ISBN

ISBN 978-62-95471--8 Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 29 i

ISBN 978-62-95471--8 HUBUNGAN KEKERABATAN CUCUMBER GREEN MOTTLE MOSAIC VIRUS (CGMMV) BERDASARKAN KESAMAAN SEKUEN COAT PROTEIN GENE MENGGUNAKAN BIOINFORMATIKA Budi Setiadi Daryono* dan Utari Saraswati* * Laboratorium Genetika, Fakultas Biologi UGM Jl. Teknika Selatan-Sekip Utara, Yogyakarta 55281 (E-mail: bs_daryono@yahoo.com) ABSTRAK Bioinformatika merupakan salah satu cabang ilmu pengetahuan yang menerapkan teknologi informasi untuk mengolah dan menganalisis data-data biologi berupa sekuen nukleotida, protein maupun database lainnya. Pada penelitian ini, bioinformatika digunakan dalam menganalisis sekuen nukleotida coat protein (cp) gene pada berbagai isolat Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV). CGMMV adalah salah satu virus anggota genus Tobamovirus yang dapat menginfeksi tanaman anggota famili Cucurbitaceae. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan kekerabatan cp gene antara berbagai isolat CGMMV tersebut menggunakan bioinformatika. Penelitian ini menggunakan metode browsing pada GenBank dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan analisis data menggunakan software BLAST dalam situs DNA Data Bank of Japan (DDBJ), serta Align dan ClustalW dalam situs European Bioinformatics Institute (EBI) secara online. Data biologi yang dianalisis adalah sekuen nukleotida cp gene dari 13 isolat CGMMV dan satu isolat Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV) sebagai outgroup. Hasil analisis data menunjukkan bahwa dua pasang isolat CGMMV, yaitu CGMMV-Zucchini dan CGMMV-China serta CGMMV-LHP dan CGMMV-NS, memiliki indeks similaritas tertinggi (1%). Sedangkan indeks similaritas terendah (9.9%) dimiliki oleh pasangan isolat CGMMV- Rajasthan dan CGMMV-GR5. Berdasarkan indeks similaritas tersebut, diperoleh hubungan kekerabatan antara 13 isolat CGMMV yang dapat dikelompokkan menjadi tiga grup, yaitu grup Asia Timur, Asia Selatan dan Eropa. Kata kunci: bioinformatika, CGMMV, coat protein, hubungan kekerabatan PENGANTAR Bioinformatika adalah suatu cabang ilmu pengetahuan baru yang memanfaatkan kemajuan teknologi informasi dan metode statistik untuk mengolah dan menganalisis sejumlah besar data biologi seperti sekuen DNA, RNA dan protein, struktur protein, profil ekspresi gen dan interaksi protein (Yi-Phing, 25). Perkembangan bioinformatika tidak lepas dari dukungan tiga organisasi besar dunia, yaitu National Center for Biotechnology Information (NCBI), DNA Data Bank of Japan (DDBJ) dan European Molecular Biology Laboratory Nucleotide Sequence Database (EMBL) dari European Bioinformatics Institute (EBI) (Mathura and Kangueane, 29). Kemajuan bioinformatika juga telah berperan dalam mempercepat perkembangan cabang ilmu lain, salah satunya adalah virologi. Salah satunya adalah semakin mudahnya mengidentifikasi dan mengklasifikasikan virus hanya dengan melakukan sequencing terhadap gen-nya (Utama, 23). Pada penelitian ini, kesamaan sekuen coat protein (CP) gene Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) akan dianalisis. CGMMV merupakan salah satu virus anggota genus Tobamovirus yang mampu menginfeksi tumbuhan anggota famili Cucurbitaceae. Penyebaran CGMMV dapat terjadi secara mekanik melalui kontak antar daun-daunan, penanganan selama penanaman, kontaminasi tanah serta akar yang terinfeksi (Chang et al., 25), ataupun melalui biji (Varveri et al., 22). Virus ini mengandung suatu gen, yaitu coat protein (CP) yang bersifat conserved, sehingga banyak digunakan untuk mengetahui variasi genetik dan hubungan kekerabatan 16 Prosiding Keaneka Ragaman Hayati

ISBN 978-62-95471--8 virus. Dengan bioinformatika, data-data biologi berupa sekuen nukleotida maupun protein dari CP gene berbagai isolat CGMMV dapat dianalisis. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan kekerabatan CGMMV berdasarkan kesamaan sekuens coat protein gene menggunakan bioinformatika. CARA KERJA Penelitian ini menggunakan metode browsing pada GenBank dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) dan analisis data dilakukan dengan menggunakan beberapa software yang diakses secara online, yaitu software BLAST untuk homology search dalam situs DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Align untuk mengetahui indeks similaritas dan ClustalW untuk analisis hubungan similaritas dan filogenetik dalam situs European Bioinformatics Institute (EBI), serta TreeView untuk membaca cladogram. Data biologi yang dianalisis adalah sekuen nukleotida dan asam amino CP gene dari 13 isolat CGMMV dan satu isolat Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV) sebagai outgroup. Adapun tahap-tahap analisis data biologi tersebut adalah sebagai berikut: Pencarian nukleotida CP gene CGMMV isolat Zucchini pada GenBank. Nukleotida CP gene CGMMV isolat Zucchini yang digunakan sebagai acuan, dapat dicari pada GenBank dalam situs NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sekuen nukleotida dan asam amino yang diperoleh kemudian di-copy ke dalam bentuk word. Pencarian keberadaan dan kemiripan (homology search) CP gene pada virus tertentu (isolat CGMMV yang lain). Homology search dapat diperoleh dari software BLAST dalam situs DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp). Sekuen nukleotida dari GenBank yang sudah di-copy ke word, dianalisis dengan BLAST sehingga diperoleh sejumlah organisme lain yang memiliki kemiripan dengan CP gene CGMMV isolat Zucchini. Selanjutnya, dipilih beberapa organisme yang termasuk isolat CGMMV dengan CP gene yang sudah dideteksi. Dalam penelitian ini, digunakan 13 isolat CGMMV yang akan saling dibandingkan dengan outgroup berupa satu isolat Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV). Hasil homology search tersebut dibuka satu per satu untuk memperoleh data origin berupa sekuen nukleotida dan asam amino. Semua data origin yang akan dianalisis di-copy terlebih dahulu ke dalam bentuk word. Pada setiap data origin diberi nama (strain atau isolat), dimana di depan masing-masing nama tersebut diberi tanda >. Penentuan hubungan similaritas (kemiripan) CP gene berdasarkan sekuen nukleotida. Analisis ini menggunakan software Align dalam situs EBI (http://www.ebi.ac.uk) untuk membandingkan antara dua isolat sehingga diperoleh indeks similaritas. Analisis ini dilakukan untuk ketigabelas isolat CGMMV dan satu isolat KGMMV. Penentuan hubungan filogenetik dan cladogram CP gene berdasarkan similaritas yang diperoleh. Analisis hubungan filogenetik dan pencarian cladogram dilakukan dengan software ClustalW dalam situs EBI (http://www.ebi.ac.uk). Data origin berupa sekuen nukleotida dari 13 isolat CGMMV dan satu isolat KGMMV yang sudah dalam bentuk word dianalisis dengan ClustalW sehingga diperoleh data berupa score table, sequence alignment serta cladogram. Analisis juga dilakukan untuk data origin berupa sekuen asam Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 29 17

ISBN 978-62-95471--8 amino, sehingga dapat dibandingkan hasilnya. Hasil ClustalW berupa cladogram atau pohon filogeni dapat dibaca menggunakan software TreeView. HASIL DAN PEMBAHASAN Indeks similaritas berdasarkan sekuen nukleotida CP gene dari 13 isolat CGMMV dan outgroup Berdasarkan hasil analisis Align, diperoleh indeks similaritas sekuen nukleotida CP gene antara 13 isolat CGMMV dan outgroup (satu isolat KGMMV) yang disajikan dalam Tabel 1. Mengacu pada tabel tersebut, diketahui bahwa dua pasang isolat CGMMV memiliki nilai indeks similaritas tertinggi sebesar 1%, yaitu CGMMV-Zucchini dan CGMMV-China serta CGMMV-LHP dan CGMMV-NS. Hal ini menunjukkan bahwa kedua pasang isolat tersebut masing-masing memiliki sekuen nukleotida yang sama. Sedangkan indeks similaritas terendah antara 13 isolat CGMMV adalah 9.9%, yaitu antara CGMMV-Rajasthan dan CGMMV-GR5. Berdasarkan wilayah asalnya, kedua isolat tersebut berasal dari negara yang berbeda dan cukup jauh, yaitu India (CGMMV- Rajasthan) dan Yunani (CGMMV-GR5). Indeks similaritas dari 13 isolat CGMMV ini dapat dikelompokkan menjadi dua grup, yaitu grup I dan grup II. Grup I terdiri dari isolat-isolat CGMMV dengan indeks similaritas antara 97.3 1%, sedangkan grup II terdiri dari isolat-isolat CGMMV dengan indeks similaritas antara 9.9 %. Tabel 1. Hubungan similaritas sekuen nukleotida CP gene antara 13 isolat CGMMV dengan outgroup. Keterangan: IS : Indeks Similaritas (%) 1 : CGMMV-Zucchini 8 : CGMMV-GR7 2 : CGMMV-China 9 : CGMMV-Rajasthan 3 : CGMMV-LHP 1 : CGMMV-Bangalore 4 : CGMMV-NS 11 : CGMMV-MC-1 5 : CGMMV-Korea 12 : CGMMV-GR3 6 : CGMMV-Bottlegourd 13 : CGMMV-GR5 7 : CGMMV-AL1 14 : KGMMV-YM (outgroup) IS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 1 1 2 1 1 3 1 4 1 1 5 6.4.4 7.4.4 8.. 98 98 9 98 98 98 98 1 97.7 97.7 97.9 97.9 11.4.4 12.4.4 13.. 14.3.3.1.1 1 98 98 97.5.4.1 1 97.4.9 91 91.3 18 Prosiding Keaneka Ragaman Hayati 1 97..9.4 91..5 1 98. 97. 6. 5. 6. 2. 1 1 97.3 1 91 91 1 91 91 97.5 1 9.9 91.4 97.3 1 56.5.3.3. 5 1

ISBN 978-62-95471--8 Group I (97.3 1 %) Group II (9.9 %) Out group Alignment sekuen CP gene dari 13 isolat CGMMV dan outgroup Hasil analisis data dengan ClustalW berupa alignment sekuen CP gene menunjukkan adanya sekuen yang berbeda antara isolat yang satu dengan isolat lainnya, sehingga dapat diketahui terjadinya mutasi pada isolat yang dianalisis. Pada alignment sekuen nukleotida dalam Gambar 1 menunjukkan terjadinya mutasi dalam bentuk substitusi (1), insersi (2) dan delesi (3). Sedangkan Gambar 2 memperlihatkan terjadinya substitusi (1) pada potongan alignment sekuen asam amino. Pada alignment sekuen nukleotida ketigabelas isolat CGMMV, sebagian besar mutasi yang terjadi berupa substistusi, sedangkan insersi dan delesi hanya terjadi satu kali. Untuk alignment sekuen asam amino ketigabelas isolat CGMMV, mutasi dalam bentuk insersi dan delesi sama sekali tidak terjadi. Hubungan filogenetik dan cladogram berdasarkan similaritas sekuen CP gene dari 13 isolat CGMMV dan outgroup Cladogram berdasarkan sekuen nukleotida tidak berbeda dengan cladogram berdasarkan sekuen asam amino. Berdasarkan Gambar 3, cladogram nukleotida mengelompokkan 13 isolat CGMMV ke dalam tiga grup, yaitu grup Asia Timur yang terdiri dari lima isolat, yaitu CGMMV-Zucchini, CGMMV-China, CGMMV-Korea, CGMMV-LHP dan CGMMV-NS; grup Asia Selatan yang terdiri dari lima isolat, yaitu CGMMV-Bottlegourd, CGMMV-Rajasthan, CGMMV-AL1, CGMMV-GR7 dan CGMMV-Bangalore; serta grup Eropa yang terdiri dari tiga isolat, yaitu CGMMV-GR3, CGMMV-GR5 dan CGMMV-MC-1. Sedangkan berdasarkan Gambar 4, cladogram asam amino mengelompokkan 13 isolat CGMMV ke dalam dua grup, yaitu grup Asia yang terdiri dari delapan isolat, yaitu CGMMV-Zucchini, CGMMV-China, CGMMV-LHP, CGMMV-NS, CGMMV-Korea, CGMMV-Bottlegourd, CGMMV-AL1 dan CGMMV- Bangalore; dan grup Eropa yang terdiri dari empat isolat, yaitu CGMMV-MC 1, CGMMV-GR3, CGMMV-GR5 dan CGMMV-GR7. Pada cladogram berdasarkan asam amino, satu isolat CGMMV yaitu CGMMV- Rajasthan memisahkan diri dari kedua grup tersebut. Kemungkinan isolat tersebut telah mengalami mutasi yang cukup kompleks sehingga karakteristiknya menjadi jauh berbeda dengan isolat-isolat grup asalnya. Berdasarkan Gambar 2, CGMMV-Rajasthan mengalami mutasi yang terjadi pada sekuen asam amino ke-87 dan ke-113. Pada sekuen asam amino ke-87, terjadi substitusi asam amino yang seharusnya serin (TCC) menjadi prolin (CCC). Sedangkan mutasi yang terjadi pada sekuen asam amino ke-113 merupakan substitusi asam amino dari lisin (AAG) menjadi asam glutamat (GAG). Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 29 19

ISBN 978-62-95471--8 Gambar 3. Cladogram CGMMV berdasarkan sekuen nukleotida. Gambar 4. Cladogram CGMMV berdasarkan sekuen asam amino. Cladogram tersebut juga menunjukkan terjadinya pemisahan antara isolat-isolat CGMMV dengan KGMMV sebagai outgroup. Hal ini berarti bahwa kedua spesies virus tersebut memiliki karakteristik yang berbeda meskipun masih termasuk dalam satu genus. Karakteristik KGMMV hampir sama dengan CGMMV, baik struktur partikel virus maupun gejala (symptoms) yang ditimbulkannya. Menurut Daryono et al. (26), struktur partikel KGMMV juga berbentuk rod-shaped seperti CGMMV, tetapi ukurannya sedikit berbeda. Sedangkan gejala yang ditimbulkan KGMMV bersifat sistemik pada tumbuhan, yaitu berupa klorotik, mosaik, mottle dan perubahan bentuk pada daun, pertumbuhan yang terhambat, serta bercak basah pada permukaan buah (Daryono et al., 25). Berdasarkan cladogram tersebut juga dapat dilihat beberapa isolat memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat, yaitu antara CGMMV-Zucchini dan CGMMV-China 11 Prosiding Keaneka Ragaman Hayati

ISBN 978-62-95471--8 serta antara CGMMV-LHP dan CGMMV-NS. Pada umumnya, isolat yang memiliki kedekatan hubungan kekerabatan ini merupakan isolat-isolat yang berasal dari cakupan wilayah geografis yang sama. KESIMPULAN Hasil analisis data menunjukkan bahwa dua pasang isolat CGMMV, yaitu CGMMV-Zucchini dan CGMMV-China serta CGMMV-LHP dan CGMMV-NS, memiliki indeks similaritas tertinggi (1%). Sedangkan indeks similaritas terendah (9.9%) dimiliki oleh pasangan isolat CGMMV-Rajasthan dan CGMMV-GR5. Berdasarkan indeks similaritas tersebut, diperoleh hubungan kekerabatan antara 13 isolat CGMMV yang dapat dikelompokkan menjadi tiga grup, yaitu grup Asia Timur, Asia Selatan dan Eropa. DAFTAR PUSTAKA Chang, K. S., K. S. Han, H. L. Jung, W. B. Dong, K. K. Dong and K. K. Hee. 25. Isolation and Characterization of Watermelon Isolate of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV-HY1) from Watermelon Plants with Severe Mottle Mosaic Symptoms. Plant Pathology Journal, 21(2): 167-171. Daryono, B.S., S. Somowiyarjo and K. T. Natsuaki. 25. Biological and Molecular Characterization of Melon-Infecting Kyuri green mottle mosaic virus in Indonesia. J. Phytopathology 153 (1): 588-595. Daryono, B.S., S. Somowiyarjo and K. T. Natsuaki. 26. Biological Characterization and Complete Nucleotide Sequence of Coat Protein Gene of Kyuri green mottle mosaic virus Isolated from Angled Loofah in Indonesia. Jour. Agri. Sci., Tokyo Univ. of Agric., 51 (1): 45-52. Mathura, V. S. and P. Kangueane. 29. Bioinformatics A Concept-Based Introduction: Biological Sequence Databases. Springer Science & Business Media. Verlag- Berlin-Heidelberg, pp: 39-43. Utama, A. 23. Aplikasi Bioinformatika dalam Virologi. Artikel Populer IlmuKomputer.Com. http://ilmukomputer.org/26/8/24/bioinformatika-dalamvirologi/. Diakses pada tanggal 5 Mei 29. Varveri, C., N. Vassilakos and F. Bem. 22. Characterization and Detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus in Greece. Phytoparasitica, 3(5): 1-8. Yi-Ping, P. C. 25. Bioinformatics Technologies: Introduction to Bioinformatics. Springer Science & Business Media. Verlag-Berlin-Heidelberg, pp: 1-5. Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 29 111