BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian true experimental post test only control group design. 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama 1 bulan. 4.3 Populasi dan Sampel Penelitian 4.3.1 Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum biakan murni yang diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya. 4.3.2 Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum yang telah dibiakkan dan diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling 4.3.3 Besar Sampel Penentuan pengulangan dihitung dengan rumus Federer (t 1) (n-1) 15 Keterangan : t = jumlah perlakuan n = banyak pengulangan tiap perlakuan 25
26 Penelitian ini menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit pisang kepok dan 2 kelompok kontrol sehingga ada 10 kelompok, maka : ( t-1) (n-1) 15 ( 10-1 ) ( n-1 ) 15 9 ( n-1) 15 9n 9 15 9n 24 n 2,67 3 Dari hasil perhitungan di atas, maka diperlukan 3 kali pengulangan untuk tiap sampel. Jadi diperlukan 30 perlakuan untuk penelitian ini. 4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel Bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kulit pisang kepok dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan 2 kontrol yaitu kontrol positif dan kontrol negatif. 4.4.2 Variabel Tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah jumlah koloni jamur T. rubrum yang dapat dilihat dari KHM dan KBM. 4.5 Definisi Operasional 1. Jumlah konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok yang digunakan dalam penelitian ini adalah 8 konsentrasi dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%,
27 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan 2 kontrol yaitu kontrol bahan sebagai kontrol negatif dan kontrol kuman sebagai kontrol positif. Skala pengukuran yang digunakan adalah ordinal. 2. Jamur T.rubrum yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari biakan murni yang diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya. Pertumbuhannya di liat dengan menghitung jumlah koloni pada SDA menggunakan perhitungan Colony Counter. Skala pengukuran yang digunakan adalah rasio. 3. KHM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang mampu menghambat pertumbuhan koloni T.rubrum menggunakan metode dilusi tabung, yang ditandai dengan melihat ada atau tidaknya kekeruhan pada media Sabouraud Dextrose Broth (SDB).. Skala pengukuran yang digunakan adalah nominal. 4. KBM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang dapat membunuh T.rubrum, yang ditandai dengan penurunan pertumbuhan koloni jamur sampai 99,9% dari inokulum asal pada media SDA. Skala pengukuran yang digunakan adalah rasio. 4.6 Instrumen Penelitian 4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kulit Pisang Kepok 1. Alat a. Blender b. Kertas saring c. Tabung ekstraktor d. Labu destilasi
28 e. Pendingin spiral f. Water pump g. Evaporator h. Vakum pump i. Neraca analitik j. Corong gelas k. Cawan porselem l. Beaker glass 2. Bahan a. Kulit pisang kepok kering b. Etanol 70% c. Aquades 4.6.2 Alat dan Bahan Uji Antimikroba 1. Alat a. Tabung reaksi steril b. Ose lengkung c. Mikropipet 1 ml d. Inkubator e. Lampu spirtus f. Label g. Vortex h. Colony counter 2. Bahan a. Perbenihan cair jamur T.rumbrum
29 b. Ekstrak kulit pisang kapok c. Aquades d. SDB e. SDA 4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Sterilisasi Alat Sterilisasi alat dilakukan dengan: a. Mencuci semua alat dengan sabun hingga bersih dan membiarkannya hingga kering. b. Alat-alat yang bisa disterilisasi dalam autoklaf dibungkus dengan kertas dan dimasukkan dalam autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 atm, selama 15 menit, sedangkan alat-alat yang tidak bisa disterilisasi dengan autoklaf disterilkan dengan alkohol 70% selama 20 menit. 4.7.2 Pembuatan Medium SDA a. Menimbang Sabouraud Dextrose Agar Base sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan aquades sesuai kebutuhan. b. SDA direbus lalu disterilisasi dalamautoklaf pada tekanan 15 atm pada suhu 121 C selama 15 menit. c. SDA yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing cawan petri sebanyak 20 ml. 4.7.3 Pembuatan Medium SDB a. Timbang bahan sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan aquades sesuai kebutuhan dan diaduk secara merata. b. SDB direbus sampai tercampur rata.
30 c. SDB yang sudah direbus disterilisasidalam autoklaf pada tekanan 15 atm pada suhu 121 C selama 15 menit. d. SDB yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing tabung. 4.7.4 Pembuatan ekstrak kulit pisang kepok a) Proses pengolahan kulit pisang kepok 1. Mencuci bersih kulit pisang kepok dengan air mengalir 2. Kulit pisang kepok yang sudah bersih kemudian ditiriskan, dan dipotong kecil-kecil dengan ketebalan ± <5mm. 3. Kulit pisang yang sudah dipotong dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung selama ± 2 hari, dilanjutkan dengan oven selama 2 hari pada suhu 40 0 C sampai sampel tanaman pisang kepok benar-benar kering. 4. Setelah kering, sampel dihaluskan dengan blender 5. Bubuk kulit pisang kepok ditimbang dengan menggunakan timbangan sebanyak 100 gram kemudian dimasukkan dalam gelas Erlenmeyer ukuran 1 liter. 6. Kemudian direndam di dalam larutan etanol 70% sampai volume 900 ml dan dikocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit). 7. Bahan direndam dan ditutup selama 24 jam sampai mengendap. b) Proses Evaporasi 1. Mengambil lapisan atas campuran etanol dengan zat aktif yang sudah terambil kemudian dimasukkan dalam labu evaporasi 1 liter 2. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan bahan dengan kertas saring
31 dan corong gelas sampai tidak ada cairan yang menetes dari bahan. 3. Memindahkan cairan hasil penyaringan pada labu evaporasi 1 liter. 4. Memasang labu evaporasi pada evaporator 5. Evaporator dipasang pada tiang permanen agar dapat tergantungdengan kemiringan 30-40 o terhadap meja percobaan, dengan susunan dari atas: alat pemanas air, labu penampung, hasil evaporasi, rotary evaporator, dan tabung pendingin spiral. 6. Hasil ekstrasi di pindahkan dalam labu pemisahekstraksi. 7. Labu pemisah ekstraksi dihubungkan dengan bagian bawah evaporator. 8. Tabung pendingin spiral di hubungakan dengan bagian atas evaporator. 9. Labu penampung hasil bevaporasi dihubungkan dengan bagian atas evaporator. 10. Tabung pendingin spiral dan pompa vakum dihubungkan dengan selang plastik. 11. Tabung pendingin dan pompa sirkulasi air dingin dihubungkan dengan selang plastik. 12. Pompa sirkulasi air dingin ditempatkan dalam bak yang berisi aquabides. 13. Letakan satu set alat evaporasi sehingga labu pemisah ekstraksi terendam aquabides pada pompa sirkulasi air dingin. 14. Rotary evaporator, pompa sirkulasi air dingin, dan pompa vakum dijalankan.
32 15. Alat pemanas air dinyalakan dan diatur suhu sekitar 70-80 o C (sesuaititik didih etanol) sehingga hasil ekstraksi dalam labu pemisah ekstraksi mendidih dan pelarut etanol menguap. 16. Hasil penguapan etanol dikondensasi menuju labu penampung etanol sehingga tidak tercampur dengan hasil evaporasi, sedangkan uap air tersedot oleh pompa vakum. 17. Proses evaporasi dilakukan hingga volume kecil hasil ekstraksi berkurang dan menjadi kental. 18. Setelah kental proses evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi diambil. 19. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian dioven selama ± 2 jam pada suhu 80 o C untuk menguapkan pelarut yang tersisa, sehingga didapatkan hasil ektrak kulit pisang kepok100%. Ekstrak tersebut kemudian ditimbang dengan neraca analitik. 4.7.5 Identifikasi T.rubrum Untuk memastikan bahwa koloni yang tumbuh adalah T.rubrum, dilakukan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. 1. Pemeriksaan secara makroskopis Pemeriksaan ini dilakukan dengan mengamati koloni T.rubrum yang berupa koloni halus berwarna putih kekuningan dan berbau ragi. 2. Pemeriksaan secara mikroskopis Pada pemeriksaan ini dilakukan pewarnaan KOH, yaitu dengan cara:
33 Teteskan 1-2 tetes larutan KOH 10% pada kaca objek.. Letakkan bahan yang diperiksa pada tetesan tersebut dengan menggunakan pinset yang sebelumnya dibasahi dulu dengan larutan KOH, kemudian tutup dengan kaca penutup. Biarkan 15 menit atau dihangatkan diatas nyala api selama beberapa detik untuk mempercepat proses lisis. Periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran dari 10x - 40x. Carilah bentukan khas T.rubrum. 4.7.6 Pembuatan Perbenihan Cair Jamur Ambil 1 ose koloni jamur dari media subculture, kemudian suspensikan kedalam SDB didalam tabung. Tabung kemudian divortex dan disesuaikan dengan standart McFarland 1x10 8 CFU/ml. 4.7.7 Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Pisang Kepok Terhadap T.rubrum Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi tabung dan difusi cakram. Pada penelitian ini diperlukan kadar beberapa macam konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok untuk dicampurkan atau diinokulasi dengan perbenihan cair jamur T.rubrum. Dengan cara sebagai berikut: Hari ke-1 : a. Sediakan 10 tabung reaksi steril; tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4, tabung 5, tabung 6, tabung 7 dan tabung 8, tabung 9, tabung 10. Masingmasing di beri perlakuan konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok 8 konsentrasi dan 2 tabung kontrol.
34 b. Masukkan 1 ml SDB pada tabung 2,3,4,5,6,7,8,9 dan 2 ml ekstrak kulit pisang kepok pada tabung 1 serta 2 ml Trichophyton sp. pada tabung 10. sukkan 1ml ekstrak kulit nanas pada tabung 2 dan 3. Konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok Tabung 2 1 ml (100%) Tabung 3 2 ml (50%) c. Campurlah hingga rata larutan SDB dan ekstrak kulit pisang kepok pada tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 4. Konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok Tabung 3 1 ml (50%) Tabung 4 2 ml (25%) d. Ulangi hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 e. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml. f. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antifungi dari masingmasing tabung adalah
35 g. Selanjutnya tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair jamur 1 ml h. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga konsentrasi akhir antifungi berubah seperti berikut. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 36-48 jam Hari ke-3: Tabung dikeluarkan dari inkubator, akan di dapatkan KHM dengan cara melihat kejernihan tabung. Kemudian dari masing-masing tabung diambil 1 ose dan diinokulasikan pada media SDA. Lalu diinkubasikan lagi 36-48 jam pada suhu 37 C Hari ke-5: Media SDA dikeluarkan dari inkubator kemudian dilakukan pengamatan kuantitatif pada masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah koloni jamur dengan colony counter sehingga didapatkan data KBM.
36 4.8 Alur Penelitian Pembuatan ekstrak kulit pisang kepok Identifikasi T.rubrum secara makroskopis dan mikroskopis Pembuatan media cair T.rubrum Uji antifungi dengan Tube Dilution Test Inkubasi selama 36-48 jam dengan suhu 37ºC Amati tingkat kekeruhan untuk menentukan KHM Penggoresan pada SDA Inkubasi selama 36-48 jam dengan suhu 37ºC Menghitung jumlah koloni untuk menentukan KBM Analisis Data Gambar 4.1 Alur penelitian
37 4.9. Analisis Data Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni T.rubrum yang tumbuh pada SDA berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok (Musa paradisiaca L.). Analisis yang digunakan adalah uji one way ANOVA. Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan yang bermakna antara kelompok perlakuan. Syarat-syarat uji parametrik yang harus dipenuhi dalam menggunakan uji one way ANOVA adalah (Dahlan,2015) : 1. Terdapat lebih dari dua kelompok yang tidak berpasangan dan skala pengukuran variabel numerik 2. Sebaran data harus normal (p>0,05), pada penelitian ini dilakukan uji normalitas menggunakan uji Saphiro Wilk untuk mengetahui apakah kelompok data penelitian berasal dari populasi berdistribusi normal atau tidak normal. Jika distribusi data tidak normal, maka diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya distribusi data menjadi normal. 3. Varian data harus sama atau homogen (p>0,05), yang dapat diketahui dari uji homogenitas Levene. Jika varian data tidak sama atau homogen, maka diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya ragam data menjadi sama atau homogen. Apabila data berdistribusi normal dan varian sama maka dilanjutkan dengan uji Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat perbedaan yang bermakna. Apabila data berdistribusi normal namun variabel tidak sama (tidak homogen) maka dapat dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tamhane
38 Jika data hasil transformasi tidak terdistribusi normal atau ragam data tetap tidak sama, maka dipilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai alternatifnya dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney untuk menentukan pada konsentrasi mana yang memiliki hasil kebermaknaan, selanjutnya dilakukan uji regresi linear untuk mengetahui seberapa besar dan memprediksi pengaruh pemberian ekstrak kulit pisang kepok (Musa paradisiaca L.) dengan jumlah koloni T.rubrum yang tumbuh pada Sabouraud agar (Dahlan,2015)