BAB 3 METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: - Rotari Evaporator Heidolph WB Gelas ukur Pyrex - Gelas beaker Pyrex - Gelas erlenmeyer Pyrex - Tabung reaksi Pyrex - Corong kaca - Corong pisah - Pipet tetes - Spatulla - Penangas air - Botol vial - Batang pengaduk - Aluminium foil - Kapas - Cotton bud - Rak tabung reaksi - Blender - Lemari pendingin Toshiba - Pipet mikro Eppendorf - Jarum ose - Cawan petri - Inkubator Fiber Scientific - Kertas cakram - Bunsen - Jangka sorong - Autoklaf Yamata SN 20

2 22 - Pinset - Kuvet - Labu takar - Neraca analitis Mettler AE Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: - Buah keben - Metanol - Etil asetat - n-heksana - Aquadest - FeCl 3 5% - CeSO 1% dalam H 2 SO 4 10% - Pereaksi Wagner - Pereaksi Maeyer - Pereaksi Bouchardat - Pereaksi Dragendorf - Dimethyl sulfoxide (DMSO) - Nutrient Broth (NB) - Nutrient Agar (NA) - Mueller Hinton Agar (MHA) - Biakan Staphylococcus aureus - Biakan Escherichia coli 3.3 Prosedur Penelitian Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah kulit buah keben yang diperoleh di daerah jalan Bioteknologi Fakultas MIPA,, Medan. Kulit buah keben dihaluskan dengan blender sampai diperoleh serbuk kulit buah keben sebanyak 350 g.

3 Skrining Fitokimia Kulit Buah Keben Dipotong kecil-kecil kulit buah keben segar sebanyak 50 gram, kemudian dipanaskan pada waterbath hingga diperoleh ekstraknya. Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji skrining dengan beberapa tahap uji sebagai berikut: Uji Tanin Ekstrak Metanol kulit buah keben dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan FeCl 3 5%, jika terbentuk larutan berwarna hitam maka positif mengandung tannin Uji Terpenoida Ekstrak metanol kulit buah keben diteteskan pada plate klomatorgrafi lapis tipis ditambahkan CeSO 4 1% Kemudian panaskan, jika terbentuk warna merah kecoklatan maka positif mengandung terpenoida Uji Alkaloida Ektrak metanol kulit buah keben dimasukkan dalam 3 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan coklat maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Meyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positf mengandung alkaloida Uji Saponin Ekstrak metanol kulit buah keben dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml aquadest, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika terbentuk busa maka positif mengandung saponin Uji Flavonoida Ekstrak metanol kulit buah keben dimasukkan dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan etil asetat dan peraksi FeCl 3, jika terbentuk larutan warna hitam maka positif mengandung flavonoida.

4 Ekstraksi Kulit Buah Keben Serbuk kulit buah keben ditimbang sebanyak 350 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 4 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak metanol kulit buah keben. Ekstrak metanol kulit buah keben di pekatkan diatas penangas air sehingga diperoleh ekstrak padat metanol. Ekstrak padat metanol yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan etil asetat hingga terbentuk endapan dan ekstrak etil asetat. Endapan dipisahkan (tidak dilanjutkan) dan diuji pada pereaksi untuk identifikasi senyawa tanin positif, dilanjutkan dengan uji antibakteri terhadap bakteri S. aureus, dan E. coli. Ekstrak etil asetat dipekatkan dengan menggunakan penangas air sehingga diperoleh ekstrak padat etil asetat, ekstrak padat yang diperoleh diuapkan hingga semua etil asetat menguap. Ekstrak padat tersebut dilarutkan dengan metanol dan dipartisi dengan n-heksana hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah yaitu etil asetat dan lapisan atas yaitu n-heksana. Partisi dilakukan kembali secara berulang-ulang menggunakan pelarut n-heksana sampai lapisan n-heksana bening dan ekstrak etil asetat yang diperoleh memberikan hasil uji yang positif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak etil asetat dan n-heksana dipekatkan kembali dengan penangas air hingga diperoleh ekstrak padat etil asetat dan ekstrak padat n-heksana. Ekstrak padat etil asetat dan n-heksana dilanjutkan dengan uji antibakteri terhadap bakteri S. aureus dan E. coli Uji Antibakteri Ekstrak Etil Asetat, Metanol, dan n-heksana Kulit Buah Keben Pembuatan Media Nutrient Agar (NA) Sebanyak 7 g nutrien agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu C selama 15 menit.

5 Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut Biakkan bakteri staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasi pada permukaan media nutrient agar miring denggan cara menggores, kemudian diinkubasi pada suhu 35 0 C selama jam. Hal sama juga dilakukan pada biakan bakteri Escherichia coli Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA) Sebanyak 10,2 g serbuk mueller hinton agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 300 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu C selama 15 menit Pembuatan Inokulum Bakteri Sebanyak 3,25 g nutrient broth (NB) dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan diautoklaf C selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan kedalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 35 o C selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar Mc Farland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteri Escherichia coli Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksana Kulit Buah Keben Ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksan ditimbang 500 mg kemudian dilarutkan dengan 1 ml DMSO, konsentrasi ekstrak sama dengan 500 mg/ml. kemudian dari konsentrasi 500 mg/ml dengan rumus pengenceran V 1. C 1 = V 2. C 2 dihitung untuk konsentrasi 400 mg/l, 300 mg/ml, 200 mg/ml dan 100 mg/ml. perlakuan yang sama dilakukan untuk ekstrak etil asetat dan n-heksana

6 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat, Metanol, dan n- Heksana Kulit Buah Keben Dimasukkan media Mueller Hinton Agar (MHA) kedalam cawan petri steril dengan suhu C kemudian dibiarkan sampai memadat. Diambil cotton bad steril, lalu dicelupkan kedalam inokulum bakteri, kemudian digoreskan ke media MHA yang telah memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak etil asetat, metanol, dan n-heksan kulit buah keben dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 0 C selama jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat disekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri E. Coli

7 Bagan Penelitian Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben dimasukkan kedalam tabung reaksi secukupnya ditambahkan pereaksi untuk masing-masing uji Alkaloid Flavonoid Terpenoid Tanin Saponin Tabung I+ pereaksi Meyer ditambahkan FeCl 3 ditotolkan pada plat KLT ditambahkan FeCl 3 5% ditambahkan aquadest Tabung II+ pereaksi Dragendoff disemprotkan dengan CeSO 4 dikocok kuat-kuat Tabung III + pereaksi Bouchardart Alkaloid negatif Flavonoid positif Terpenoid positif Tanin Positif Saponin negatif

8 Ekstraksi Metanol, Etil Asetat, dan n-heksana Kulit Buah Keben 350 gr Serbuk Kulit Buah Keben dimaserasi dengan metanol sebanyak 4 L didiamkan selama ± 24 jam disaring Larutan Metanol Residu Ekstrak Padat Metanol diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotari evaporator ditambahkan dengan etil asetat disaring Larutan Etil Asetat Ekstrak Padat Etil Asetat diuapkan dengan penangas air dilarutkan dengan metanol dipartisi dengan n-heksan Yang Tidak Larut Dalam Etil Asetat (Ekstrak Padat Metanol) diuapkan dengan penangas air Hasil diuji aktivitas antibakteri Larutan Metanol Yang Mengandung Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Padat Etil Asetat Hasil diuapkan dengan penangas air diuji aktivitas antibakteri Larutan n-heksan Ekstrak Padat n-heksan Hasil diuapkan dengan penangas air diuji aktivitas antibakteri

9 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksana Pada Kulit Buah Keben Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA) 10,2 g Media Mueller Hinton Agar (MHA) Media Mueller Hinton Agar (MHA) Steril dilarutkan dengan 300 ml aquadest dalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih disterilkan dalam autoklaf pada suhu c selama 15 menit Pembuatan Media Nutrient Agar (NA), Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri 7 g Media Nutrient Agar (NA) Media Nutrient Agar (NA) Steril dilarutkan dengan 250 ml aquadest dalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih disterilkan dalam autoklaf pada suhu C selama 15 menit dituangkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudu C diambil biakan bakteri S.aureus dari Strain utama dengan jarumose lalu digoreskan pada media nutrient agar yang telah memadat diinkubasi pada suhu 35 0 C selama jam Stok Kultur Bakteri Staphylococcus aureus Dilakukan hal yang sama untuk bakteri Escherichia coli

10 Penyiapan Inokulum Bakteri 3,25 g Media Nutrient Broth (NB) dilarutkan dengan 250 ml aquadest kedalam erlenmeyer dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan memdidih disterilkan dalam autoklaf pada suhu C selama 15 menit Media Nutrient Broth (NB) Steril dimasukkan sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi diambil koloni bakteri S. aureus dari stok kultur bakteri dengan jarum ose disuspensikan kedalam Nutrient Broth (NB) diinkubasi pada suhu 35 0 C selama 3 jam dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan Mc farland (10 8 CFU/ml) Inokulum Bakteri Sthaphylococcus aureus Dilakukan hal yang sama untuk bakteri Escherichia coli

11 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksan Pada Kulit Buah Keben Inokulum Bakteri dimasukkan media MHA kedalam cawan petri steril dengan suhu C dibiarkan sampai memadat diambil cotton bad steril, lalu dicelupkan kedalam inokulum bakteri digoreskan ke media MHA yang telah memadat dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksan kulit buah keben dengan berbagai konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri diinkubasi selama jam pada suhu 35 0 C diukur diameter zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong Hasil

12 32 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben Ekstrak metanol kulit buah keben yang diperoleh diuji skrining fitokimia untuk mengetahui adanya golongan senyawa alkaloida, flavonoida, tanin, saponin dan terpenoida yang ditunjukkan pada tabel 4.1. Tabel 4.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben No Parameter Pereaksi Hasil 1 Alkaloida Dragendorf - Bouchardat - Meyer - Wagner - 2 Flavonoida FeCl Terpenoida CeSO 4 1% + 4 Saponin Aquadest - 5 Tanin FeCl 3 5% + Keterangan : - = Reaksi Negatif + = Reaksi Positif

13 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n- Heksana pada Kulit Buah Keben Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan beberapa bakteri yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Hal ini dapat dilihat dari hasil pengukuran diameter zona bening yang terbentuk, yaitu berupa wilayah bening disekeliling kertas cakram yang mengandung ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben yang dapat dilihat pada gambar dibawah ini Gambar 4.1 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak Metanol Gamabar 4.2 Zona hambat bakteri Escherichia coli Ekstrak Metanol

14 34 Gambar 4.3 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak Etil Asetat Gambar 4.4 Zona hambat bakteri Escherichia coli Ekstrak Etil Asetat

15 35 Gambar 4.5 Zona hambat bakteri Staphylococcus aureus Ekstrak n-heksana Gambar 4.6 Zona hambat bakteri Escherichia coli Ekstrak n-heksana

16 36 Hasil pengukuran diameter zona bening aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada tabel 4.2 berikut ini: Tabel 4.2.Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kulit Buah Keben Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Estrak n-heksana mg/ml E. coli S. aureus E. coli S. aureus E.coli S.aureus blanko ,00 6,34 6,81 9,14 6,00 6, ,84 6,90 7,27 11,03 6,09 6, ,20 7,58 8,12 11,80 6,22 6, ,33 9,25 9,38 12,24 7,11 7, ,63 13,30 11,37 16,42 7,32 7,45 Keterangan : Blanko = Kertas cakram direndam dengan DMSO 4.2 Pembahasan Uji Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Kulit Buah Keben Skrining fitokimia merupakan tahap pendahuluan dari suatu penelitian yang bertujuan untuk memberikan gambaran tentang golongan senyawa yang terkandung dalam tumbuhan (Kristansti, dkk, 2008). Berdasarkan hasil skrining fitokimia golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol kulit buah keben adalah terpenoida, flavonoida, dan tanin. Berdasarkan Tabel 4.1 Hasil skrining fitokimia ekstrak metanol kulit buah keben mengandung golongan senyawa terpenoida, flavonoida, dan tanin yang dapat ditarik dalam pelarut metanol, hal ini disebabkan karena metanol memiliki gugus polar (-OH) dan gugus non polar (-CH 3 ) sehingga dapat menarik analitanalit yang bersifat polar dan non polar.

17 37 Uji flavonoida pada ekstrak metanol kulit buah keben dengan penambahan FeCl 3. Pada pengujian flavonoida dari ekstrak metanol kulit buah keben menyebabkan perubahan warna menjadi kuning kemerahan sehingga positif mengandung flavinoida. Flavonoida mempunyai tipe yang beragam dan terdapat dalam bentuk bebas (aglikon) maupun terikat sebagai glikosida. Aglikon polimetoksi bersifat non polar, aglikon polihidroksi bersifat semi polar, sedangkan glikosida flavonoiad bersifat polar yaitu mengandung sejumlah gugus hidroksil dan gula, sebab itu golongan flavonoida dapat tertarik dalam pelarut metanol yang bersifat universal (Harborne, 1987). Saponin mengandung gugus glikosida, Glikosida adalah suatu kompleks antara gula pereduksi (glikon) dan bukan gula (aglikon). Glikon bersifat mudah larut dalam air. Selain itu saponin adalah senyawa aktif permukaan kuat yang menimbulkan busa jika dikocok dengan air. Timbulnya busa menunjukkan adanya glikosida yang terhidrolisis dalam air menjadi glukosa dan senyawa lain (aglikon) (Robinson, 1995). Pengujian terpenoida didasarkan pada kemampuan senyawa untuk membentuk warna dengan penambahan CeSO 4 1% dalam H 2 SO 4 10%. Hasil yang diperoleh menunjukkan hasil positif dengan terbentuknya warna merah kecoklatan yang menunjukkan adanya kandungan terpenoida (Sangi et al, 2008). Pengujian tanin didasarkan pada kemampuan senyawa untuk membentuk warna dengan pemambahan FeCl 3 5%. Pada penambahan ini golongan tanin terhidrolisis akan menghasilkan warna hitam. Perubahan warna ini terjadi ketika penambahan FeCl 3 yang bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada senyawa tanin (Sangi et al, 2008) Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n- Heksana pada Kulit Buah Keben Berdasarkan Clinical and Laboratory Standars Institute (2012) menyatakan bahwa batas daerah hambatan bakteri yaitu dengan diameter zona hambat 20 memiliki zona hambatan yang sangat efektif, antara 15 sampai 19 mm memiliki zona hambatan efektif, 14 memiliki zona hambatan kurang efektif.

18 38 Dari tabel 4.2 diatas dapat dilihat bahwa ekstrak etil asetat kulit buah keben menunjukkan diameter zona hambat yang lebih efektif terhadap bakteri gram positif Staphylococcus aureus pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat bakteri 16,42 mm dibandingkan dengan bakteri gram negatif Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat bakteri 11,37 mm. Dan juga dapat di lihat bahwa semakin besar konsentrasi ekstrak maka semakin besar pula diameter daya hambat yang dibentuknya, sehingga diketahui bahwa keduanya memiliki hubungan yang berbanding lurus satu sama lain, dan dapat digambarkan dibawah ini : Diameter Zona Bening (mm) Konsentrasi (mg/ml) Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Ekstrak n-heksana Gambar 4.7 Grafik Diameter Zona Bening bakteri Escherichia coli pada Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksana 20 Diameter Zona Bening (mm) Konsentrasi (mg/ml) ekstrak metanol ekstrak etil asetat ekstrak n-heksana Gambar 4.8 Grafik Diameter Zona Bening bakteri Staphylococcus aureus pada Ekstrak Metanol, Etil Asetat, dan n-heksana

19 39 Hasil uji aktivitas antibakteri pada ekstrak metanol kulit buah keben dapat menghambat petumbuhan bakteri lebih baik dengan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 13,30 dan 10,63 mm. Pada ekstrak etil asetat kulit buah keben menunjukkan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 16,42 dan 11,37 mm. Dan pada ekstrak n-heksana kulit buah keben menunjukkan zona hambat yang efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 7,45 dan 7,32 mm. Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanol, etil asetat, dan n-heksana kulit buah keben lebih mudah menghambat pertumbuhan bakteri gram positif Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif Escherichia coli. Hal ini disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri gram positif dan gram negatif. Struktur dinding sel bakteri gram positif berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif memiliki kandungan lipid tinggi yaitu 11-12% dan membran terluar terdiri dari 3 lapisan yaitu lipopolisakarida, lipoprotein, dan pospolipid (Fardiaz, 1992). Hal ini sesuai dengan hasil uji skrining fitokimia yang menunjukkan bahwa ekstrak metanol kulit buah keben mengandung senyawa berupa flavonoida, terpenoida dan tanin. Adanya senyawa tanin dan flavonoid yang merupakan senyawa fenol menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah keben memiliki aktivitas antibakteri (Robinson, 1995). Senyawa fenol bekerja dengan cara mendenaturasi sel protein sehingga sel protein pada bakteri menjadi kehilangan aktivitas biologinya. Akibat terganggunnya fungsi permeabilitas sel bakteri maka bakteri mengalami lisis (pemecahan sel) yang mengakibatkan pada kematian sel bakteri (Harborne, 1987).

20 40 Sedangkan senyawa golongan terpenoida pada ekstrak metanol kulit buah keben dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara merusak membran sel bakteri, membran sel bakteri bertindak sebagai pelindung dan mengontrol pertukaran zat dengan lingkungannya (Jawetz et al, 2001).

21 42 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5. 1 Kesimpulan 1. Berdasarkan hasil skrining fitokimia golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol kulit buah keben adalah terpenoida, flavonida, dan tanin. 2. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kulit buah keben memberikan diameter zona hambat yang lebih baik terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 500 mg/ml dengan diameter zona hambat masing-masing 16,42 dan 11,37 mm, sedangkan pada ekstrak metanol dengan diameter zona hambat masingmasing 13,30 dan 10,63 mm, dan pada ekstrak n-heksana dengan diameter zona hambat masing-masing 7,45 mm dan 7,32 mm. 5.2 Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai uji antibakteri kulit buah keben (Barringtonia asiatica L. Kurz) dengan beberapa jenis bakteri pathogen lainnya dengan menggunakan konsentrasi yang berbeda pula.