5 TINJAUAN PUSTAKA Tulang Tulang merupakan bagian substansial pada sistem skeletal manusia. Jaringan tulang mempunyai empat fungsi utama antara lain fungsi mekanik yaitu sebagai penyokong tubuh dan tempat melekatnya jaringan otot untuk pergerakan, fungsi protektif yaitu sebagai pelindung berbagai alat vital dalam tubuh dan sumsum tulang, fungsi metabolik yaitu sebagai cadangan dan tempat metabolisme berbagai mineral yang penting seperti kalsium dan fosfat, fungsi hemopetik yaitu sebagai tempat berlangsungnya proses pembentukan dan perkembangan sel darah 9-11. Dilihat dari bentuknya, tulang terbagi menjadi tulang panjang, tulang pendek, tulang pipih dan tulang tak sama bentuk. Tulang panjang (Gambar 1a) merupakan tulang dengan ukuran yang panjang 9,11. Tulang ini terdiri dari epiphyses dan diaphyses. Diaphyses terdapat pada bagian tengah, di dalamnya terdapat medullar cavity sebagai tempat sumsum tulang. Epiphyses terdapat pada ujung tulang panjang terdiri dari tulang spon yang terbungkus oleh lapisan tulang padat. Contoh tulang panjang antara lain tulang lengan, paha dan punggung. Tulang pendek strukturnya hampir sama dengan tulang panjang, namun pada tulang ini tidak terdapat medullar cavity. Contoh tulang jenis ini antara lain tulang-tulang pergelangan tangan dan kaki. Tulang pipih berbentuk pipih, tipis dan melengkung. Tulang-tulang ini berfungsi sebagai tempat pelekatan otot-otot dan melindungi organ-organ di bawahnya. Contoh tulang jenis ini antara lain tulang-tulang rusuk, tulang kepala dan tulang rahang. Tulang tak sama bentuk adalah tulang-tulang yang bentuknya berbeda dengan bentuk tulang yang telah dijelaskan sebelumnya. Contoh tulang jenis ini tulang belakang dan tulang telinga tengah. Secara radiologis tulang dibedakan menjadi dua, yaitu tulang padat (compact bone) dan tulang jala (Gambar 1b) dengan struktur menyerupai spon (spongy bone). Jumlah tulang jala dalam tubuh relatif lebih banyak dibandingkan tulang padat.
6 (a) (b) Gambar 1 tulang panjang (a) dan tulang padat serta tulang jala (b). 10 Komposisi Tulang Secara umum tulang tersusun oleh 55% material anorganik (mineral tulang), 30% organik dan 15% air 7,12,13. Penyusun dasar komponen anorganik tulang adalah kalsium fosfat. Senyawa kalsium fosfat dalam tulang disebut juga apatit biologi. Mineral-mineral lain yaitu magnesium, fluoride dan sodium. Selain itu terdapat pula mineral lain dalam jumlah kecil yaitu natrium dan kalium. Penyusun utama mineral tulang manusia secara umum dapat dilihat pada Tabel 1. Organik tulang terdiri dari 2% sel dan 98% osteosid. Sel dalam tulang terdiri dari sel osteoblas sebagai sel pembentuk tulang, sel osteosit untuk mempertahankan mineral tulang dan sel osteoklas sebagai sel yang menyerap tulang. Osteosid terdiri dari matrik tulang yang mengandung sedikit mineral, disebut juga sebagai tulang muda. Komposisi osteosid adalah 90% zat kolagen dan 10% zat nonkolagen seperti protein, glikoprotein, peptida, karbohidrat dan lemak. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya terhadap karakter tulang manusia diperoleh informasi bahwa mineral tulang manusia berbeda-beda bergantung pada jenis tulang, usia dan jenis kelamin 12. Tulang kepala memiliki mineral lebih tinggi dibandingkan tulang paha dan tibia. Mineral yang terdapat pada tulang paha dan tibia lebih banyak dari pada tulang iga. Kandungan mineral
7 tulang meningkat seiring dengan peningkatan usia sampai masa puncak pertumbuhan, kemudian berkurang kembali sampai usia lanjut. Berdasarkan jenis kelamin, perempuan memiliki kandungan mineral lebih rendah dari pada lakilaki 12. Tabel 1 Kandungan unsur mineral secara umum dalam tulang 14 Unsur Kandungan (% berat) Ca 34 P 15 Mg 0,5 Na 0,8 K 0,2 C 1,6 Cl 0,2 F 0,08 Zat sisa 47,62 Kalsium Fosfat dalam Tulang Secara umum penyusun utama komponen anorganik tulang adalah kalsium fosfat. Senyawa ini mempunyai dua fase, yaitu amorf dan kristal. Kalsium fosfat amorf (KFA) bersifat nonstoikiometri, fase ini terjadi akibat masuknya ion sederhana maupun ion komplek ke dalam kisi kristal, akibatnya komposisi kristal jadi bervariasi 13,15,16. Senyawa kalsium fosfat berbentuk kristal hadir dalam empat fase, yaitu dikalsium fosfat (DKFD, CaHPO 4.2H 2 O), okta kalsium fosfat (OKF, Ca 8 H 2 PO 4.5H 2 O), trikalsium fosfat (TKF, Ca 3 (PO 4 ) 2 ) dan hidroksi apatit (HA, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ). Hidroksiapatit (HA) merupakan kristal paling stabil dibandingkan empat fase lain dengan nilai perbandingan Ca/P sebesar 1,67. Kristal ini memiliki struktur heksagonal (Gambar 2) dengan parameter kisi a = b= 9,423 Å dan c = 6.881 Å dengan sudut α = β = γ = 90 o2-4. Dalam tubuh manusia terdapat beberapa ion selain ion pembentuk kalsium fosfat antara lain CO 2-3, Mg 2+, Na +, K +, F -1 dan Cl -1. Kehadiran ion-ion tersebut dapat menggantikan ion kisi dalam kristal stabil
8 hidroksiapatit. Pada kenyataannya, kristal apatit tulang dalam tubuh banyak mengandung karbon dalam bentuk karbonat. Ion karbonat dapat mensubstitusi ion OH - dan (PO 4 ) 3-. Jika OH - disubstitusi oleh karbonat disebut apatit karbonat tipe A (AKA), jika (PO 4 ) 3- yang disubstitusi oleh karbonat disebut apatit tipe B (AKB) 14-16. Gambar 2 Struktur Hidroksiapatit. 13 Ion-ion tubuh yang hadir akan menyebabkan nilai perbandingan Ca/P semakin besar apabila mensubstitusi ion (PO 4 ) 3-. Substitusi ion-ion kisi pada kristal hidroksiapatit dapat menyebabkan apatit biologi pada tulang mempunyai kristalinitas rendah dan nonstoikiometri. Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa nilai Ca/P pada tulang manusia lebih besar dari nilai Ca/P pada HA, dengan demikian tulang manusia didominasi oleh apatit tipe B 12,17. Peneliti sebelumnya telah melakukan analisa XRD dan FTIR pada sampel tulang tibia laki-laki dewasa 17, yang masing-masing diperlihatkan oleh Gambar 3 dan Gambar 4. Pola XRD dan FTIR pada kedua Gambar tersebut memperlihatkan adanya campuran antara HA dan AKB pada tulang manusia. Dari pola XRD Gambar 3 terlihat intensitas tertinggi terjadi pada sudut difraksi AKB, keberadaan karbonat pada tulang manusia ini diperkuat oleh pola FTIR Gambar 4 yang memperlihatkan adanya pita serapan CO 3.
9 Gambar 3 Pola XRD tulang tibia laki-laki dewasa. 17 ν 2 CO 3 T ν 1PO 4 ν 3 CO 3 OH ν 4 PO 4 ν 3 PO 4 Bilangan Gelombang (cm -1 ) Gambar 4 Spektra FTIR tulang tibia laki-laki dewasa. 17 Sintesa Senyawa Kalsium Fosfat Biokeramik kalsium fosfat telah lama diaplikasikan dalam bidang medis dan kedokteran gigi. Salah satu senyawa kalsium fosfat yang banyak dikembangkan oleh para peneliti adalah hidroksiapatit (HA), karena memiliki sifat biocompatible dan osteokonduktif. Biokompatibel didefinisikan sebagai kemampuan material bersama dengan material atau organ lingkungannya dalam memberi tanggapan pada aplikasi khusus, sedangkan osteokonduktif adalah kemampuan untuk merangsang pertumbuhan osteoblas. Selain itu HA memiliki kesamaan dengan
10 apatit tulang, komponen utama fase inorganik tulang, yang berperan pada proses kalsifikasi dan resorpsi tulang 13. Pada pertengahan tahun 1970, tiga kelompok peneliti, Jarcho dkk (USA), Groot dkk (Eropa), dan Aoki dkk (Jepang) mengembangkan serta mengkomersialisasikan HAP sebagai biomaterial untuk substitusi dan perbaikan tulang 13. Fase-fase keramik kalsium fosfat lain yaitu DKFD, OKF, dan TKF dapat digunakan pada bidang medis, sesuai dengan sifat serta kegunaan masing-masing. Beberapa metode yang selama ini berkembang dalam preparasi senyawa kalsium fosfat antara lain presipitasi (metode basah), solid-state reaction (metode kering), hydrothermal exchange, dan metode sol-gel 3-6. Sintesa serbuk senyawa kalsium fosfat seperti HA dapat dilakukan dengan mereaksikan prekursor kalsium (Ca) dan fosfat (PO 3-4 ), antara lain kalsium nitrat tetrahidrat [Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O] dengan diammonium hidrogen ortofosfat [(NH 3 ) 2 HPO 4 ] dan kalsium hidroksida [Ca(OH) 2 ] dengan asam fosfat [H 3 PO 4 ] 18,19. Produk yang dihasilkan dari reaksi prekursor Ca dan PO 3-4 tergantung pada metode yang digunakan, temperatur dan ph larutan saat sintesa. Dari beberapa metode yang ada, metode presipitasi merupakan metode yang paling sederhana, murah dan mudah untuk diaplikasikan pada bidang industri. Beberapa penelitian sebelumnya dalam pembuatan senyawa kalsium fosfat sintetis melalui metoda presipitasi diketahui bahwa apatit karbonat tipe A dapat dibentuk pada suhu tinggi dan mayoritas apatit tipe B dapat dibentuk pada suhu rendah. Selain menggunakan bahan-bahan sintetis, kristal apatit dapat pula disintesa dari bahan alam. Ada kemungkinan bahwa penggunaan bahan alami dalam pembuatan biomaterial substitusi tulang lebih dapat diterima oleh tubuh, karena kesamaan sifat fisiko kimia dengan tulang sebenarnya. Koral memiliki kandungan kalsium karbonat (CaCO 3 ) tinggi yaitu 99%, peneliti sebelumnya telah berhasil mengkonversi koral menjadi HA melalui proses hydrothermal exchange dengan penambahan larutan diamonium fosfat 4. Gambar 5 memperlihatkan pola XRD HA yang dibuat dari koral (coralline HA). Penggunaan koral sebagai sumber CaCO 3 dapat menimbulkan kerugian akibat perusakan bongkahan koral yang merupakan ekosistem tempat hidup ganggang. Pada 1999 G. Fellicio dkk berhasil membuat HA nonstoikiometri dengan memanfaatkan ganggang laut melalui proses
11 hydrothermal 6. Diyakini bahwa metode ini dapat mempertahankan struktur pori pada CaCO 3 serta penggunaan energi yang relatif rendah. (b) Intensitas (a) 2θ (derajat) Gambar 5 Pola XRD corraline HA (a) dan corraline HA yang dipanaskan pada suhu 900 o C selama 2 jam (b) (hasil penelitian M. Sivakumar dkk). Pada 2005 Prabakaran dkk telah berhasil melakukan sintesa HA menggunakan cangkang telur dengan asam fosfat melalui metode presipitasi dan pengeringan pada suhu 80 o C, 400 o C, 700 o C dan 900 o C 7. Dari penelitian tersebut diperoleh fase HA dengan substitusi ion karbonat pada gugus fosfat (AKB) dengan pengeringan pada suhu 80 o C. Gugus karbonat semakin rendah dengan pemanasan sampai suhu 900 o C. Spektra FTIR dan pola XRD sampel yang dibuat oleh Prabakaran dkk dengan pengeringan pada suhu 80 o C diperlihatkan pada Gambar 6 dan Gambar 7. Gambar 6 Spektra FTIR Kristal apatit dari cangkang telur ayam yang dipanaskan pada suhu 80 o C (hasil penelitian Prabakaran dkk).
12 Gambar 7 Pola XRD Kristal apatit dari cangkang telur ayam yang dipanaskan pada suhu 80 o C (hasil penelitian Prabakaran dkk). Berdasarkan penelitian sebelumnya dapat disimpulkan bahwa produk yang dihasilkan dari sintesa senyawa kalsium fosfat sangat berkaitan erat dengan prekursor yang digunakan serta metode yang dipilih. Setiap prekursor memiliki perbedaan aktivitas kimia sehingga temperatur yang diperlukan serta kondisi selama proses pembentukan struktur apatit bergantung pada sifat kimia prekursor 5. Komposit Bioaktif Kombinasi dua atau lebih fase material yang saling berikatan sehingga terjadi transfer tekanan melewati batas antar fase disebut komposit. Tulang merupakan salah satu contoh komposit berskala nano, karena tulang merupakan kombinasi dari fase organik (kolagen) sebagai matrik dan fase inorganik (mineral apatit) 9,13. Pada perkembangannya, biomaterial yang dibuat untuk substitusi tulang didasarkan pada konsep bahwa material paling baik untuk mengganti tulang adalah material yang memiliki kesamaan, paling tidak identik dengan tulang sebenarnya 13. Sehingga untuk mendekati karakter ilmiah tulang, mineral apatit dikompositkan dengan matriks polimer. Polimer yang akan digunakan sebagai
13 matriks harus memenuhi syarat bioaktif, biodegradabel, biokompatibel serta tidak beracun. Pada permulaan tahun 1980 mulai dibuat komposit bioaktif dengan mendispersikan partikel HA pada high density polyethylene (HDPE). Matriks polimer lain yang dapat digunakan dalam pembuatan komposit bioaktif antara lain kolagen, kitosan, asam polylactic, polyactides, polymethylmethacrylate (PMMA) 13. Kitosan Kitosan merupakan senyawa turunan kitin, senyawa penyusun rangka luar hewan berkaki banyak seperti kepiting, ketam, udang, dan serangga. Nama kitin (chitin) berasal dari bahasa Yunani yang artinya jubah atau amplop. Kitosan dan kitin termasuk senyawa kelompok polisakarida 20,21. Secara kimiawi kitin merupakan polimer (1-4)-2-asetamido-2-deoksi-B-Dglukosamin yang dapat dicerna oleh mamalia, sedangkan kitosan merupakan kitin yang dihilangkan gugus asetilnya dengan menggunakan basa pekat sehingga bahan ini merupakan polimer dari D-glukosamin 21-23. Struktur kitosan diperlihatkan oleh Gambar 8. Kitosan merupakan salah satu polimer alami yang secara luas digunakan pada teknologi teknik jaringan termasuk teknologi jaringan untuk tulang. Aplikasi kitosan didasarkan pada sifatnya antara lain biocompatible dan terdegradasi oleh enzim pada tubuh tanpa meninggalkan racun, tidak karsinogenik, serta osteokonduktif. Sifat osteokonduktif yang dimiliki oleh kitosan dapat mempercepat pertumbuhan osteoblas sehingga mempercepat pembentukan sel-sel tulang 20,22. Gambar 8 Struktur monomer kitosan. 20,24 Pada pemanfaatannya kitosan dapat dibentuk dalam berbagai bentuk dan dapat dibentuk menjadi struktur berpori melalui proses lyophilization. Pada 2006,
14 Lijun kong dkk melakukan uji biokompatibilitas dan bioaktivitas pada kitosan murni berpori dan komposit kitosan-12% nano HA (Gambar 9) melalui inkubasi dalam larutan simulated body fluid (SBF) serta uji aktivitas preosteoblas 20. Setelah inkubasi pada larutan SBF, komposit kitosan-nano HA dapat membentuk apatit lebih cepat selama proses biomimetic dibandingkan dengan kitosan murni. Hal tersebut mengindikasikan bahwa komposit memiliki aktivitas biomineral lebih baik dibandingkan kitosan murni. Pada jaringan komposit, partikel HA menyediakan nuclei dalam proses mineralisasi. Hasil analisa SEM memperlihatkan ukuran partikel apatit yang terbentuk pada jaringan kitosan lebih besar dibandingkan pada komposit. Sementara itu, jumlah apatit yang tumbuh pada kitosan lebih sedikit dibandingkan apatit yang tumbuh pada komposit dengan partikel yang lebih padat. Penambahan nano HA pada kitosan meningkatkan bioaktivitas tulang dan proliferasi serta diferensiasi sel, sehingga kitosan dapat digunakan pada teknologi jaringan tulang 20. Gambar 9 Hasil analisa SEM struktur berpori kitosan (a) dan komposit kitosan- 12% nano HA (b) dengan perbesaran 80x (penelitian Lijun kong dkk). Hyeong-Ho Jin dkk telah berhasil melakukan sintesa komposit HA/kitosanalginate berpori melalui metode presipitasi secara in situ 23. Untuk memperoleh
15 komposit HA/kitosan alginate, H 3 PO 4 dan Ca(OH) 2 masing-masing ditambahkan ke dalam larutan kitosan dan larutan alginate. Suspensi yang diperoleh kemudian diaduk dengan kecepatan tetap selama 1 jam. Asam asetat diteteskan hingga ph suspensi 7,4. Selanjutnya sampel dibekukan pada suhu -15 o C dan dilyophilisasi pada suhu -80 o C selama 24 jam. Morfologi sampel komposit yang diperoleh dari penelitian Hyeong-Ho Jin dkk diperlihatkan pada Gambar 10. Dari Gambar 10 terlihat bahwa semakin banyak HA yang ditambahkan pada kitosan ukuran diameter pori menurun. Hasil ini memperlihatkan bahwa sekali nuclei HA terbentuk pada permukaan skeleton kopolimer, HA tersebut akan tumbuh dan menyebar pada permukaan skeleton 23. (a) (b) (c) Gambar 10 Hasil analisa SEM komposit HA/kitosan-alginate dengan penambahan HA 0% (a), 10% (b) dan 30% (c) (penelitian Hyeong-Ho Jin dkk). Pada 2007 Devendra Verma dkk telah melakukan sintesa nanokomposit HA-kitosan (50:50), HA-asam poligalakturonik (PgA) (50:50) dan kitosan-ha-
16 PgA melalui proses mineralisasi secara in situ 24. Pola XRD masing-masing sampel komposit yang diperoleh dari penelitian tersebut diperlihatkan dalam Gambar 11. Berdasarkan analisa sifat mekanik, terjadi peningkatan modulus elastis, kekuatan tekan, dan strain (regangan) pada sampel komposit kitosan-ha- PgA. Peningkatan respon mekanik pada komposit kitosan-ha-pga berkaitan dengan interaksi interfacial yang kuat antara kitosan dan PgA 24. Intensitas Gambar 11 Pola XRD komposit kitosan-pga-ha (a), kitosan-ha (b), dan PgA- HA (penelitian Devendra Verma dkk).