32 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Rekayasa Proses Pengembangan Produk Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor serta Laboratorium Kimia Pangan, Departemen ITP, Institut Pertanian Bogor dari bulan Mei 26 hingga bulan Januari 27. Bahan dan Alat Destilat asam lemak minyak sawit (DALMS), gliserol (teknis), enzim lipase, heksan (teknis), silika gel dan pelarut yang sesuai, petroleum eter (pa), dietil eter (pa), asam asetat glasial (pa), asam sulfat 5% (pa), pelarut tertierbutanol, aquades, CCl 4, larutan I 2, larutan KI 5%, indikator pati, Na 2 S 2 O 3, NaOH, piridin, n-tetradekana, alkohol 5%, indikator pp %, 2,7- dichlorofluorescen, BSTFA [bis (trimethylsilil)trifluoro acetamide], TMCS (trimethylchlorsilane). Peralatan gelas, pipet volume, neraca analitik, lempeng KLT, buret, magnetic stirrer, penangas air, vorteks, shaker. Metode Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi karakterisasi sifat fisikokimia DALMS, penentuan volume pelarut dalam sintesis M-DAG, optimasi sintesis M-DAG dan karakterisasi fisikokimia M-DAG. Karakterisasi Sifat Fisikokimia DALMS Karakterisasi sifat fisikokimia destilat asam lemak minyak sawit (DALMS) dilakukan untuk mengetahui kadar asam lemak, bilangan iodin dan titik leleh bahan baku sebelum dilakukan esterifikasi. Penentuan Volume Pelarut Dalam Sintesis M-DAG a. Penentuan Volume Pelarut Tertier- Butanol Pada tahap ini dicari pengaruh penggunaan pelarut tersier butanol dengan berbagai volume ( ml, 4 ml, ml dan 28 ml ) pada waktu reaksi 5 jam dalam
33 sintesis mono dan diasilgliserol dengan biokatalis, yang mengacu pada metode yang telah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Pujiastuti 8 dan Nurcahyo et al. 22). Bahan baku yang digunakan adalah destilat asam lemak minyak sawit dan gliserol sebanyak gram dengan rasio DALMS:gliserol (2:3) reaksi pada suhu 5 o C dan waktu 5 jam seperti dapat dilihat pada Gambar 6. Hasil yang maksimal dari tahapan ini digunakan untuk proses selanjutnya dalam menentukan kondisi optimum sintesis mono dan diasilgliserol yaitu waktu reaksi, suhu dan volume pelarut. Parameter untuk menentukan kondisi optimum disini adalah jumlah rendemen dan komposisi M-DAGnya. b.penentuan Volume Pelarut Heksan Sebagai Pelarut Kristalisasi Penentuan volume pelarut heksan sebagai pelarut kristalisasi dilakukan pada saat volume pelarut tertier-butanol terbaik telah ditentukan. Fraksinasi dan kristalisasi campuran M-DAG hasil sintesis dilakukan dengan penambahan pelarut heksan dengan volume 3 ml, 4 ml dan 5 ml dengan 2 kali ulangan. Ketiga perlakuan tersebut disimpan dalam refrigerator 7º C selama 24 jam kemudian dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman no 42 dan dikeringkan hingga diperoleh berat konstan. Optimasi Sintesis M-DAG Pada tahapan ini dicari kondisi optimum dengan proses batch, rancangan yang digunakan adalah Central Composite Design (CCD). Model permukaan tanggap (respon surface) digunakan untuk melihat pengaruh waktu reaksi, suhu reaksi dan volume pelarut tertier- butanol pada jumlah produk yang dihasilkan dan untuk mengoptimumkan kondisi proses dalam menghasilkan produk monodiasilgliserol. Rancangan percobaan yang akan dilakukan dapat dilihat pada Tabel 5, Tabel 6 dan Tabel 7. Indikator yang digunakan untuk melihat kondisi optimum adalah komposisi M-DAG dengan kromatografi lapis tipis (KLT) pada saat optimasi dan verifikasi kondisi optimum. Proses kristalisasi dilakukan terhadap produk akhir yang diperoleh dari tahap produksi yaitu dengan menambahkan pelarut heksan dan diaduk, kemudian dilakukan fraksinasi (dimasukkan dalam refrigerator) dan kemudian disaring.
34 Tabel 5 Perlakuan dan kode perlakuan pada penelitian Parameter -.682 - +.682 Waktu (jam) 5 6.65 4.35 23 Volume pelarut (ml) 4 6 2 4 Suhu ( o C) 4 44 5 56 6 Tabel 6 Rancangan percobaan dengan pengkodean No Suhu Waktu Volume pelarut tertier- butanol 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8 2 - - - - -,682,682 - - - - -.682.682 - - - - -.682.682 Sumber : Cochran dan Cox (62) Rasio bahan baku yaitu rasio destilat asam lemak sawit: gliserol mengacu pada hasil penelitian sebelumnya (Pujiastuti 8) yaitu 2:3 serta dicari pengaruh penggunaan dan tanpa penggunaan pelarut tertier butanol terhadap rendemen monodiasilgliserol yang dihasilkan. Proses sintesis monodiasilgliserol secara sederhana digambarkan dalam bentuk skema proses pada Gambar 6. Proses reaksi esterifikasi sintesis M-DAG dilakukan dengan mencampurkan substrat (DALMS dan gliserol) berdasarkan rasio yang telah ditentukan yaitu 2:3. Campuran substrat dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan pelarut tertier butanol (untuk perlakuan dengan penambahan pelarut) dan enzim kemudian dishaker pada waktu dan suhu yang telah
35 ditentukan. Setelah mencapai waktu yang ditentukan dilakukan pemisahan katalis dengan penyaringan. DALMS: Gliserol (2:3) g Penambahan pelarut tertierbutanol Pencucian dengan heksan 3 ml Penambahan enzim lipase 4% (b/b) dari total substrat Pengendapan di refrigerator 7 o C, 24 jam Shaker 25rpm, 5 o C, 5 jam Penyaringan dengan Whatman 42 Pemisahan katalis dengan penyaringan Produk M-DAG dikeringkan dan ditimbang Penguapan di atas hotplate Gambar 6 Skema sintesis M-DAG secara enzimatik dari DALMS (Modifikasi Pujiastuti 8) Filtrat yang diperoleh diuapkan dan dilakukan pencucian dengan heksan untuk memisahkan gliserol, setelah itu dilakukan pengendapan dengan memasukkan ke dalam refrigerator selama 24 jam dan dilakukan penyaringan terhadap produk M-DAG dengan menggunakan kertas saring Whatman no 42 dan dikeringkan hingga diperoleh berat endapan yang stabil. Endapan hasil pengeringan disebut sebagai berat produk M-DAG. Rendemen dihitung berdasarkan perbandingan berat produk M-DAG yang diperoleh terhadap berat
36 M-DAG yang dihitung secara teoritis dikalikan % Contoh perhitungan berat produk M-DAG secara teoritis dapat dilihat pada Lampiran. Tabel 7 Setting perlakuan pada penelitian berdasarkan Central Composite Design No Perlakuan Suhu ( o C) 44 2 56 3 44 4 56 5 44 6 56 7 44 8 56 4 6 5 2 5 3 5 4 5 5 5 6 5 7 5 8 5 5 2 5 Waktu (jam) Volume pelarut tertier - butanol (ml) 8.65 6 8.65 6.35 6.35 6 8.65 2 8.65 2.35 2.35 2 4 4 5 23 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Karakterisasi Fisikokimia Mono-diasilgliserol a. Analisis Komposisi M-DAG Dengan Kromatografi Lapis Tipis (Modifikasi Gunstone et al. 4) Sebanyak mg produk campuran M-DAG dilarutkan dalam, ml kloroform. Sebanyak µl larutan diaplikasikan pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) dalam bentuk spot bulat dengan jarak antar spot 2 cm. Lempeng KLT dielusi menggunakan campuran pelarut petroleum eter : dietil eter : asam asetat (7:3:,2) glasial yang telah dijenuhkan sebelumnya. Setelah elusi dilakukan kurang lebih,5 jam lempeng dikeluarkan dari bejana pengembang dan dibiarkan beberapa menit sampai uap yang masih tertinggal hilang. Identifikasi yang dilakukan adalah dengan pewarnaan menggunakan larutan fluorescen seperti Rhodamine 6G atau 2,7- dichlorofluorescen yang
37 disemprotkan pada lempeng. Kemudian spot yang terbentuk dilihat dibawah sinar ultra violet pada panjang gelombang 256 nm. Spot yang telah terbentuk diberi tanda kemudian diplotkan pada kertas kalkir. Gambar spot digunting dengan hatihati kemudian ditimbang untuk mengetahui komposisi masing-masing fraksi. b. Analisis Komposisi Gliserida M-DAG Dengan Kromatografi Gas (Modifikasi AOAC Official Method 3.8, 5) Sampel ditimbang teliti kurang lebih,2 mg dimasukkan dalam vial kemudian ditambahkan,2 ml BSTFA [bis(trimethylsilil)trifluoro acetamide] dan, ml TMCS (trimethylchlorsilane) dan, ml larutan standart internal n- Tetradecana kemudian dikocok hati-hati dan dipanaskan pada suhu 7 o C selama 3 menit setelah itu segera diinjeksikan ke kromatografi gas µl. Dilakukan juga seperti diatas untuk, ml larutan referensinya (MAG dan DAG) pada kondisi operasi yang sama, peak yang muncul diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi dari referensi. Larutan referensi dibuat dengan menimbang,2 mg referensi dilarutkan dalam piridin menggunakan labu takar ml. Kromatografi gas yang digunakan dilengkapi dengan split injeksi atau kolom injeksi dan FID dengan kondisi operasi sebagai berikut : suhu kolom awal 5 o C dinaikkan menjadi 8 o C dengan kenaikan 5 o C/ menit kemudian dinaikkan lagi menjadi 23 o C dengan kenaikan 7 o C/ menit dan dinaikkan lagi menjadi 38 o C dengan kenaikan 3 o C/ menit kemudian ditahan menit, suhu akhir 38 o C, suhu detektor 3 o C, suhu injektor 3 o C, kecepatan gas pembawa,7 ml N 2 /menit, kecepatan aliran udara 45 ml/ menit dan volume injeksi µl. c. Kadar Asam Lemak Bebas (AOAC Official Method 4.28. 5) Kurang- lebih 5 gram sampel dilarutkan dalam 5 ml alkohol 5%, dipanaskan selama menit dalam penangas air sambil diaduk, lalu ditambahkan 3-5 tetes indikator pp %. Kemudian dilakukan titrasi dengan larutan standart NaOH,N hingga warna merah muda tetap. Asam lemak bebas dinyatakan sebagai persen asam lemak, dihitung sampai dua desimal dengan menggunakan rumus :
38 Kadar ALB = M x V x T m Keterangan : M = Bobot molekul asam lemak V = Volume NaOH dalam titrasi (ml) N = Normalitas NaOH m = Bobot sampel (gram). d. Bilangan Iodin (AOAC Official Method 3.2. 5) Kurang lebih 2 g sampel dimasukkan dalam beaker glass 5 ml yang sudah terdapat 2 ml CCl 4. Tambahkan 25 ml larutan I 2 kemudian disimpan ditempat gelap selama 3 menit pada suhu 25 o C. Tambahkan 2 ml larutan KI 5% dan ml air mendidih yang sudah didinginkan. Lakukan titrasi dengan Na 2 S 2 O 3.N sehingga warna berubah dari kuning menjadi tidak berwarna.kemudian tambahkan indikator pati dan titrasi dilanjutkan sampai terbentuk warna biru yang tidak hilang. Lakukan juga terhadap blangko. [ (B-S)xNx 2.6] Bilangan Iodin = Berat sampel Keterangan : B = volume titran dari blanko (ml) S = volume titran dari sampel (ml) N = normalitas larutan Na 2 S 2 O 3 e. Titik Leleh (AOCS Method Cc 3-25. 4) M-DAG dicairkan dan diisikan pada tabung kapiler (mm i.d) setinggi mm, kemudian didinginkan dalam freezer. Tabung dipanaskan perlahan-lahan pada gelas piala yang berisi air. Dilakukan pencatatan suhu ketika sampel mulai bergerak naik dan saat telah naik 4 cm dari semula. Titik leleh adalah rata-rata pembagian kedua pembacaan suhu tersebut.
3 Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan adalah Central Composite Design, model Respon Surface digunakan untuk melihat pengaruh perlakuan (volume pelarut, waktu reaksi dan suhu reaksi) terhadap produk M-DAG yang dihasilkan. Model umum rancangan yang digunakan adalah : k k k-,k 2 Y = βo + β i X i + β ii X i + β i,j X i X j + ε i= i= i=, j=2. Keterangan : Y = Respon pengamatan βo = Intersep βi = Koefisien linier βii = Koefisien kuadratik βij = Koefisien interaksi perlakuan Xi = Kode perlakuan untuk faktor ke i Xj = Kode perlakuan untuk faktor ke j ε = Jumlah faktor yang dicobakan (Cochran dan Cox 62). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan software SAS v6.2 dan untuk memperoleh bentuk permukaan respon menggunakan software Surfer 32.