II. BAHAN DAN METODE 2.1 Metode Penelitian Persiapan Wadah Persiapan Ikan Uji

Transkripsi

1 II. BAHAN DAN METODE 2.1 Metode Penelitian Persiapan Wadah Akuarium yang digunakan sebanyak 15 buah dan tandon sebanyak 2 buah. Sebelum digunakan, akuarium dan tandon dibersihkan menggunakan sabun dan dibilas bersih. Kemudian didesinfeksi menggunakan kaporit selama 24 jam, setelah itu dibilas sampai bersih dan dikeringkan. Setelah bersih, akuarium diisi dengan air tandon hingga ketinggian 30 cm dan diaerasi kuat Persiapan Ikan Uji Ikan mas Cyprinus carpio jenis Majalaya berukuran 10±0,8 cm yang berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi, Jawa Barat sebanyak 150 ekor dibagi menjadi 5 kelompok dengan masing-masing 3 kali ulangan. Ikan diadaptasi di akuarium selama 4 hari Pembuatan Ekstrak Bawang Putih Cair (Puspitaningtyas, 2006) Bawang putih sebanyak 50 gram diblender dalam 100 ml akuades. Hasil ekstrak tersebut kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat ekstrak bawang putih segar dengan konsentrasi 50 g/100 ml Pemberian Pakan Ikan uji diberi pakan buatan berupa pelet terapung (kadar protein 28%) komersial sebanyak 2 kali sehari pada pagi dan sore hari secara at satiation. Penambahan ekstrak bawang putih dilakukan dengan metode spray secara merata dengan dosis 100 ml/kg pakan dan penambahan kuning telur sebanyak 2% yang berfungsi sebagai binder (Wang, 2007). Penambahan ekstrak bawang putih pada pakan dilakukan setiap hari untuk menjaga kesegaran dan kualitas bahan yang digunakan. Untuk menjaga kualitas air dilakukan penyifonan setiap hari Penyediaan Suspensi KHV (Giri, 2008) Virus KHV berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT), Sukabumi, Jawa Barat yang telah diuji dengan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) yang menunjukkan hasil positif. Organ insang dari ikan mas yang terinfeksi KHV sebanyak 2 gram digerus sampai halus dan disuspensikan dalam 8 ml larutan fisiologis. Suspensi organ disaring dengan kain 3

2 kasa lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas saring 0,45 µm sehingga didapat konsentrasi virus 20% Penyuntikan Ikan Mas dengan Virus Setelah perlakuan pakan selesai, ikan lalu diuji tantang selama kurun waktu 14 hari dengan menyuntikkan suspensi KHV sebanyak 0,1 ml secara intramuscular dilakuan pada hari ke-22 pemeliharaan Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang dibuat adalah rancangan acak lengkap dengan pembagian 5 kelompok perlakuan masing-masing 3 kali ulangan. Adapun kelompok perlakuannya yaitu : Perlakuan K- : Pakan tanpa penambahan ekstrak bawang putih dan disuntik PBS 0,1 ml Perlakuan K+ : Pakan tanpa penambahan ekstrak bawang putih dan diinfeksi KHV 0,1 ml. Perlakuan A : Pakan dengan penambahan ekstrak bawang putih (50 gram/kg pakan) selama 21 hari dan diinfeksi KHV 0,1 ml. Perlakuan B : Pakan dengan penambahan ekstrak bawang putih (50 gram/kg pakan) selama 14 hari dan diinfeksi KHV 0,1 ml. Perlakuan C : Pakan dengan penambahan ekstrak bawang putih (50 gram/kg pakan) selama 7 hari dan diinfeksi KHV 0,1 ml. 4

3 2.2 Parameter yang Diamati Parameter yang diamati adalah gejala klinis, respons makan selama pemeliharaan, tingkat kelangsungan hidup, gambaran darah dan suhu selama pemeliharaan. Gambaran darah diamati sebanyak 5 kali yaitu pada hari ke-22, 25, 27, 29 dan hari ke-32 pemeliharaan Kelangsungan Hidup Ikan Perhitungan jumlah ikan yang mati dilakukan pada awal infeksi KHV sampai akhir pemeliharaan. Tingkat kelangsungan hidup ikan dihitung dengan rumus : Keterangan : SR : Tingkat kelangsungan hidup % Nt : Jumlah ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No : Jumlah ikan yang hidup pada awal infeksi KHV (ekor) Respons Makan pada Ikan Respons makan pada ikan diukur secara visual dan dianalisis secara deskriptif. Pengamatan respons makan dilakukan setiap hari dari awal hingga akhir pemeliharaan Gejala Klinis Gejala klinis diamati secara visual setiap hari jika ada kelainan setelah diinfeksi KHV selama kurun waktu 10 hari Gambaran Darah Pengamatan gambaran darah ikan selama penelitian meliputi jumlah eritrosit, kadar hemoglobin, kadar hematokrit, jumlah leukosit, diferensial leukosit yang meliputi monosit, neutrofil, limfosit dan trombosit. Pasca infeksi virus, darah ikan diambil pada hari ke-22, 25, 27, 29 dan hari ke-32 pemeliharaan dengan tiga kali ulangan untuk setiap perlakuan. Darah ikan diambil melalui vena caudal menggunakan syringe. Sebelumnya syringe dan eppendorf dibilas dengan anti koagulan (Lampiran 1) terlebih dahulu. Ikan disuntik dari belakang anal ke arah tulang sampai menyentuh tulang vertebrae. Darah dihisap perlahan kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf (Svobodova, 1991). 5

4 Penghitungan Jumlah Eritrosit (Svobodova, 1991) Penghitungan jumlah eritrosit yaitu darah sampel dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 0,5, selanjutnya ditambah Larutan Hayem (Lampiran 1) sampai skala 101. Darah dalam pipet diaduk dengan cara menggoyangkan pipet membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Dua tetes pertama larutan darah dalam pipet tersebut dibuang, selanjutnya larutan darah tersebut diteteskan di atas haemocytometer yang telah diletakkan gelas penutup di atasnya. Jumlah sel darah merah dapat dihitung dengan bantuan mikroskop dengan pembesaran 400x. Perhitungan dilakukan pada 5 kotak besar haemocytometer dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib dan Pasaribu, 1989) (Lampiran 2) : Pengukuran Kadar Hemoglobin Pengukuran kadar hemoglobin yaitu dengan cara darah sampel dihisap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm 3 atau pada skala 0,2 ml. Lalu ujung pipet dibersihkan dengan kertas tisu. Darah dalam pipet dipindahkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai skala 10 (merah). Darah tersebut lalu diaduk dengan batang pengaduk selama 3-5 menit. Akuades ditambahkan ke dalam tabung sampai warna darah tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb-meter tersebut. Skala hemoglobin dapat dilihat pada skala jalur gr % (kuning) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah Pengukuran Kadar Hematokrit (Chinabut et al. 1991) Pengukuran kadar hematokrit yaitu dengan cara ujung tabung mikrohematokrit dicelupkan ke dalam tabung yang berisi darah. Darah diambil sebanyak ¾ bagian tabung. Ujung tabung yang telah berisi darah ditutup dengan crytoceal dengan cara menancapkan ujung tabung ke dalam crytoceal kira-kira sedalam 1 mm sehingga terbentuk sumbat crytoceal. Tabung mikrohematokrit tersebut disentrifuge selama 5 menit pada 5000 rpm dengan posisi tabung yang bervolume sama berhadapan agar putaran sentrifuse seimbang. 6

5 Panjang bagian darah yang mengendap dan panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung diukur dengan menggunakan penggaris (Lampiran 3). Kadar hematokrit merupakan banyaknya sel darah (digambarkan dengan padatan atau endapan) dalam cairan darah. Kadar hematokrit darah dapat dihitung dengan rumus : Penghitungan Jumlah Leukosit (Svobodova, 1991) Penghitungan jumlah leukosit yaitu darah sampel dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna putih sampai skala 0,5 kemudian ditambahkan Larutan Turk s (Lampiran 1) sampai skala 11. Darah dalam pipet diaduk dengan cara menggoyangkan pipet membentuk angka delapan selama 3-5 menit sehingga darah tercampur rata. Dua tetes pertama larutan darah dalam pipet tersebut dibuang, selanjutnya larutan darah tersebut diteteskan di atas haemocytometer yang telah diletakkan gelas penutup di atasnya. Jumlah sel darah merah dapat dihitung dengan bantuan mikroskop dengan pembesaran 400x. Perhitungan dilakukan pada 5 kotak besar haemocytometer dan jumlahnya dihitung dengan rumus (Nabib dan Pasaribu, 1989) (Lampiran 2): Pembuatan Preparat Ulas Darah (Svobodova, 1991) Jenis dan jumlah leukosit dihitung dengan cara membuat sediaan ulas darah. Pembuatan preparat ulas darah yaitu darah diteteskan pada gelas objek kemudian diratakan dan dikeringkan udara kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Selanjutnya dibilas dengan akuades, dikeringkan, dan diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu preparat ulas tersebut dibilas dengan akuades dan kembali dikeringkan. Diferensial leukosit (monosit, neutrofil, limfosit dan trombosit) dihitung sampai 100 sel leukosit, kemudian dihitung jumlah sel monosit, neutrofil, limfosit, dan trombosit. 7

6 Adapun cara perhitungan diferensial leukosit adalah sebagai berikut : 2.3 Analisis Data Penelitian yang dilakukan dirancang dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Data yang diperoleh adalah data kelangsungan hidup dan gambaran darah meliputi jumlah eritrosit, kadar hemoglobin, kadar hematokrit, jumlah leukosit, diferensial leukosit (monosit, neutrofil, limfosit, dan trombosit) ditampilkan dalam bentuk grafik kemudian dilakukan uji F menggunakan software SPSS ver.16 dengan uji lanjutan Duncan. Data gejala klinis, respons makan dan suhu dianalisis secara deskriptif. 8