Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker

Artikel Penelitian Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 ABSTRACT: Dry extract of sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) water/n-butanol fraction is native plant from Papua is proven to be active against cancer cells. This research aims to improve the quality of extracts of sarang semut become the raw material that meets the standards of medicinal plant extracts in the fulfillment of the quality of the extracts into anticancer Standardized Herbal Medicine / Obat Herbal Terstandar (OHT). Extraction with ultrasonic methods (1:10 with methanol) and fractionation with water:butanol (1:1) as much as 1:20. Standardization and data analysis based on parameters of the Medicinal Plant Extracts (Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000) and BPOM RI Regulation No. 12, Year 2014 about quality requirements of traditional medicine. Dry extract of sarang semut (water/n-butanol fraction) met the standards of raw material preparation for OHT with organoleptics shaped dried extracts, dark brown color, aromatic smell, and has a sour-bitter taste. Moisture content was 9,259 ± 0.001 ( 10%). Total Plate Count was 5 x 103 colonies/g (< 104 colonies/g). Yeast and Mold Count was 0,5 x 101 colonies/g (< 103 colonies/g). Pathogenic bacteria test shows that MPN Coliform value was 0 colonies/g and negatively to the presence of Escherichia coli, Salmonella sp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Shiggella sp. The extract was not detected the presence of aflatoxin total (aflatoxin B1, B2, G1 and G2). The content of heavy metal Cd was 0,0052 ± 0.0005 ppm ( 0.3 ppm) and heavy metals Pb was 0,9429 ± 0,0087 ppm ( 10 ppm). Keywords: Extract of sarang semut, standardization, standardized herbal medicine Prodi S1 Farmasi, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional, Surakarta Korespondensi: Novena, Email: novena_yl@yahoo.com ABSTRAK: Ekstrak kering sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) fraksi air/n-butanol merupakan tanaman asli Papua yang terbukti aktif terhadap sel kanker. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan kualitas ekstrak sarang semut menjadi raw material yang memenuhi standar ekstrak tumbuhan obat dalam pemenuhan mutu ekstrak menjadi obat herbal terstandar (OHT) antikanker. Pembuatan ekstrak dengan metode ekstraksi ultrasonic (1:10 dengan metanol) dan fraksinasi dengan air:butanol (1:1) sebanyak 1:20. Standarisasi dan analisis data dilakukan berdasarkan Parameter Ekstrak Tumbuhan Obat (Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000) dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. Ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) memenuhi standar raw material sediaan OHT dengan organoleptis berbentuk serbuk kering, warna coklat tua, bau aromatis, dan memiliki rasa asam sepat pahit. Kadar air sebesar 9,259±0,001 ( 10%). Angka lempeng total sebesar 5x10 3 koloni/g (< 10 4 koloni/g). Angka kapang khamir sebesar 0,5x10 1 koloni/g (< 10 3 koloni/g). Uji mikroba patogen menunjukkan nilai MPN Coliform 0 koloni/g dan negatif terhadap keberadaan Escherichia coli, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Shiggella spp. Ekstrak tidak terdeteksi adanya aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2). Kandungan logam berat Cd sebesar 0,0052±0,0005 ppm ( 0,3 ppm) dan logam berat Pb sebesar 0,9429±0,0087 ppm ( 10 ppm). Kata kunci: Ekstrak sarang semut, standarisasi, obat herbal terstandar 193

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker PENDAHULUAN Potensi kekayaan alam Indonesia bagi pengembangan bahan baku obat tradisional (BBOT) dan produk obat tradisional sangat tinggi mengingat Indonesia merupakan salah satu pusat keragaman hayati terbesar (mega biodiversity) di dunia. Pengembangan bahan baku obat tradisional merujuk pada aspek mutu, kepastian keamanan dan khasiat dari simplisia maupun ekstrak untuk memenuhi persyaratan mutu dan menjamin keamanan serta khasiat, sesuai yang ditetapkan oleh Kementrian Kesehatan dan Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) (1). Tanaman sarang semut (Myrmecodia pendens Merr & Perry) yang berasal dari Papua, Irian Jaya, merupakan tanaman asli Indonesia yang terbukti aktif sebagai antikanker. Ekstrak air sarang semut menunjukkan aktivitas antikanker terhadap sel kanker (sel HeLa dan MCM-B2), aktivitas antikanker ekstrak air lebih tinggi daripada ekstrak etilasetat dan n-butanol (2). Fraksi etanol sarang semut menunjukkan aktivitas antikanker dan antiproliferasi pada lidah manusia SP-C1 (3). Ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol mampu menghambat sel kanker paru pada tikus putih yang diinduksi DMBA (4). Berdasarkan tanaman sarang semut mengandung senyawa flavonoid, tanin, dan polifenol yang berfungsi sebagai antioksidan (5), Proses standarisasi perlu dilakukan terhadap ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n butanol) yang aktif sebagai antikanker. Dalam pemenuhan sediaan obat herbal terstandar, maka raw material ekstrak harus memenuhi standar mutu produk jadi berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI No: 55/Menkes/ SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No. 12 Tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional meliputi uji organoleptis, penetapan kadar air, uji cemaran mikroba, uji aflatoxin total, dan uji cemaran logam berat (8). Penelitian ini berkonstribusi dalam peningkatan bentuk sediaan ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n butanol) menjadi sediaan obat herbal terstandar antikanker melalui proses standarisasi serta siap dipasarkan. METODOLOGI PENELITIAN Tahapan dan Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan melalui beberapa tahapan. Tahap pertama pembuatan ekstrak sarang semut meliputi persiapan sampel, ekstraksi ultrasonik, partisi sampel. Tahap kedua dilakukan standarisasi ekstrak sarang semut berdasarkan parameter standar umum non spesifik ekstrak tumbuhan obat berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI No: 55/Menkes/ SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No. 12 Tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional meliputi uji organoleptis, penetapan kadar air, uji cemaran mikroba, uji aflatoxin total, dan uji cemaran logam berat (8). 1. Tahap pertama Tahapan pertama pembuatan ekstrak sarang semut (3) secara skematis dilakukan dengan alur seperti pada gambar 1. a. Persiapan sampel Sampel berupa irisan umbi sarang semut sebanyak 2 kilogram dikeringkan. Umbi sarang semut yang telah dikeringkan dilanjutkan ke tahap berikutnya. Sarang Semut kering disortir kemudian dicuci sampai bersih, kemudian dikeringkan dengan sinar matahari selama ± 2 hari hingga kandungan air mencapai ±10%. Setelah proses pengeringan selesai, dilakukan proses pengecilan ukuran dengan menggunakan hammer mill sampai menjadi bubuk kemudian dilakukan pengayakan bubuk Sarang semut dengan menggunakan ayakan yang berukuran 10 mesh hingga diperoleh serbuk sarang semut kurang lebih sebanyak 1 kilogram. b. Ekstraksi ultrasonik Serbuk sarang semut sebanyak 1 kilogram dibagi menjadi 4 bagian (masing-masing 250 194

Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 Sarang Semut Serbuk Sarang Semut Ekstraksi Ultrasonic dengan Metanol (1:10) selama 50 menit Fraksinasi dengan n-butanol dan air 1:1 Fraksi air Fraksi n-butanol Standarisasi parameter umum non spesifik ekstrak tumbuhan obat Tidak dipakai Gambar 1. Skema alur penelitian tahap I gram), kemudian tiap bagian ditambahkan pelarut metanol dimasukkan ke dalam bekker gelas dengan rasio bubuk terhadap pelarut metanol 1:10, dimasukkan ke dalam ultrasonic cleaning bath selama 50 menit pada suhu kamar. Setelah proses ekstraksi selesai, hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring whatman, kemudian pelarut diuapkan dengan menggunakan rotary vacum evaporator (Yamato RE 200) sehingga didapatkan produk sarang semut kental. c. Partisi sampel Ekstrak metanol dilakukan partisi menggunakan butanol air 1:1 dengan perbandingan ekstrak dengan pelarut sebesar 1:20. Hasil partisi ini didapatkan ekstrak kental butanol/air dan air/butanol, selanjutnya ekstrak air/butanol dikeringkan. fraksi air/n-butanol (sesuai tahapan pertama) berdasarkan parameter standar umum non spesifik ekstrak tumbuhan obat dengan alur seperti pada gambar 2. a. Uji Organoleptis Uji organoleptis dilakukan dengan pengamatan terhadap bentuk, rasa, bau dan warna ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) b. Uji Kadar Air Penetapan kadar air dilakukan dengan metode gravimetri; ditimbang dengan seksama 2 gram ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) kemudian dimasukkan ke dalam moisture balance. c. Uji Cemaran mikroba 2. Tahap kedua Tahapan kedua dilakukan standarisasi ekstrak kering sarang semut yang berasal dari 1) Angka Lempeng Total Disiapkan 5 tabung atau lebih yang masingmasing telah diisi dengan 9 ml pengencer NaCl 195

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker Ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) Standarisasi Parameter Non Spesifik dalam Pemenuhan Standar Mutu Obat Tradisional Uji Organoleptis Uji Kadar Air Uji Cemaran Mikroba Uji Aflatoxin Total Uji Cemaran Logam Berat 1) Angka Lempeng Total 2) Angka Kapang Khamir 3) Uji Mikroba Patogen 1) Pb 2) Cd Gambar 2. Skema alur penelitian tahap II 0,9 %. Hasil homogenasi pada penyiapan ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) dipipet pengeceran 10-1 sebanyak 1 ml ke dalam tabung yang berisi pengencer NaCl 0,9 % pertama hingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dikocok hingga homogen. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-6. Dipipet 1 ml dari setiap pengenceran ke dalam cawan petri. Dipipet 1 ml dari setiap pengenceran, tuangkan pada cawan petri. Ke dalam cawan petri dituangkan ±15 ml media NA Tegak (Nutrient Agar) yang sudah dicairkan, segera digoyang sambil diputar agar suspensi tersebar merata dan dibuat duplo, biarkan memadat. Lakukan uji untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer blangko, biarkan memadat. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 35-37 C selama 24-48 jam dengan posisi terbalik, jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung (6). Semut (Fraksi air/n-butanol) pada pengenceran 10-1 ke dalam tabung pertama hingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dikocok sampai homogen. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-4. Dipipet 1 ml dari setiap pengenceran, tuangkan pada cawan petri. Ke dalam cawan petri dituangkan ± 15 ml media PDA (Potato Dextrose Agar), segera digoyang sambil diputar agar suspensi tersebar merata dan dibuat duplo, biarkan memadat. Lakukan uji untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer blangko, biarkan memadat. Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-25 C selama 5 hari. Sesudah 5 hari inkubasi, dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh. Koloni ragi dibedakan karena bentuknya bulat kecil-kecil putih hampir menyerupai bakteri. Lempeng agar yang diamati adalah lempeng yang terdapat 40-60 koloni jamur (6). 2) Angka Kapang Khamir Disiapkan 3 buah tabung yang masing-masing diisi 9 ml akuabidest steril. Dipipet 1,0 ml dari hasil homogenisasi sampel ekstrak kering Sarang 3) Uji Mikroba Patogen a) Uji nilai duga terdekat/ most probable number (MPN) Coliform: 196

Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 (1) Pemeriksaan Pendahuluan (presumptive tes) : Disiapkan 7 tabung reaksi berisi ekstrak Sarang Semut (Fraksi air/nbutanol) sebanyak 1 gram dilarutkan dalam media BPW sebanyak 9 ml, homogenkan. Diinokulasikan 10 ml hasil homogenisasi dari ekstrak sarang semut dan ke tabung 5 tabung LBD (10 ml) dan 2 tabung LBS (1ml dan 0,1 ml) kemudian diinkubasi di suhu 37 0 C selama 24 jam. (2) Confirm Tes : Uji confirm tes dilakukan jika uji tahap presumptive tes positif namun apabila presumptive tes negatif, pengujian sampel selesai. Diamati hasil yang positif pada uji confirm tes kemudian diambil 1-2 ose sampel lalu dimasukkan dalam tabung yang berisi BGLB dan diinkubasi pada suhu 37º. Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam. (3) Pemeriksaan Penegasan : Hasil positif dari media BGLB pada uji confirm tes diinokulasikan ke media MC dengan cara teknik goresan. b) Uji Escherichia coli: Dipilih biakan positif pada uji MPN Coliform, 1 ml dari masing-masing biakan tersebut diinokulasikan ke dalam media MC (Mac Conkey) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam. Terbentuknya gas dalam tabung Durham menunjukkan fekal Coliform positif, kemudian biakan digoreskan pada media BGLB (Briliant Green Lactose Bile Broth), diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Dipilih koloni dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan di tengahnya dari BGLB, digoreskan pada NA (Nutrien Agar) miring dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Dilakukan pewarnaan Gram. Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif bentuk batang agak membulat. Dilanjutkan dengan penetapan IMVIC sebagai berikut. Uji Indol, uji Metil merah, uji Voges-Proskauer dan Uji Citrate (6). c) Uji Salmonella: Cuplikan dalam BHI (Brain Heart Infussion) dengan hasil homogenisasi ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) diinkubasi pada suhu 37 C selama 18-24 jam. Digoreskan hasil biakan BHI dan ekstrak ke dalam media MC kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 selama 24 jam. Bila tumbuh koloni di media MC diinokulasikan pada media uji biokimia (KIA, TSIA, SIM, UREA, CITRAT, MR, VP, PAD, Glukosa, Manitol, Maltosa, Laktosa dan Sakarosa). d) Uji Shigella spp: Cuplikan dalam BHI (Brain Heart Infussion) dengan hasil homogenisasi ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Hasil inokulasi dilakukan pengecatan gram dan diinokulasikan kembali pada media MC pada suhu 37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada media MC diambil terutama yang memiliki ciri koloni seperti kontrol positif yang berisi bakteri Shigella spp kemudian diinokulasikan pada media uji biokimia (KIA, TSIA, SIM, Urea, Citrat, MR, VP, PAD, Glukosa, Manitol, Maltosa, Laktosa, dan Sakarosa) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Hasil dilakukan uji biokimia kemudian dibaca sesuai ciri khas dari Shigella spp. e) Uji Pseudomonas aeruginosa: Cuplikan dalam BHI (Brain Heart Infussion) dengan hasil homogenisasi ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) diinkubasi pada suhu 37ºC 197

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker selama 24 jam. Hasil inokulasi dilakukan pengecatan gram dan diinokulasikan kembali pada media MC pada suhu 37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada media MC diambil terutama yang memiliki ciri koloni seperti kontrol positif yang berisi bakteri Pseudomonas aeruginosa kemudian diinokulasikan pada media uji biokimia (KIA, TSIA, SIM, Urea, Citrat, MR, VP, PAD, Glukosa, Manitol, Maltosa, Laktosa, dan Sakarosa) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Hasil dilakukan uji biokimia kemudian dibaca sesuai ciri khas dari Pseudomonas aeruginosa. f) Uji Staphylococcus aureus: Cuplikan dalam BHI (Brain Heart Infussion) dengan hasil homogenisasi ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Digoreskan hasil biakan BHI dan ekstrak ke dalam media BAP (Blood Agar Plate). Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam dengan posisi cawan dibalik. Setelah 24 jam dipilih cawan dengan jumlah 30-300 koloni berwarna hitam mengkilap dan dikelilingi daerah jernih. Posisi koloni diberi tanda dan diinkubasi dilanjutkan hingga 48 jam. Seluruh koloni yang tumbuh selama periode inkubasi dihitung kemudian dilakukan uji koagulase (6). d. Uji aflatoxin total Kultur Aspergillus flavus hasil isolat dari ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/nbutanol) diinonkulasikan pada permukaan media YES, pada 25ºC selama satu minggu dalam posisi miring untuk mendapatkan permukaan yang luas. Biakan diautoklav pada 121ºC selama 15 menit, dan dibiarkan sampai dingin. Sejumlah kecil media biakan diambil menggunakan pipet pasteur dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil atau vial. Terhadap biakan dan baku aflatoksin dilakukan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan: (a) Lempeng: silika gel; (b) Baku aflatoksin: campuran siap pakai yang terdiri dari 5,0 ug/ml aflatoksin B1, 1,5 ug/ml aflatoksin B2, 5.0 ug/ml aflatoksin G1, 1,5 ug/ml aflatoksin G2 dalam larutan campuran benzen; asetonitri (98-2); (c) Eluen: Kloroform-aseton-n-Heksan (85:15;20); (d) Jarak rambat: 10 cm, dan (e) Penampak noda: bercak berwarna biru/hijau kebiruan dengan UV 365 nm (6). e. Uji cemaran logam berat Uji cemaran logam berat ditetapkan secara spektroskopi serapan atom. Dalam uji logam berat dibuat pereaksi khusus yang digunakan dalam penetapan. 1) Preparasi Sampel Ditimbang 2 gram ekstrak dan ditambahkan 10 ml HNO3 pekat, setelah itu dipanaskan hingga kental atau kering. Ekstrak yang kental dan dingin ditambahkan aquabidest 10 ml dan asam perkolat 5 ml, kemudian dipanaskan hingga kental dan disaring ke labu ukur 50 ml. Tambahkan aquabidest hingga 50 ml. Sampel diukur dengan alat Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) dan direplikasi sebanyak 3 kali. 2) Pembuatan Larutan standar logam Cd dan Pb (7). a) Pembuatan larutan standar logam kadmium (Cd) 100 ppm Dipipet 5,0 ml larutan baku induk Cd 1000 ppm, masukkan ke dalam labu ukur 50 ml dan encerkan dengan aquabidest sampai volume 50,0 ml. b) Pembuatan larutan standar logam kadmium (Cd) 10 ppm Dipipet 25,0 ml larutan baku induk Cd 100 ppm, masukkan ke dalam labu ukur 250 ml dan encerkan dengan aquabidest sampai volume 250,0 ml. 198

Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 c) Pembuatan larutan standar logam timbal (Pb) 100 ppm Dipipet 10,0 ml larutan baku induk Pb 1000 ppm, masukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan encerkan dengan aquabidest sampai volume 100,0 ml. 3) Pembuatan Kurva Baku (7) dan Perhitungan Kadar a) Kadmium Buat seri larutan baku 0,0; 0,01; 0,03; 0,1; 0,2 dan 0,4 ppm dari larutan standar kadmium 10 ppm. Dipipet 0,0; 0,1; 0,3; 1,0; 2,0 dan 4,0 ml masingmasing dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan tambahkan larutan pengencer 0,1 N sampai volume 100,0 ml, kemudian ukur serapan seri larutan baku pada λ 228,8 nm mulai dari kadar terkecil. Buat kurva baku hubungan antara konsentrasi dan absorbansi. Hitung persamaan regresi linier yang merupakan hubungan antara konsentrasi (C) dengan Absorbansi (Abs). b) Timbal Buat seri larutan baku 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 dan 5,0 ppm dari larutan standar timbal 100 ppm. Dipipet 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 dan 5,0 ml masingmasing dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan tambahkan larutan pengencer 0,1 N sampai volume 100,0 ml, kemudian ukur serapan seri larutan baku pada λ 283,3 nm mulai dari kadar terkecil. Buat kurva baku hubungan antara konsentrasi dan absorbansi. Hitung persamaan regresi linier yang merupakan hubungan antara konsentrasi (C) vs Absorbansi (Abs). B. Analisis Data Data hasil standarisasi ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/n-butanol) dianalisis berdasarkan parameter standar umum non spesifik ekstrak tumbuhan obat berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI No: 55/ Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No. 12 Tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional di mana: 1. Hasil uji organoleptis, memaparkan bentuk, rasa, bau dan warna. 2. Kadar air bahan baku obat untuk sediaan dalam harus dalam kadar 10%, kecuali untuk efervesen 5%. 3. Hasil uji cemaran mikroba harus memenuhi: a. Angka Lempeng Total: 10 4 koloni/g b. Angka Kapang Khamir: 10 3 koloni/g c. Eschericia coli: negatif/g d. Salmonella spp: negatif/g e. Shigella spp: negatif/g f. Pseudomonas aeruginosa: negatif/g g. Staphylococcus aureus: negatif/g 4. Hasil uji Aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2) harus memenuhi kadar aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2) 20 µg/ kg dengan syarat aflatoksin B1 5 µg/kg. 5. Hasil uji cemaran logam berat harus memenuhi: a. Pb: 10 mg/kg atau mg/l atau ppm b. Cd: 0,3 mg/kg atau mg/l atau ppm HASIL DAN PEMBAHASAN Standarisasi merupakan rangkaian proses yang melibatkan berbagai metode analisis kimiawi berdasarkan data farmakologis, melibatkan analisis fisik dan mikrobiologis, berdasarkan kriteria umum keamanan (toksikologi) terhadap suatu ekstrak bahan alam. Standarisasi terhadap ekstrak bahan alam ada dua parameter yaitu parameter non spesifik dan parameter spesifik. Parameter non spesifik berfokus pada aspek kimia, mikrobiologis, dan fisis yang akan mempengaruhi keamanan konsumen dan stabilitas meliputi kadar air, cemaran logam berat, aflatoxin, dan lain-lain. Pada parameter spesifik berfokus pada senyawa 199

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker atau golongan senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas farmakologis. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan kualitas ekstrak sarang semut menjadi raw material yang memenuhi standar ekstrak tumbuhan obat berdasarkan Kepmenkes RI No. 55/MENKES/ SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No.12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional sehingga meningkatkan pemenuhan mutu ekstrak menjadi obat herbal terstandar antikanker (8). 1. Pembuatan Ekstrak Kering Sarang Semut Fraksi air/n-butanol Tahap pertama penelitian meliputi pembuatan ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) dengan metode ekstraksi ultrasonic. Serbuk sarang semut sebanyak 1 kilogram dibagi menjadi 4 bagian (masing-masing 250 gram), kemudian tiap bagian ditambahkan pelarut metanol dimasukkan ke dalam bekker gelas dengan rasio bubuk terhadap pelarut metanol 1:10, dimasukkan ke dalam ultrasonic cleaning bath selama 50 menit pada suhu kamar. Setelah proses ekstraksi selesai, hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring whatman, kemudian dijadikan satu dan diuapkan dengan menggunakan rotary vacum evaporator (Yamato RE 200) sehingga didapatkan produk ekstrak kental sarang semut dengan warna coklat dan rendemen sebesar 8,18%. Ekstrak metanol dilakukan partisi/ fraksinasi menggunakan butanol-air 1:1 dengan perbandingan 1:20. Hasil partisi ini didapatkan ekstrak kental butanol/ air dan air/butanol, selanjutnya ekstrak air/ butanol dikeringkan. Pemilihan ekstrak sarang semut fraksi air/n-butanol karena ekstrak ini yang berpotensi sebagai antikanker (4). Persen rendemen ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol sebesar 6,16%. 2. Standarisasi Ekstrak Kering Sarang Semut Fraksi air/n-butanol Tahap kedua dilakukan standarisasi ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol yang meliputi uji organoleptis, uji kadar air, uji cemaran mikroba, uji aflatoxin total, dan uji cemaran logam berat. Analisis data dilakukan berdasarkan parameter standar ekstrak tumbuhan obat berdasarkan Kepmenkes RI No: 55/Menkes/ SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. Hasil uji yang telah dilakukan sebagai berikut: a. Uji Organoleptis Uji organoleptik merupakan uji pengenalan secara fisik ekstrak dengan menggunakan panca indera dalam mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa (6). Hasil ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol dalam bentuk serbuk kering, warna coklat tua, bau aromatis, dan memiliki rasa asam sepat pahit. b. Uji kadar air Uji kadar air merupakan pengukuran kandungan air yang berada dalam bahan ekstrak. Uji kadar air ini bertujuan memberikan batasan minimal atau rentang tentang besarnya kandungan air dalam bahan ekstrak. Hasil uji kadar air ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol sebagai berikut (tabel I): Tabel 1. Nilai kadar air ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Replikasi Nilai Kadar Air (%) Persyaratan (%) 1. 9,258 2. 9, 259 10 3. 9,259 Rata-rata±SD 9,259±0,001 200

Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 Nilai kadar air ekstrak kering sarang semut fraksi air/n-butanol sebesar 9,259±0,001. Nilai kadar air ini memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Kepmenkes RI No: 55/ Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 dimana kadar air yang terkandung ekstrak sebagai bahan baku sediaan obat adalah 10%. Kadar air dipersyaratkan kurang dari 10% bertujuan untuk menghindari tumbuhnya bakteri dan jamur dalam waktu yang lebih cepat. c. Uji cemaran mikroba Tujuan analisis cemaran mikroba adalah memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak boleh mengandung mikroba patogen dan tidak mengandung mikroba non patogen melebihi batas yang ditetapkan karena berpengaruh dan berbahaya (toksik) bagi kesehatan (6). Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional yaitu tidak lebih dari 10 4 koloni/g. 2) Angka Kapang Khamir Hasil penetapan angka kapang dan khamir dengan metode dilusi hingga pengenceran 10-4 dapat dilihat pada tabel III. Koloni ragi dibedakan karena bentuknya bulat kecilkecil putih hampir menyerupai bakteri (6). Hasil pengujian angka kapang khamir menunjukkan bahwa ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/n-butanol) yang dihasilkan memenuhi persyaratan angka kapang khamir yang ditetapkan oleh Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Tabel 2. Angka lempeng total ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Replikasi Angka Lempeng Total Persyaratan 1. 5x103 104 2. 5x103 104 Tabel 3. Angka kapang khamir ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Replikasi Angka Kapang Khamir Persyaratan 1. 0,5 x 10 1 10 3 2. 0,5 x 10 1 10 3 1) Angka Lempeng Total Hasil pengujian angka lempeng total dari ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/ n-butanol) dengan metode dilusi sebagai berikut: Hasil pengujian angka lempeng total menunjukkan bahwa ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/n-butanol) yang dihasilkan memenuhi persyaratan angka lempeng total yang ditetapkan oleh Obat Tradisional yaitu tidak lebih dari 10 3 koloni/g. 3) Uji Mikroba Patogen Uji mikroba patogen terhadap ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/nbutanol) yang dihasilkan meliputi uji MPN Coliform yang dilanjutkan dengan uji mikroba Escherichia coli, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas 201

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker aeruginosa, dan Shiggella spp. Hasil uji mikroba patogen dapat dilihat pada tabel 4. berikut ini: Hasil uji Aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2) memenuhi kadar aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2) 20 µg/kg dengan syarat Tabel 4. Uji mikroba patogen ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Jenis Uji Mikroba Patogen Hasil Persyaratan MPN 0 koloni/g 0 koloni/g Escherichia coli Negatif/g Negatif/g Salmonella sp Negatif/g Negatif/g Staphylococcus aureus Negatif/g Negatif/g Pseudomonas aeruginosa Negatif/g Negatif/g Shiggella spp Negatif/g Negatif/g Ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/n-butanol) menunjukkan hasil telah memenuhi persyaratan uji mikroba patogen yang ditetapkan oleh Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional yaitu negatif terhadap keberadaan mikroba patogen (8). d. Uji Aflatoxin Uji aflatoxin dilakukan untuk menjamin ekstrak yang digunakan sebagai bahan baku sediaan obat tidak mengandung cemaran aflatoxin yang dapat menyebabkan toksik atau menimbulkan keracunan. Cemaran aflatoxin juga dapat menyebabkan mutagenik (mutasi gen), teratogenik (menghambat pertumbuhan janin) dan karsinogenik (menimbulkan kanker pada jaringan). Adanya cemaran aflatoxin pada ekstrak dapat membahayakan kesehatan (9). Pada ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/n-butanol) yang diuji tidak terdeteksi adanya aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2). aflatoksin B1 5 µg/kg menurut Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 (8). e. Uji cemaran logam berat Pb dan Cd Uji cemaran logam berat bertujuan untuk menetapkan kandungan logam berat dalam suatu ekstrak, sehingga dapat memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung logam berat tertentu (Pb dan Cd) dalam kadar melebihi batas yang ditetapkan. Hasil uji cemaran logam berat Pb dan Cd dari ekstrak kering Sarang Semut (Fraksi air/ n-butanol) dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom dapat dilihat pada tabel 5 dan tabel 6. Pada tabel 5. menunjukkan kandungan logam berat Cd dari ekstrak kering sarang semut (Fraksi air/n-butanol) sebesar 0,0052±0,0005 ppm telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Kepmenkes RI No: 55/Menkes/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional yaitu 0,3 ppm (8). Hasil pada tabel 6. menunjukkan kandungan logam berat Pb dari ekstrak kering sarang semut Tabel 5. Uji cemaran logam berat Cd ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Replikasi Absorbansi Persamaan Regresi Linier Kadar (ppm) Persyaratan 1 0,0022 y = 0,27x + 0,001 0,0048 2 0,0025 r = 0,9999 0,0059 0,3 ppm 3 0,0022 0,0048 Rata-rata±Sd 0,0052±0,0005 202

Novena Yety Lindawati 1 dan Lusia Murtisiwi 2 Tabel 6. Uji cemaran logam berat Pb ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) Replikasi Absorbansi Persamaan Regresi Linier Kadar (ppm) Persyaratan 1 0,0095 y = 0,0094x + 0,0005 0,9535 2 0,0094 r = 0,9999 0,9429 10 ppm 3 0,0093 0,9323 Rata-rata±Sd 0,9429±0,0087 (Fraksi air/n-butanol) sebesar 0,9429±0,0087 ppm telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Kepmenkes RI No: 55/Menkes/ SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI Nomor 12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional yaitu 10 ppm (8). KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Ekstrak kering sarang semut (fraksi air/ n-butanol) yang diperoleh melalui metode ekstraksi ultrasonic dan distandarisasi telah memenuhi raw material sediaan obat herbal terstandar berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 55/MENKES/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No.12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional dengan uji organoleptis ekstrak berbentuk serbuk kering, warna coklat tua, bau aromatis, dan memiliki rasa asam sepat pahit. Nilai kadar air sebesar 9,259±0,001 memenuhi persyaratan kadar air yang ditetapkan yaitu 10%. Hasil pengujian angka lempeng total sebesar 5x10 3 koloni/g memenuhi persyaratan angka lempeng total yang ditetapkan yaitu tidak lebih dari 10 4 koloni/g. Hasil pengujian angka kapang khamir sebesar 0,5x10 1 koloni/g memenuhi persyaratan angka kapang khamir yang ditetapkan yaitu tidak lebih dari 10 3 koloni/g. Hasil uji mikroba patogen negatif dengan Nilai MPN Coliform 0 koloni/g dan negatif terhadap keberadaan bakteri Escherichia coli, Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Shiggella spp.da lam ekstrak tidak terdeteksi adanya aflatoksin total (aflatoksin B1, B2, G1 dan G2). Hasil uji Aflatoksin total memenuhi kadar aflatoksin total 20 µg/kg dengan syarat aflatoksin B1 5 µg/kg. Hasil uji kandungan logam berat Cd sebesar 0,0052±0,0005 ppm telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan yaitu 0,3 ppm dan hasil uji kandungan logam berat Pb sebesar 0,9429±0,0087 ppm telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan yaitu 10 ppm. Saran Perlu penelitian lebih lanjut untuk pembuatan formula Obat Herbal Terstandar dalam bentuk sediaan obat seperti Tablet, Kapsul, dan sediaan lain dari Ekstrak kering sarang semut (fraksi air/n-butanol) yang telah distandarisasi dan memenuhi raw material sediaan obat herbal terstandar berdasarkan Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 55/MENKES/SK/I/2000 dan Peraturan Kepala BPOM RI No.12 tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. UCAPAN TERIMA KASIH Direktorat Riset dan Pengabdian kepada Masyarakat, Direktorat Jenderal Penguatan Riset dan Pengembangan, Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi yang telah memberikan kesempatan dan membiayai pelaksanaan kegiatan penelitian dosen pemula ini. DAFTAR PUSTAKA 1. Menkes RI. Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 88 Tahun 2013 tentang Bahan Baku Obat Tradisional. 2013. Hal. 21. 203

Standarisasi Ekstrak Sarang Semut untuk Pemenuhan Mutu Ekstrak Menuju Obat Herbal Terstandar Antikanker 2. Soeksmanto, A., Subroto, M. A., Wijaya, H., dan Simanjuntak, P. Anticancer Activity Test for Extracts of Sarang Semut Plant (Myrmecodia pendens) to HeLa and MCM-B2 Cells. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2010. 13(3), 148 151. 3. Achmad, H., Supriatno, S., Marhamah, M., dan Rasmidar, R.,. Aktivitas antikanker dan anti proliferasi fraksi etanol sarang semut (Myrmecodya pendans) pada sel kanker lidah manusia SP-C1 (Anti-cancer and anti-proliferation activity of ethanol fraction of ant nest plants (Myrmecodya pendans) on human tongue cancer cell SP-C1). J. Dentomaxillofacial Sci. 2014. 13(1). 1 6. 4. Suharyanto dan Hartono. Metode Ekstraksi Sarang semut dengan Teknik Ultasonik untuk Menghasilkan Obat Alternatif Penyakit Kanker Laporan Penelitian PEKERTI. Surakarta. 2014. Hal. 10. 5. Subroto, M. A., dan Saputro, H. Gempur Penyakit dengan Sarang Semut. Jakarta: Penebar Swadaya. 2006. 6. Depkes RI. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Depkes RI. 2000. 7. Badan Standarisasi Nasional. SNI 06-6989. 16-2009. Air dan Limbah Bagian 16: Cara Uji Kadmium (Cd) dengan Spektrofotometri Serapan Atom (SSA)-nyala. 2009. 8. BPOM RI, K. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor 12 Tahun 2014 tentang Persyaratan Mutu Obat Tradisional. 2014. Hal. 1 25. 9. Khoirani N. Karakterisasi Simplisia dan Standarisasi Ektrak Etanol Herba Kemangi (Ocimum americanum L.), Skripsi, Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayahtullah. Jakarta. 2013. Hal. 45. 204