BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 27 BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan September sampai Desember 2017 di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Program Studi Pendidikan Biologi, dan Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto Alat Alat yang digunakan dalam penelitian yaitu autoclave, bunsen, tabung reaksi, rak tabung reaksi, hot plate stirrer, magnetic stirrer, tabung erlenmeyer, beaker glass, botol alkohol 96%, sprayer alkohol 70%, bunsen, ose, Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, tip, mikropipet, batang drugalsky, blank disc, mortar, pestle, pisau, timbangan analitik, spatula, vortex, jangka sorong, dan inkubator Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian yaitu air kelapa dari buah yang masih muda. Sampel kelapa berupa jenis kelapa hijau, kelapa kuning, kelapa obat kuning, kelapa obat hijau. Sebagai kontrol digunakan larutan obat diare Lodia. Bahan lain yang digunakan adalah aquades steril, air bersih, sabun, alkohol 70%, spirtus, alumunium foil, plastik wrap, tissu, kultur Escherichia coli, kultur Salmonella typhi, kultur Shigella sp., medium Nutrien Broth (NB), medium Nutrien Agar (NA), dan aquades. 27

2 Rancangan Penelitian Metode yang digunakan pada penelitian adalah eksperimen. Rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah jenis bakteri yang digunakan, yaitu Escherichia coli, Salmonella typhii, dan Shigella sp. Faktor kedua adalah jenis kelapa, yaitu air kelapa hijau, air kelapa kuning, air kelapa obat hijau, dan air kelapa obat kuning. Selain itu digunakan juga kontrol positif mengggunakan obat diare Lodia dan kontrol negatif menggunakan aquades steril. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Pengujian dilakukan dengan metode Kirby Bauer (kertas cakram). Parameter yang diamati adalah diameter zona hambat di sekitar kertas cakram yang terbentuk. Pengukuran dilakukan menggunakan jangka sorong setelah 1 x 24 jam diinkubasi. Tabel hasil pengukuran diameter zona hambat ditunjukkan pada Tabel 3.1.

3 29 Tabel 3.1 Bentuk Tabel Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Diameter zona hambat (cm) Perlakuan Escherichia coli Salmonella typhii Shigella sp. U1 U2 U3 U1 U2 U3 U1 U2 U3 Air EH1 EH2 EH3 SaH1 SaH2 SaH3 ShH1 ShH2 ShH3 Kelapa EH1 EH2 EH3 SaH1 SaH2 SaH3 ShH1 ShH2 ShH3 Hijau EH1 EH2 EH3 SaH1 SaH2 SaH3 ShH1 ShH2 ShH3 Air EK1 EK2 EK3 SaK1 SaK2 SaK3 ShK1 ShK2 ShK3 Kelapa EK1 EK2 EK3 SaK1 SaK2 SaK3 ShK1 ShK2 ShK3 Kuning EK1 EK2 EK3 SaK1 SaK2 SaK3 ShK1 ShK2 ShK3 Air EOH1 EOH2 EOH3 SaOH1 SaOH2 SaOH3 ShOH1 ShOH2 ShOH3 Kelapa EOH1 EOH2 EOH3 SaOH1 SaOH2 SaOH3 ShOH1 ShOH2 ShOH3 Obat Hijau EOH1 EOH2 EOH3 SaOH1 SaOH2 SaOH3 ShOH1 ShOH2 ShOH3 Air EOK1 EOK2 EOK3 SaOK1 SaOK2 SaOK3 ShOK1 ShOK2 ShOK3 Kelapa Obat EOK1 EOK2 EOK3 SaOK1 SaOK2 SaOK3 ShOK1 ShOK2 ShOK3 Kuning EOK1 EOK2 EOK3 SaOK1 SaOK2 SaOK3 ShOK1 ShOK2 ShOK3 Obat Diare Lodia Aquades Steril EL1 EL2 EL3 SaL1 SaL2 SaL3 ShL1 ShL2 ShL3 EL1 EL2 EL3 SaL1 SaL2 SaL3 ShL1 ShL2 ShL3 EL1 EL2 EL3 SaL1 SaL2 SaL3 ShL1 ShL2 ShL Cara Kerja EA1 EA2 EA3 SaA1 SaA2 SaA3 ShA1 ShA2 ShA3 EA1 EA2 EA3 SaA1 SaA2 SaA3 ShA1 ShA2 ShA3 EA1 EA2 EA3 SaA1 SaA2 SaA3 ShA1 ShA2 ShA Sterilisasi alat Alat-alat yang digunakan seperti cawan petri dibungkus kertas, erlenmeyer di sumbat dengan kapas, dan tip dibungkus plastik. Alat-alat tersebut disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121ºC (250ºF), tekanan 2 atm (Aulanni am, 2012), selama 15 menit (Dhanti & Sastaviana, 2017) Pembuatan media pertumbuhan bakteri a. Pembuatan Nutrien Agar (NA) Melarutkan bubuk Nutrien Agar (NA) sebanyak 8 gram ke dalam aquades sebanyak 400 ml. Memanaskan larutan tersebut di atas hot plate stirrer. Menuangkan medium ke dalam tabung reaksi masingmasing sebanyak 12 ml. Menutup tabung reaksi menggunakan

4 30 alumunium foil dan plastik wrap Medium kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC (250ºF), tekanan 2 atm (Aulanni am, 2012), selama 15 menit (Dhanti & Sastaviana, 2017). b. Pembuatan Nutrien Broth (NB) Melarutkan bubuk Nutrien Broth (NB) sebanyak 0,8 gram ke dalam aquades sebanyak 100 ml. Memanaskan larutan tersebut kemudian di atas hot plate stirrer. Menuangkan medium ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 ml. Menutup tabung reaksi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap. Medium kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC (250ºF), tekanan 2 atm (Aulanni am, 2012), selama 15 menit (Dhanti & Sastaviana, 2017) Pembuatan aquades steril Memasukkan aquades sebanyak 50 ml ke dalam erlenmeyer 100 ml. Menutup tabung erlenmeyer menggunakan sumbat kapas. Aquades kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121ºC (250ºF), tekanan 2 atm (Aulanni am, 2012), selama 15 menit (Dhanti & Sastaviana, 2017) Peremajaan bakteri Peremajaan bakteri dilakukan dengan cara mengambil satu ose biakan murni bakteri Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Shigella sp., yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto, kemudian mencelupkan ose ke dalam medium NB. Kultur bakteri selanjutnya diinkubasi pada suhu 37ºC, selama 24 jam.

5 Pengambilan sampel air kelapa Mengupas kelapa pada bagian atasnya, kemudian membuka sedikit tempurungnya menggunakan pisau steril untuk mengeluarkan air kelapa tersebut. Menampung air kelapa dalam beaker glass steril, kemudian menuangkan ke dalam tabung reaksi steril lebih kurang 10 ml Pembuatan larutan obat diare Menumbuk tablet obat diare Lodia menggunakan mortar dan pestle. Menimbang sebanyak 0,1 gram. Serbuk obat kemudian dimasukkan ke dalam aquades steril 10 ml. Larutan divortex sampai homogen Uji efektifitas antimikroba dan pengukuran zona hambat a. Mencairkan medium NA pada tabung reaksi. b. Setelah cair, memindahkannya pada cawan petri dan menunggu hingga medium padat. c. Memasukkan masing-masing bakteri uji yang dikultur pada medium NB ke dalam medium NA pada cawan yang telah padat sebanyak 100 µl. Setiap satu jenis bakteri ada 6 cawan. Lalu meratakan bakteri dengan metode spread plate menggunakan batang Drugalski. d. Memasukkan 3 buah blank disc yang sudah ditetesi dengan air kelapa uji yang sama ke dalam setiap cawan berisi bakteri. Dilakukan juga untuk larutan obat Lodia dan aquades steril. e. Menutup tepian cawan dengan plastik wrap. f. Menginkubasinya dalam suhu 37ºC selama 24 jam.

6 32 g. Setelah 24 jam, mengamati zona hambat yang terbentuk. Lalu mengukur diameternya menggunakan jangka sorong. Jika zona hambat mempunyai bentuk yang tidak simetris, maka diukur bagian-bagian diameter yang representatif, kemudian hasil yang telah didapat dihitung rata-ratanya Penapisan fitokimia Alkaloid Mengambil larutan uji sebanyak 1 ml dan menuang ke dalam tabung reaksi, kemudian metambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf LP, jika terbentuk endapan jingga coklat, maka sampel dinyatakan positif mengandung alkaloid (Masitoh, 2011) Flavonoid Menguapkan 1 ml larutan uji dan menambahkan 2 ml etanol 95% dan 0,5 gram serbuk seng, kemudian metambahkan 2 ml HCl 2N, mendiamkan 1 menit. Setelah itu, menambahkan 10 tetes HCl pekat. Mengocoknya perlahan, kemudian mendiamkan 2 sampai 5 menit. Jika terbentuk warna merah, maka sample dinyatakan positif mengandung flavonoid (Masitoh, 2011) Tanin Memasukkan 5 ml larutan uji ke dalam tabung reaksi, kemudian menambahkan beberapa tetes FeCl 3 3%. Jika terbentuk warna hijau violet, maka sample dinyatakan positif mengandung tanin (Masitoh, 2011).

7 Saponin Uji Saponin dilakukan dengan metode Forth yaitu dengan cara memasukkan 2 ml sampel kedalam tabung reaksi kemudian menambahkan 10 ml akuades lalu mengocoknya selama 30 detik, Mengamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang mantap (tidak hilang selama 30 detik) maka identifikasi menunjukkan adanya saponin. Uji penegasan saponin dilakukan dengan menguapkan sampel sampai kering kemudian mencucinya dengan heksana sampai filtrat jernih. Menambahkan kloroform pada residu yang tertinggal, mengaduk 5 menit, kemudian menambahkan Na 2 SO 4 anhidrat dan menyaringnya. Filtrat dibagi menjadi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A sebagai blangko, menetesi filtrat B anhidrat asetat, mengaduk perlahan, kemudian menambahkan H 2 SO 4 pekat dan mengaduknya kembali. Jika terbentuknya cincin merah sampai coklat, maka menunjukkan adanya saponin (Marliana et al., 2005) Steroid Mengekstraksi empat gram ekstrak kasar dengan dietil eter dan fraksi yang larut dalam dietil eter dipisahkan. Menambahkan CH 3 COOH glasial dan H 2 SO 4 pekat pada fraksi yang larut dalam dietil eter. Mengocok larutan perlahan dan membiarkan selama beberapa menit. Jika terbentuk warna biru atau hijau, maka sample positif mengandung steroid, sedangkan jika sampel menunjukkan warna merah atau violet, maka sample positif mengandung triterpenoid (Atmoko, 2009).

8 Analisis Data Hasil dari pengujian antimikroba air kelapa muda terhadap bakteri Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Shigella sp. sebagai bakteri penyebab diare berupa diameter zona hambat. Data tersebut dianalisis menggunakan analisis varian (ANOVA) dengan uji F pada taraf kepercayaan 95%. Jika menunjukkan adanya perbedaan nyata maka dilanjutkan menggunakan uji lanjut Duncan Multiple Range (DMRT) pada taraf kepercayaan 95%.