Lampiran 1. Prosedur Isolasi dan Permurnian Bakteri

Transkripsi

1 64 Lampiran 1. Prosedur Isolasi dan Permurnian Bakteri Sampel dengan larutan NaCl Fisiologis 0,85% 1 ml 1 ml 9 ml Larutan NaCl 0,85 % 1 ml 9 ml Larutan NaCl 0,85 % 1 ml 9 ml Larutan NaCl 0,85 % 1 ml 9 ml Larutan NaCl 0,85 % 1 ml 9 ml Larutan NaCl 0,85 % 9 ml Larutan NaCl 0,85 % dari pengenceran yg ke 7 di ambil 1 ml Diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam Distreak pada media berdasarkan morfologi koloni lalu diinkubasi Hasil inkubasi selanjutnya siap untuk dilakukan proses pengamatan morfologi koloni

2 65 Lampiran 2. Prosedur Pewarnaan Gram Biakan Murni Dibuat preparat ulas pada kaca objek Difiksasi diatas api Diberi larutan kristasl ungu & biarkan 1 menit Dibilas dengan akuades dengan kaca objek dimiringkan Diberi larutan iodium & dibiarkan 1 menit Dibilas dengan akuades dengan kaca objek dimiringkan Dicuci dengan alkohol 95% tetes demi tetes 10 detik Dibilas lagi dengan akuades Diberi larutan Safranin & biarkan selama 1 menit Dibilas dengan akuades Preparat diamati di bawah mikroskop (Cappuccino dan Sherman, 1983:78)

3 66 Lampiran 3. Uji Biokimia a. Tes Katalase Kultur murni Digoreskan pada media agar miring tryptisase soy agar Diinkubasi selama 24 jam Diteteskan Hydrogen peroksida 3 % hingga membanjiri permukaan agar miring Diamati (Cappuccino dan Sherman, 1983:187)

4 67 b. Hidrolisis Gelatin Kultur murni Bakteri ditusukkan (stub inoculation) ke dalam media nutrient gelatin Diinkubasi pada suhu kamar jam Dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 30 menit pada suhu 40 C Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983:145)

5 68 c. Hidolisis Starch (Amilum) kultur murni Digoreskan pada media starch agar Diinkubasi pada suhu kamar jam Dituangkan iodine diatas medium hingga mengenai media & dibiarkan selama 30 detik Kelebihan iodine ditumpahkan Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983:134)

6 69 d. Tes Hydrogen Sulfide (H2S) Kultur murni Bakteri ditusukkan (stub inoculation) kedalam media SIM agar Diinkubasi pada suhu kamar jam Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983:169) e. Fermentasi Karbohidrat Kultur murni Brom timol blue lactose broth Brom timol blue dextrosa broth Brom timol blue sucrosa broth Diinkubasi selama 24 jam (Cappuccino dan Sherman, 1983:149)

7 70 f. Tes IMViC (produksi indol, tes Methyl Red, tes Voges-Proskauer, tes pemanfaatan sitrat) 1. Tes Indol Kultur murni Bakteri ditusukkan kedalam medium SIM agar Diinkubasi pada suhu kamar jam Diteteskan 10 tetes reagen Erlich ke dalam media yg ditumbuhi bakteri Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983:160)

8 71 2. Tes Methyl Red Kultur murni Diisolasi ke dalam medium MR-VP broth Diinkubasi selama jam DIteteskan 5 tetes methyl red indicator ke atas medium Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983: ) 3. Tes Voges-Proskauer Kultur murni Diisolasi ke dalam medium MR-VP broth Diinkubasi selama jam Diteteskan 10 tetes reagen barrit A Dikocok perlahan Diamati perubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983: )

9 72 4. Tes Pemanfaatan Sitrat Kultur murni Bakteri digoreskan diatas medium Simmons s agar Diinkubasi selama 24 jam Diamati peubahan yang terjadi (Cappuccino dan Sherman, 1983:163)

10 73 Lampiran 4. Foto Morfologi Koloni Bakteri Kode Koloni Morfologi Koloni (pada cawan) Morfologi Koloni (pada mikroskop) Isolat 1 Perbesaran : 20x Isolat 2 Perbesaran : 25x Isolat 3 Perbesaran : 15x

11 74 Isolat 4 Perbesaran : 15x Isolat 5 Perbesaran : 15x Isolat 6 Perbesaran : 20x

12 75 Isolat 7 Perbesaran : 15x Isolat 8 Perbesaran : 15x Isolat 9 Perbesaran : 15x

13 76 Lampiran 5. Foto Pewarnaan Gram Bakteri Kode Koloni Isolat 1 Pewarnaan Gram (Perbesaran 1000x) Keterangan Gram Positif (ungu) Bentuk Bakteri Basil (Batang) Isolat 2 Gram Positif (ungu) Basil (Batang) Isolat 3 Gram Positif (ungu) Basil (Batang)

14 77 Isolat 4 Gram Positif (ungu) Basil (Batang) Isolat 5 Gram Positif (ungu) Basil (Batang) Isolat 6 Gram Positif (ungu) Basil (Batang)

15 78 Isolat 7 Gram Positif (ungu) Basil (Batang) Isolat 8 Gram Positif (ungu) Basil (Batang) Isolat 9 Gram Positif (ungu) Basil (Batang)

16 79 Lampiran 6. Foto Uji Biokimia 1. Uji Karbohidrat Dekstrosa Keterangan : Reaksi negatif pada seluruh isolat (tidak terbentuknya gelembung gas). 2. Uji Karbohidrat Laktosa Keterangan : Reaksi positif pada isolat 1 (terbentuknya gelembung gas pada tabung durham). Reaksi negatif pada isolat 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan isolat 9 (tidak terbentuknya gelembung gas).

17 80 3. Uji Karbohidrat Sukrosa Keterangan : Reaksi positif pada isolat 1 dan 9 (terbentuknya gelembung gas pada tabung durham). Reaksi negatif pada isolat 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan isolat 8 (tidak terbentuknya gelembung gas). 4. Uji Katalase Keterangan : Reaksi positif pada seluruh isolat (terbentuk gelembung udara di permukaan media setelah ditetesi H2O2).

18 5. Uji Hidrolisis Gelatin Keterangan : Reaksi negatif pada seluruh isolat (media gelatin membeku). 6. Uji Amilum 81

19 82 Keterangan : Reaksi positif pada isolat 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan isolat 9 (terbentuk zona bening disekitar inokulasi bakteri). Reaksi negatif pada isolat 1 (tidak terbentuk zona bening disekitar inokulasi bakteri). 7. Uji Hidrogen Sulfida Keterangan : Reaksi negatif pada seluruh isolat (tidak terbentuk endapan hitam pada media.

20 83 8. Produksi Indol Keterangan : Reaksi negatif pada seluruh isolat (tidak terbentuk lapisan merah muda di permukaan media). 9. Uji Methyl Red (MR) Keterangan : Reaksi positif pada isolat 1 (media berubah warna merah muda). Reaksi negatif pada isolat 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 (media tidak berubah warna menjadi merah muda).

21 Uji Voges-Proskauer (VP) Keterangan : Reaksi positif pada isolat 7 (terbentuk lapisan merah muda pada media). Reaksi negatif pada isolat 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, dan isolat 9 (tidak terbentuk lapisan merah muda pada media). 11. Pemanfaatan Sitrat (SC) Keterangan : Reaksi positif pada seluruh isolat (media berubah warna dari hijau menjadi biru)

22 85 Lampiran 7. Foto Pengambilan Sampel Pakaian Bekas Impor dan Dokumentasi Penelitian 1. Foto Pengambilan Sampel Suasana saat pengambilan sampel pakaian bekas di Pasar Angso Duo Kota Jambi

23 2. Foto Dokumentasi Penelitian Pembuatan Media dan Sterilisasi Alat dan Bahan Menggunakan Autoklaf Penanganan Sampel saat di bawa ke Laboratorium FKIP Biologi UNJA 86

24 87 Proses isolasi dan pemurnian bakteri dengan melakukan pengenceran pada sampel Pembuatan Reagen Melakukan pewarnaan gram bakteri

25 88 Lampiran 8. Skema Cara Kerja dan Identifikasi Bakteri 1. Cara Kerja I. Di Lapangan II. Di Laboratorium Pengambilan Sampel Pembuatan Media Pertumbuhan Bakteri Sampel Air Sterilisasi Alat dan Bahan Pengenceran dari 10-1 hingga 10-7 Plating pada media NA di cawan petri Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Data Morfologi koloni Bakteri Isolasi dan Pemurnian Bakteri Pembiakan murni pada media NA miring Pewarnaan Gram Bakteri Uji Fisiologis Bakteri Hidrolisis Amilum Hidrolisis Gelatin Fermentasi Karbohidrat Produksi H2S Data Pewarnaan Gram Bakteri Data Uji Fisiologis Bakteri Reaksi Katalase Uji IMVIC

26 89 Data Uji Fisiologis Bakteri Uji Fisiologis Bakteri Hidrolisis Amilum Hidrolisis Gelatin Fermentasi Karbohidrat Dekstrosa Positif : Adanya zona bening disekitar inokulasi bakteri Positif : Media tetap cair setelah dari lemari pendingin Positif : Adanya gas didalam tabung durham setelah dilakukan inkubasi Laktosa Positif : Adanya gas didalam tabung durham setelah dilakukan inkubasi Produksi H2S Reaksi Katalase Indol Sukrosa Positif : Adanya gas didalam tabung durham setelah dilakukan inkubasi Uji IMVIC Positif : Jika terbentuk endapan hitam pada media Positif : Jika terbentuk gelembung udara setelah diteteskan H2O2 3% Positif : Terbentuk lapisan merah setelah ditetesi reagen erlich Methyl Red Positif : Media berubah menjadi merah setelah ditetesi metilen merah VogesProskauer Positif : Media berubah menjadi merah muda Pemanfaatan Sitrat Positif : Media berubah menjadi biru

27 90 2. Identifikasi Bakteri Data Morfologi Koloni Bakteri Data Pewarnaan Gram Bakteri Data Uji Fisiologis Bakteri Data untuk Pengidentifikasian Bakteri Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Referensi-referensi lain Identifikasi Bakteri Berdasarkan pewarnaan gram Berdasarkan morfologi koloni bakteri Berdasarkan uji fisiologis bakteri Genus Bakteri

28 Lampiran 9. Surat Izin Penelitian 91

29 92 Lampiran 10. Materi Praktikum Mata Kuliah Mikrobiologi Judul Praktikum : Identifikasi Bakteri Tujuan Praktikum : Untuk mengetahui/ menentukan genus bakteri yang belum diketahui melalui pengamatan secara mikroskopis maupun fisiologis. Alat dan Bahan : 1. Alat 2. Bahan Materi : tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, pipet tetes, autoklaf, erlenmeyer, jarum ose, inkubator, mikroskop binokuler, mikroskop stereo, objek glass, cover glass, tabung durham, kompor listrik, inkas, lemari pendingin, bunsen, kawat kasa dan kamera. : suspensi/ sampel amatan, aquadest, tisu, kapas, kertas label, Nutrien Agar, Strach Agar, Nutrien Gelatin, SIM Agar, MRVP Broth, Simmons Citrate Agar, Trypticase Soy Agar, Brom Timol Blue Lactose Broth, Brom Timol Blue Dekstrosa Broth, Brom timol Blue Sukrosa Broth, Alkohol 95%, larutan NaCl 0,85%, larutan crystal violet, larutan safranin, Iodium, reagen barrit A dan B, reagen erlich, hidrogen peroksida, methyl red, spiritus, korek api, dan aluminium foil. : Nama bakteri berasal dari kata bakterion (bahasa Yunani) yang berarti tongkat atau batang. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebutkan sekelompok organisme yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta memiliki ukuran yang kecil sehingga hanya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop (Dwidjoseputro, 2010 : 22). Karakteristik umum dari sel bakteri adalah dilihat dari ukuran, bentuk, dan struktur. Sel bakteri dapat berbentuk seperti bulat (coccus), batang (bacillus), dan spiral. Sel bakteri yang berbentuk bulat atau elips dinamakan coccus. Sel bakteri yang berbentuk batang atau silindris dinamakan bacillus dan ada yang membentuk rantai. Sedangkan, bakteri spiral, atau spirilium biasanya ditemui sebagai individu sel yang tidak saling berlekatan, misalnya spiroseta, diantaranya menyebabkan penyakit berbahaya pada manusia. Beberapa contoh, spirilium berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat yang lain sangat panjang dan menunjukkan sederetan pelintiran dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap disebut bakteri koma atau vibrio (Pelczar dan Chan, 1987 : 101). Pengamatan bakteri dapat dilakukan secara individual, maupun berkelompok dalam bentuk koloni. Apabila bakteri dikultivasi dalam medium yang tidak cair,

30 93 maka terbentuklah suatu kelompok bakteri yang biasa disebut koloni. Bentuk-bentuk koloni beragam dari setiap spesies, bentuk itulah yang merupakan suatu ciri khas dari spesies tertentu. Besar kecilnya koloni, mengkilat tidaknya, halus kasarnya permukaan dan warna koloni merupakan sifat yang diperlukan dalam menentukan identifikasi suatu spesies. Warna bakteri akan tampak, jika bakteri diamati dalam kelompok. Kebanyakan, bakteri mempunyai warna yang keputih-putihan, abu-abu, kekuning-kuningan atau hampir bening, dll. Ada beberapa spesies yang memerlukan fosfat, dan ada spesies yang memerlukan sulfat guna menimbulkan pigmentasi (Dwidjoseputro,2010 : 34). Pengamatan bakteri dengan pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk dalam bakteri garam positif atau gram negatif. Pewarnaan ini dilakukan dengan cara koloni bakteri yang diperoleh dibuat dipreparat ulas kemudian difiksasi, lalu ditetesi denan larutan kristal violet, dibiarkan 1 menit. Setelah itu, kaca objek dimiringkan guna untuk membuang zat warna ungu berlebih, lalu dibilas dengan aquades dengan cara dialirkan dari botol semprot. Selanjutnya, diberi larutan iodium dan dibiarkan selama 1 menit, lalu kaca objek dimiringkan untuk membuang larutan iodium yang berlebih dan bilas dengan aquades. Kemudian, dicuci dengan alkohol 95 % dengan cara ditetesi selama 10 detik sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi. Dicuci dengan aquades lalu beri pewarna safranin selama 1 menit, lalu kaca objek untuk membuang pewarna safranin berlebih, dan dibilas dengan aquades. Setelah itu, diamati dengan menggunakan mikroskop. Uji Biokimia Tes katalase Hidrolisis gelatin Hidrolisis starch (amilum) Reaksi Biokimia Positif Negatif Terbentuk buih atau Tidak terbentuk buih atau gelembung pada medium gelembung Medium mencair Medium membeku Terbentuk zona bening mengelilingi bakteri Tes Hidrogen sulfide (H2S) Terbentuk warna hitam pada tusukan di medium Fermentasi Karbohidrat Terdapat gelembung gas pada tabung durham dan berwarna keruh Tes Indol Tebentuk lapisan merah Tes methyl red Tes Voges-Proskauer Tes pemanfaatan sitrat Tidak terbentuk zona bening mengelilingi bakteri Tidak terbentuk warna hitam pada tusukan di medium Tidak terdapat gelembung gas pada tabung durham Tidak terbentuk lapisan merah Tebentuk lapisan merah Tidak terbentuk lapisan merah Tebentuk lapisan merah Tidak terbentuk lapisan pada medium merah pada medium Warna medium berubah Warna medium tetap hijau menjadi biru

31 94 Prosedur Kerja 1. Proses Pengambilan Data Pembuatan Media Pertumbuhan Bakteri dan Media Uji Biokimia Bakteri Sterilisasi Alat dan Bahan Suspensi dari sampel amatan Pengenceran dari 10-1 hingga 10-7 Plating pada Media NA di cawan petri Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Data Morfologi Koloni Bakteri Isolasi dan Pemurnian Bakteri Pembiakan Murni pada Media NA miring Hidrolisis Amilum Hidrolisis Gelatin Pewarnaan Gram Bakteri Data Pewarnaan Gram Bakteri Uji Biokimia/ Fisiologis Bakteri Data Uji Biokimia/ Fisiologis Bakteri Fermentasi Karbohidrat Dektrosa Laktosa Sukrosa Produksi H2S Reaksi Katalase Uji IMVIC Indol Methyl red Voges-Proskauer Kegunaan Sitrat

32 95 2. Identifikasi Bakteri Data Morfologi Koloni Bakteri Data Pewarnaan Gram Bakteri Data Uji Biokimia/ Fisiologis Bakteri Data untuk Pengidentifikasian Bakteri Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Referensi-referensi lain Identifikasi Bakteri Berdasarkan Pewarnaan Gram Berdasarkan Morfologi Koloni Bakteri Berdasarkan Uji Biokimia/ Fisiologis Bakteri Genus Bakteri