15 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari sampai Mei 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Biologi- Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Terpadu Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian Pengembangan Pasca Panen Pertanian, Cimanggu, Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi keong macan (Babylonia spirata), kerang tahu dan kerang salju, larutan standar internal asam lemak, air, akuades, methanol, n-heksan, NaCl, BF 3, K 2 SO 4, H 2 SO 4, NaOH, H 3 BO 3, dan HCl. Alat yang digunakan antara lain kompor listrik, tanur pengabuan, pipet, pisau, plastik, timbangan analitik dan timbangan digital, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas erlenmeyer, tabung kjeldahl, tabung sokhlet, pemanas, destilator, buret, mortar, label, kertas saring dan gas kromatografi (chromatography gas) Hitachi GC 263-50. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian tahap 1 dan tahap 2. Penelitian tahap 1 diawali dengan melakukan survei/sampling bahan baku ke lapangan untuk memperoleh informasi tentang asal sampel dan cara penangkapan. Kemudian dilanjutkan dengan penentuan ukuran (panjang dan berat) dan rendemen keong macan, kerang tahu dan kerang salju. Penelitian tahap 2 dilakukan beberapa analisis yaitu, analisis proksimat, dan asam lemak. Diagram alir metode penelitian dapat dilihat pada Gambar 6.
16 Sampel kerang tahu, kerang salju dan keong macan Penentuan ukuran dan berat ratarata dari tiga jenis sampel Preparasi kerang tahu, kerang salju dan keong Rendemen jeroan Rendemen daging Rendemen cangkang Analisis kimia: 1. Analisis proksimat 2. Analisis asam lemak Karakteristik Asam Lemak Gambar 6 Diagram alir metode penelitian 3.3.1 Persiapan contoh Pertama sampel keong macan, kerang tahu dan kerang salju dalam keadaan segar yang disimpan dalam wadah styrofoam berisi es untuk mempertahankan kesegaran. Sampel dicuci menggunakan air bersih, hal ini dilakukan untuk membersihkan kotoran yang melekat pada sampel. Setelah itu dilakukan pengumpulan data berupa ukuran (panjang dan bobot keong macan) dan pengukuran rendemen (daging, cangkang dan jeroan) keong macan, kerang tahu dan kerang salju.
17 3.3.2 Rendemen Rendemen dihitung sebagai persentasi bobot bagian tubuh keong macan dari bobot awal. Adapun perumusan matematik adalah sebagai berikut: BC ( gram) Rendemen (%) = 100% BT ( gram) Keterangan : BC : Bobot contoh (gram) BT : Bobot total (gram) 3.3.3 Analisis kimia Analisis kimia pada daging keong macan terdiri dari analisis proksimat dan penentuan asam lemak. 3.3.3.1 Analisis proksimat Analisis proksimat yang dilakukan terhadap keong macan, kerang tahu dan kerang salju meliputi: kadar air, abu, protein dan lemak. 1) Analisis kadar air (AOAC 1995) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 0 C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin dan ditimbang hingga beratnya konstan. Kemudian cawan dan sampel seberat 1-2 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dihomogenkan. Cawan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 0 C selama 6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan hingga dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air: % Kadar Air = B C x 100% B A Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat cawan dengan sampel (gram) C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
18 2) Analisis kadar abu (AOAC 1995) Cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 0 C, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram yang telah dihomomogenkan dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan abu porselen dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 105 0 C sampai tidak berasap. Selanjutnya cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600 0 C selama 2-3 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan abu porselen didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya. Perhitungan kadar abu: Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong (gram) B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram) C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 3) Analisis kadar protein (AOAC 1995) Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi dan titrasi. (1). Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung Kjeltec. Satu butir Kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 0 C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. (2). Tahap destilasi % Kadar Abu: C A x 100% B A Isi labu dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan aquades (50 ml). Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 3 tetes indikator (cairan methyl red dan brom
19 cresol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperolah 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 dan indikator dalam erlenmeyer. Perhitungan jumlah nitrogen dalam bahan: (ml HCl sampel-ml HCl blanko) x 0,1 N HCl x 14 %Nitrogen = mg sampel x 100% % Kadar protein = % Nitrogen x faktor konversi (6,25) 4) Analisis kadar lemak (AOAC 1995) Sampel seberat 2 gram (W 1 ) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W 2 ) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 0 C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 0 C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W 3 ). Perhitungan kadar lemak: % Kadar lemak = W 3 W 2 W 1 x 100% Keterangan: W 1 = Berat sampel (gram) W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W 3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3.3.2 3.3.4 Analisis asam lemak Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunanya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Gas chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan. Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan
20 melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu dilakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat (Fardiaz 1989). Standar asam lemak yang digunakan, yaitu kaprat (C10:0), laurat (C12:0), miristat (C14:0), palmitat (C16:0), stearat (C18:0), linoleat (C18:2), linolenat (C18:3), EPA (C20:3), dan DHA (C22:6). Kadar asam lemak dapat dihitung dengan: Analisis asam lemak dilakukan melalui beberapa tahapan antara lain ekstraksi, metilasi, injeksi dan pembacaan sampel dengan kromatogram. (a) Tahap ekstraksi Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode Sohxlet. Pada tahap ini akan diperoleh lemak dalam bentuk minyak. Sampel tersebut kemudian ditimbang sebanyak 0,02-0,03 g lemak untuk dilanjutkan pada tahap metilasi. (b) Pembentukan metil ester (metilasi) Tahap metilasi dilakukan untuk membentuk senyawa turunan dari senyawa asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak dirubah menjadi ester-ester metil atau alkil yang lainya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas (Fardiaz 1989). % Asam lemak = konsentrasi sampel 100 - (konsentrasi pelarut) Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak diatas penangas air dengan menembahkan 1 ml NaOH dalam metanol 0,5 N, BF 3 dan isooktan. Kemudian Sebanyak ± 0,03 g minyak dari sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahakan 1 ml NaOH dalam metanol 0,5 N lalu dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit dengan suhu 80 o C kemudian larutan didinginkan. Selanjutnya Sebanyak ± 2 ml BF 3 ditambahkan ke dalam tabung lalu dipanaskan kembali pada waterbat dengan suhu 80 0 C selama 20 menit lalu didinginkan. Setelah itu, ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan isooktan lalu dikocok sempurna. Sebanyak 2 µl sampel diinjeksikan ke dalam Gas Chromatography.
21 (c) Identifikasi asam lemak Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada alat kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut: jenis alat kromatografi gas yang digunakan adalah Shimadzu GC-2010, gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 1 kg/cm 2 dan sebagai gas pembakar adalah hidrogen dan oksigen dengan aliran 0,5 kg/cm 2, kolom yang digunakan adalah kolom packing yang panjangnya 4 m dengan diameter dalam 0,3 cm. Suhu terprogram yang digunakan adalah suhu 200 o C, kemudian suhu dinaikkan 5 o C permenit hingga suhu akhir 230 o C. 3.3.3 Kromatografi gas Analisis asam lemak dilakukan menggunakan metode kromatografi gas. Metode ini memerlukan preparasi sampel sebelum diinjeksikan ke alat kromatografi. Kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atau distribusi diferensial komponen sampel diantara dua sampel. Kromatografi melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam biasanya berupa cairan yang terikat pada permukaan, sedangkan fase gerak berupa eluen, pelarut atau gas pembawa inert. Sampel daging ubur-ubur ditimbang 30 mg (minyak) masukkan dalam tabung 10 ml yang ditutup rapat kemudian tambahkan 1 ml NaOH 0,5 N selanjutnya direfluks selama 20 menit mengguakan water bath pada suhu 80 o C. Labu lalu diangkat dan dibiarkan sampai dingin kemudian tambahkan 2 ml BF 3, panaskan kembali selama 20 menit, dinginkan lalu tambahkan 2 ml larutan NaCl jenuh dan 1 ml isooktan sambil dikocok. Kemudian, pisahkan lapisan isooktan yang di bagian atas dan dimasukkan ke dalam evendof yang telah bersisi Na 2 SO 4 anhidrat kemudian diinjeksikan kedalam kromatografi gas. Berikut gambar mekanisme kerja kromatografi gas. (a) Gambar 6 (a) alat kromatografi gas; (b) tabung gas pembawa (b)
22 Tabung gas pembawa Pengendali aliran Injektor Kolom seperator Detektor Tabung gas pembawa Gambar 7 Diagram Alir Kromatografi Gas untuk Asam Lemak Kondisi alat GC pada saat analisis: a) Jenis kolom : Cyanopropil methyl sil (capilary column) b) Panjang kolom : 60 mm c) Diameter dalam : 0,25 mm d) Tebal lapisan film : 0,25 µm e) Laju alir N 2 : 20 ml/menit f) Laju alir H 2 : 30 ml/menit g) Laju alir udara : 200-250 ml/menit h) Suhu injektor : 200 o C i) Suhu detektor : 230 o C j) Suhu terprogram : 190 230 o C