metode uji LD 50. Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri yang dapat menyebabkan kematian ikan nila sebanyak 50% dari populasi dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Adapun tahapan kegiatan yang dilakukan pada uji LD 50 ini, antara lain: 2.2.1 Identifikasi Bakteri Uji Isolat bakteri S. agalactiae tipe β-hemolitik dan non-hemolitik diperoleh dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Bogor. Bakteri ini terlebih dahulu diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram (Lampiran 3). Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa isolat tersebut merupakan spesies bakteri yang diperlukan untuk kegiatan penelitian. 2.2.2 Penyediaan Bakteri Uji Isolat stok Streptococcus agalactiae pada BHIA di agar miring disegarkan atau dimudakan (fasase) dengan mengkultur isolat pada media agar miring yang dilakukan sebanyak 2 kali. Penyiapan inokulum bakteri S. agalactiae dengan cara dilakukan pengkulturan kedalam media cair (BHIB). Satu ose penuh biakan bakteri dari agar miring (padat) dikultur dalam 10 ml medium BHIB, diinkubasi dalam inkubator bergoyang (water bath shaker) pada 150 rpm, suhu 29-30 0 C 3
selama 24 jam. Kemudian biakan diambil dari media yang telah dikultur selama 24 jam sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml medium BHIB, diinkubasi dalam inkubator bergoyang (water bath shaker) pada 150 rpm, suhu 29-30 0 C selama 24 jam. Setelah itu bakteri siap dipanen. 2.2.3 Peningkatan Virulensi Bakteri Uji Kegiatan ini bertujuan untuk memperoleh bakteri yang paling patogen terhadap ikan nila sehingga siap digunakan untuk uji tantang yang dilakukan sesuai dengan prosedur postulat Koch. Ikan uji pada postulat Koch dimasukkan ke dalam 3 akuarium, antara lain: 2 akuarium untuk 2 tipe bakteri yang berbeda (tipe β-hemolitik dan non-hemolitik) dan 1 akuarium untuk kontrol (diinjeksi dengan BHIB) dengan padat tebar ikan uji 5 ekor per akuarium. Suspensi 2 tipe bakteri patogen masing-masing diinjeksi pada ikan uji. Ikan diamati setiap hari sampai menunjukkan gejala klinis dan kematian. Kemudian ikan diisolasi untuk diambil satu ose dari organ ginjal, mata dan otak. Diinokulasikan dengan metode penggoresan pada media BHIA. Koloni yang tumbuh, diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia dan sifat Gram, untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada postulat Koch. Kemudian bakteri tersebut digores di atas agar miring dan dilakukan kultur cair (seperti yang dilakukan diatas) untuk postulat Koch kembali yang dilakukan sebanyak 2 kali. 2.2.4 Uji LD 50 Uji LD 50 bertujuan untuk mengetahui tingkat kepadatan bakteri yang menyebabkan kematian sebanyak 50% populasi ikan nila dalam waktu 14-15 hari setelah penginfeksian. Hasil uji LD 50 selanjutnya akan digunakan pada pengujian distribusi bakteri di dalam tubuh, serta pengujian perubahan makroskopis dan mikroskopis akibat infeksi bakteri patogen. Ikan nila yang berukuran rata-rata 15±0,3g dimasukkan ke dalam akuarium yang berdimensi 60x30x30 cm 3 yang berisi air 30 L sebanyak 10 ekor ikan per akuarium dengan 3 ulangan setiap dosis, sebelumnya diadaptasikan ± 3 hari di dalam akuarium. Pengujian dilakukan dengan 6 perlakuan dosis kepadatan menggunakan dosis 10 3 hingga 10 8 CFU/ml untuk tipe β-hemolitik dan 10 3 hingga 10 8 CFU/ml untuk tipe non-hemolitik. Setelah itu dilakukkan injeksi dengan volume injeksi 0,1 ml/ekor secara 4
intramuskular. Menurut Sukenda (2000), ikan uji dengan berat 100 g menerima 1 ml suspensi bakteri dari 3 x 10 3 3 x 10 6 CFU/ml sebagai standar dari injeksi bakteri. Perubahan yang terjadi diamati serta dicatat selama 14 hari. Parameter perubahan yang diamati meliputi perubahan tingkah laku ikan yang dapat dijadikan sebagai indikator kesehatan ikan, berupa tingkah laku renang, gejala klinis anatomi tubuh eksternal, berupa morfologi tubuh, kecerahan warna tubuh dan mata, pendarahan pada tubuh, dan penjernihan operkulum. Mortalitas dicatat dan dihitung menggunakan rumus Effendi (2002), sebagai berikut: sementara dosis hasil dari LD 50 dihitung dengan rumus Reed & Muench (1938), sebagai berikut: Keterangan: A = Kematian diatas 50%; B = Kematian dibawah 50% Log negatif LD 50 = Log negatif konsentrasi diatas 50% + Selang Proporsi 2.3 Distribusi Bakteri S. agalactiae di dalam Tubuh Ikan Nila Pengujian ini bertujuan untuk mengamati distribusi dan jumlah koloni bakteri uji yang terdapat di hati, otak, ginjal, dan darah ikan nila. Infeksi dilakukan setelah diperoleh dosis LD 50 dari pengujian kerentanan ikan nila terhadap infeksi bakteri S. agalactiae tipe hemolitik dan non-hemolitik. Metode penginfeksian digunakan dosis LD 50. Sebanyak 18 ekor ikan untuk setiap perlakuan bakteri S. agalactiae tipe β-hemolitik dan tipe non-hemolitik. Prosedur kerja sama dengan uji LD 50. Setelah inokulasi bakteri, 1 ekor ikan dikorbankan dari setiap kelompok mulai dari hari ke 0, 3, 6, 9, 12, dan 15. Kemudian ikan diambil darahnya dari pembuluh darah caudal dengan menggunakan syringe (1 ml). Ikan nila kemudian dimatikan, diambil secara aseptis sampel dari organ hati, otak dan ginjal. Jaringan dan darah dibuat dengan menghomogenisasi sampel organ dalam larutan PBS steril. Masing-masing organ ditimbang sebanyak 0,1 g, selanjutnya organ tersebut dimasukkan ke dalam eppendorf lalu digerus dan ditambakan PBS 0,9 ml. 5
Organ dan darah dihomogenkan dan dibuat pengenceran serial 10 kali dengan larutan PBS steril. Kemudian dilakukan pengenceran serial (sampai dengan 10-8 ). Prosedur kerjanya yaitu eppendorf diisi dengan 0,9 ml PBS. Setelah itu, suspensi bakteri diambil 0,1 ml dari larutan stok kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf 10-1, divortex, berikutnya diambil 0,1 ml dimasukkan dalam eppendorf yang berisi 0,9 ml PBS berlabel 10-2. Pengenceran tersebut dilakukan secara aseptis sampai dengan pengenceran 10-8. Selanjutnya suspensi bakteri hasil dari setiap pengenceran diambil 25 m lalu dikultur pada media agar padat dengan cara disebar pada media BHIA (dilakukan duplo). Setelah diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam, koloni bakteri S. agalactiae yang tumbuh diamati dan dihitung secara TPC dengan metode cawan tuang. Populasi bakteri yang tumbuh ditentukan dalam Colony Forming Unit (CFU/ml) dan dihitung dengan rumus Fardiaz (1993), sebagai berikut: Dimana: PM = Populasi bakteri (CFU/ml) K = Jumlah koloni A = Volume inokulasi dalam media pengencer (ml) B = Pada pengenceran keberapa koloni bakteri dihitung 2.4 Perubahan Makroskopis dan Mikroskopis Akibat Infeksi Bakteri S. agalactiae pada Ikan Nila Perubahan makroskopis dan mikroskopis, parameter yang diamati meliputi: patologi anatomi organ internal secara makroskopis, berupa perubahan bentuk, ukuran, konsistensi dan warna organ hati dan ginjal, sedangkan secara mikroskopis diamati tingkat kerusakan jaringan organ hati, otak, dan ginjal, dengan menggunakan metode histopatologis. Prosedur kerja sama dengan uji LD 50 dan uji distribusi bakteri patogen di dalam tubuh ikan nila. Ikan yang digunakan berjumlah 24 ekor untuk setiap tipe bakteri, 1 ekor dikorbankan dari setiap kelompok mulai dari hari ke- 0, 3, 6, 9, 12, dan 15, ikan dimatikan dan dilakukkan nekropsi. Organ hati, otak dan ginjal dilakukan pengamatan patologi anatomi internal secara makroskopis, setelah selesai diambil untuk dibuat preparat histopatologi, kemudian diamati dengan mikroskop. 6
Prosedur pembuatan preparat histopatologi melalui 4 tahapan, yaitu fiksasi atau pengawetan jaringan, perlakuan jaringan, pemotongan jaringan dan pewarnaan jaringan. Sampel yang digunakan merupakan potongan organ tubuh ikan sebagai tahap permulaan pembuatan sediaan histopatologis yang difiksasi dalam larutan fiksatif Bouin s. Larutan Bouin s dibuat dari campuran asam pikrat jenuh 21 g/l, formaldehyde solution min. 37%, dan acetic acid glacial 100%, dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Pada penelitian ini organ tubuh yang digunakan untuk sediaan histopatologis adalah hati, otak, dan ginjal. Sampel organ kemudian direndam dalam larutan fiksatif Bouin s selama 24 jam. Sebelumnya jaringan dipotong dengan ukuran kira-kira 1 x 1 cm. Potongan organ selanjutnya dilakukan proses jaringan yang terdiri dari beberapa tahap antara lain proses dehidrasi (pengambilan cairan dalam sel/jaringan), clearing (penjernihan), impregnasi (penyusunan paraffin) selanjutnya jaringan siap dibuat blok (melalui proses embedding) (Lampiran 5). Proses ini bertujuan untuk membuat sediaan dalam blok paraffin sebagai penunjang yang sangat diperlukan dalam proses pemotongan. Paraffin cair mulamula dituang ke dalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok. Sediaan diambil dengan pinset dan diletakkan di paraffin cair mula-mula dituang ke dalam wadah cetakan sebagai dasar pembuatan blok. Sediaan diambil menggunakan pinset dan diletakkan dalam blok tersebut, kemudian bahan embedding dituang hingga memenuhi cetakan dengan sediaan di dalamnya. Blok kemudian ditempel pada holder atau blok kayu. Sediaan yang telah ditanam dalam blok paraffin siap untuk dipotong dengan menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan dibuat preparat. Pemotongan diusahakan agar sambung menyambung berbentuk pita. Selanjutnya potongan pita diapungkan dalam air suam kuku (hangat kuku), agar jaringan dalam paraffin teregang. Objek glass yang bersih sebelumnya direndam dahulu dalam methanol. Jaringan diangkat dari air dengan objek glass dan selanjutnya dikeringkan dengan suhu 40 o C selama 24 jam lalu jaringan diwarnai. Proses pewarnaan jaringan dilakukan dengan cara memasukkan preparat/sediaan ke dalam larutan pewarna hemaktosilin selama 3-5 menit, dicuci dalam air mengalir, dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam larutan pewarna 7
eosin selama 3 menit. Untuk menghilangkan kelebihan warna maka preparat dicuci dalam air mengalir selama 5 menit. Selanjutnya dilakukkan pencelupan ke dalam alkohol 50%, 70%, 85%, 90%, alkohol absolut I dan alkohol absolut II masing-masing selama 2-3 menit. Dilanjutkan dengan pencelupan ke dalam larutan xylol I dan II masing-masing selama 2-3 menit. Kemudian preparat jaringan, ditutup dengan cover glass yang sudah ditetesi dengan entellan neu, dikeringkan pada suhu 40 o C selama 24 jam, berikutnya dapat diamati di bawah mikroskop (Lampiran 6). 2.5 Analisis Data Data penelitian berupa pengujian kerentanan ikan nila terhadap infeksi bakteri S. agalactiae meliputi mortalitas (Effendi 2002), LD 50 (Reed & Muench 1938) dan gejala klinis; distribusi bakteri S. agalactiae di dalam tubuh ikan nila; serta perubahan makroskopis dan mikroskopis akibat infeksi bakteri S. agalactiae pada ikan nila dianalisis secara deskriptif. Data pendukung berupa data kualitas air dicatat untuk memberikan informasi kisaran minimum dan maksimum kualitas air selama pemeliharaan ikan nila yang diinterpretasikan secara deskriptif sesuai dengan kelayakan hidup ikan nila. 8