TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER DAN EKSTRAK METANOL- AIR DARI HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) TERHADAP Artemia salina Leach

Transkripsi

1 TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER DAN EKSTRAK METANOL- AIR DARI HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) TERHADAP Artemia salina Leach SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh: Maria Rosa Irma Budi Cahyani NIM : FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

2 TOKSDTAS AKUT EKSTRAK DIETII, ETER DAII EKSTRAK METAIiOL AIR DARI mraa PDGAGAN E,MIIJN dmt4tp nnalntl\ lebeltdal A.tznl, talltu la.n Yeg dt:ajutea ol! : Mada Ros lr6a Budi Cdhyei NlM i YolEB Dwialu4a lvlsi Td98E1...,.,,

3 Psg6.l& strip6i Berjtdul ToKSIST/\S ATUT f,kstrai( DIETIL EITR DAN EKSITAK MDTANOI. ArR DARI EEnAA PEGAGAN ttmhatod.,l&l, TLSADAP -rrraiia Iach OI h: Mdir Ro$ Im Budi c.ltdi NIM 03El DiFtutatar di h!d4.n rditi! Penglji skip6i Uliv Eitar SMta Dh.m! Pad! tanggd l5 Agushts 2007 Yohr! s Dwidirla M.Si L Yot aesdwiarn t4 M.si.,w" 4\ 2. Chrisrim P.launi M.Si., Apt lp.ng DjtdErto, S.Si, Apt

4 iv Belajarlah pada-ku Karna Aku lembut dan rendah hati Dan jiwa-ku akan diam dalam damai abadi Kupersembahkan karya sederhana ini untuk: Tuhan Yang Maha Esa yang selalu memberkati kehidupanku Bapak, Ibu dan Kakakku yang senantiasa mendoakan dan mendukungku Frederikus Adi Prasetyo yang selalu menyiramiku dengan cinta kasih Serta almamaterku

5 TXf,NTATAAN I<EASI-IAN T(ARIA S!y. menyltata d6ngd sadeguhn bahw skipsi ydg sy. tulis ti.lal neiet t&ya a&! b{gim oarg bia t cuali }ug telrh diebutt! dabn tft'p.! do dan. post kr" sebaeri@ bylkirya kary. itdiab. Mnir Rosa Ima Bldi Crb@i

6 vi PRAKATA Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat-nya yang berlimpah kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER dan EKSTRAK METANOL-AIR dari HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) terhadap Artemia salina Leach, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Keberhasilan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan berbagai pihak, baik berupa moril, materiil maupun spirituil. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku pembimbing dan dosen penguji. Terima kasih atas bimbingan, masukan, waktu dan perhatiannya selama penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini. 4. Bapak Ipang Djunarko, S.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi ini.

7 vii 5. Bapak, Ibu, kakakku Indah, beserta keluarga FX. Sulistyono, S.Pd., MM yang telah memberikan dukungan baik material maupun spiritual. 6. Frederikus Adi Prasetyo, atas segala cinta dan semangat yang mampu membuatku bertahan dalam menyelesaikan skripsi ini. 7. Alm. Damianus Bramantyo Idaman, semoga kau berbahagia di sisi-nya. Terima kasih atas segala kebersamaan yang pernah terjalin walau hanya sebentar, namun akan selalu terkenang. 8. Devi, Komank, Titien, Ratna, Anien, terima kasih atas persahabatan dan kebersamaan dalam suka maupun duka. 9. Mbak Sinta, Lia, Mbak Dika, Mas Wondo, Apri, Novi, Hartono, kkn_merry dan kkn_iin terima kasih kerjasama, bantuan dan dukungannya. 10. Karyawan dan laboran Laboratorium (Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andre, Mas Parlan, Mas Kunto dan Pak Mukmin) yang telah banyak membantu selama penelitian ini. 11. Semua angkatan 03 terlebih kelas B dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini. Semoga Tuhan senanatiasa melimpahkan berkat dan Rahmat-Nya atas segala kebaikan dan ketulusan yang telah diberikan.

8 viii Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi penyempurnaan skripsi ini. Akhirnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu dan berbagai pihak. Yogyakarta, Penyusun

9 ix DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... ii HALAMAN PENGESAHAN... iii HALAMAN PERSEMBAHAN... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... v PRAKATA... vi DAFTAR ISI... ix DAFTAR TABEL... xiii DAFTAR GAMBAR... xiv INTISARI... ABSTRACT... xv xvi BAB I. PENGANTAR... 1 A. Latar Belakang Perumusan masalah Keaslian penelitian Manfaat penelitian B. Tujuan Penelitian BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA A. Pegagan Embun Keterangan botani

10 x 2. Nama lokal Uraian tanaman Kandungan kimia... 6 B. Artemia salina Leach Keterangan zoologi Morfologi Lingkungan hidup Perkembangan dan siklus hidup Metode BST C. Apoptosis D. Penyarian E. Senyawa yang Diidentifikasi Terpenoid Flavonoid F. Kromatografi Lapis Tipis G. Keterangan Empiris BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel penelitian Definisi operasional C. Bahan dan Alat Penelitian... 23

11 xi 1. Bahan penelitian Alat Penelitian D. Tatacara Penelitian Determinasi herba pegagan embun Pengumpulan bahan Pembuatan simplisia Penyarian Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) Penetasan telur Pembuatan larutan uji Uji toksisitas akut dengan metode BST Uji KLT ekstrak aktif pegagan embun Analisis hasil BAB IV. HASIL PENELITIAN dan PEMBAHASAN A. Identifikasi Tanaman B. Pengumpulan Bahan C. Pembuatan Simplisia D. Penyarian Herba Pegagan Embun Menggunakan Pelarut Dietil Eter dan Metanol E. Air Laut Buatan (ALB) E. Penetasan Siste F. Toksisitas Akut dengan Metode BST... 39

12 xii G. Uji Kualitatif Ekstrak aktif dengan KLT BAB V. KESIMPULAN dan SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN BIOGRAFI PENULIS

13 xiii DAFTAR TABEL Tabel I. Kriteria ketoksikan akut Tabel II. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak Dietil eter herba pegagan embun Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak metanol-air herba pegagan embun Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan terpenoid dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun... 53

14 xiv DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa... 7 Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual... 9 Gambar 3. Siklus sel Gambar 4. Bagan mekanisme terjadinya apoptosis Gambar 5. Mekanisme monoterpenoid menginduksi apoptosis Gambar 6. Mekanisme flavonoid menginduksi apoptosis Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak metanol-air herba pegagan embun Gambar 9. Reaksi vanilin asam sulfat untuk pemeriksaan senyawa terpenoid Gambar 10. Reaksi dengan uap amonia untuk pemeriksaan senyawa flavonoid... 54

15 xv INTISARI Penyakit kanker merupakan salah satu ancaman yang utama terhadap kesehatan. Kanker termasuk urutan kelima terbanyak sebagai penyebab kematian. Sedangkan sediaan antikanker hingga saat ini sangat terbatas, oleh karena itu perlu dilakukan pencarian terhadap senyawa-senyawa antikanker yang baru. Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) diduga mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai antikanker namun sampai saat ini belum ada penelitian mengenai hal ini. Untuk mengetahui aktivitas herba pegagan embun sebagai obat antikanker maka dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethalithy Test (BST), yang dinyatakan dengan harga Median Lethal Concentration 50 (LC 50 ). Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan penelitian Posttest Only Control Group Design. Penelitian dilakukan dengan menggunakan ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun. Ekstrak diperoleh dengan metode perkolasi. Sampel uji dibuat seri konsentrasi 125, 250, 500, 1000, dan 2000 µg/ml. Kontrol menggunakan air laut buatan, replikasi dilakukan 5 kali. Jumlah larva Artemia salina Leach yang mati pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC 50 dihitung dengan analisis probit. Ekstrak dikatakan toksik apabila harga LC µg/ml. Dari ekstrak yang paling toksik ( paling aktif ) dilakukan identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalamnya. Hasil penelitian menunjukkan harga LC 50 ekstrak metanol-air sebesar 769 µg/ml dan ekstrak dietil eter 229 µg/ml, sehingga ekstrak dietil eter lebih toksik dibandingkan ekstrak metanol-air. Identifikasi kandungan golongan senyawa dengan KLT menunjukkan bahwa ekstrak dietil eter mengandung flavonoid dan terpenoid. Kata kunci : Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.), BST, Artemia, LC 50, KLT, flavonoid, terpenoid.

16 xvi ABSTRACT Cancer disease is one of the main threats for health. Cancer is included in the four biggest deathly causes. Meanwhile, the dosage of anti cancer is very limited nowadays, therefore it is necessary to find out some new anti cancer compounds. Pagagan embun herbs (Hydrcotyle sibthorpiodes Lmk.) is considered contains merit compounds as the anti cancer, but there is no research about it until now. For knowing the activity of Pegagan embun herbs as anti cancer medicine, it needs to do a preliminary examination using Brine Shrimp Lethality Test (BST) method, which is presented with the value Median Lethal Concentration 50 (LC50). This research is pure experimental with Posttest Only Control Group Design as the research design. This research is elaborated using water methanol extract and pegagan herbs diethyl ether extract. The extracts are gained through percolation method. Concentration serials of examination sample made are 125, 250, 500, 1000, and 2000 µg/ml. Control for the research used is artificial sea water and the replication is made 5 times. Number of Artemia salina larva Leach that dies in every concentration is counted after 24 hours of treatment. LC50 is counted using probit analysis. Extract is said to be toxic if the rate of LC µg/ml. From the most toxic extract (most active) is being identified using thin layer chromatography (TLC) to know the compounds type contained in it. The result of the research shows the LC 50 rate of water methanol extract as mush as 769 µg/ml and diethyl ether extract as much as 229 µg/ml, so that diethyl ether extract is more toxic than water methanol extract. The identification of compounds type using TLC shows that diethyl ether extract contains flavonoid and terpenoid. Keywords: Pegagan embun herbs (Hydrocotyle sibthorpodes Lmk), BST, Artemia, LC50, TLC, flavonoida, terpenoid.

17 1 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri atau gangguan atau kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme multiseluler dan bersifat metastatis (Tanu, 1998). Sampai saat ini penyakit kanker masih menjadi salah satu penyakit yang ditakuti masyarakat. Menurut Siswandono dan Soekardjo (2000) sampai saat ini masih sedikit sekali obat antikanker yang bekerja secara selektif untuk pengobatan jenis kanker tertentu. Berbagai usaha penganggulangan terhadap penyakit ini telah dilakukan namun hasil yang didapat belum maksimal, seperti pembedahan, terapi radiasi dan kemoterapi. Cara lain yang dipilih sebagian masyarakat adalah dengan memanfaatkan bahan alam. Salah satu penelitiannya dilakukan terhadap herba pegagan embun. Herba pegagan embun diduga mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai antikanker (Anonim, 2002). Herba pegagan embun mengandung beberapa senyawa antara lain terpenoid minyak atsiri (trans-β-farnesene, β-pinene, α- pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan ocimene yang keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan flavonoid. Aktivitas sitotoksik herba pegagan embun disebabkan karena adanya kandungan senyawa terpenoid (khususnya monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan flavonoid yang mampu menginduksi terjadinya apoptosis. Apoptosis adalah

18 2 program kematian sel. Terpenoid menginduksi apoptosis melalui jalur Fas/Fas ligand (Rajesh, Rachele, Stenzel and Howard, 2003) dan flavonoid menginduksi apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter, 2002). Kelarutan senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid sangat besar dalam pelarut dietil eter (Harborne, 1987), sedangkan flavonoid sangat larut dalam metanol dan air. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun. Skrining aktivitas sitotoksik dari ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva Artemia salina L. dengan penentuan nilai LC 50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols, and McLaughlin, 1982). Suatu senyawa dikatakan mempunyai potensi toksik jika nilai LC 50 < 1000 μg/ml. Keberadaan senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid serta flavonoid di dalam ekstrak toksik herba pegagan embun dipastikan melalui profil Kromatografi Lapis Tipis. 1. Perumusan masalah a. Apakah ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun mempunyai potensi toksik terhadap larva artemia? b. Ekstrak manakah yang mempunyai potensi toksik lebih tinggi terhadap larva artemia? c. Golongan senyawa apakah yang terkandung dalam ekstrak toksik herba pegagan embun?

19 3 2. Keaslian penelitian Penelitian yang pernah dilakukan terhadap herba pegagan embun adalah isolasi dan identifikasi beberapa senyawa seperti monoterpenoid, sesquiterpenoid, fenol dan minyak atsiri menggunakan metode Gas Liquid Chromatography (GLC) oleh Anonim (2002). Telah diketahui bahwa kandungan dari herba pegagan embun berkhasiat sebagai antitumor (Anonim, 2002). Tetapi sejauh penelusuran pustaka, belum pernah dilakukan penelitian mengenai toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun terhadap larva artemia. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan memberikan informasi yang berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi mengenai seberapa besar aktivitas ketoksikan dari ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dengan metode BST. b. Manfaat praktis Ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dapat digunakan sebagai bahan dalam skrining awal terhadap senyawa yang berpotensi sebagai antikanker dengan metode BST.

20 4 B. Tujuan Penelitian 1. Menetapkan nilai LC 50 ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun. 2. Mengetahui ekstrak mana yang mempunyai efek toksik lebih tinggi terhadap larva artemia. 3. Mengetahui golongan senyawa yang terkandung pada ekstrak toksik herba pegagan embun melalui profil kromatografi lapis tipis.

21 5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Pegagan Embun 1. Keterangan botani Pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) mempunyai sinonim Hydrocotyle rotundifolia, Roxb. dan Hydrocotyle formosana Masamune yang termasuk dalam familia Umbelliferae (Apiaceae) (Anonim, 2002). 2. Nama lokal Pegagan embun, antanan beurit, antanan lembut (Sunda); Andem, katepa n, rending, semanggi (Jawa); Salatun: take cena (Madura), tikim, patikim; Tian husui (Cina) (Anonim, 2002). 3. Uraian tanaman Pegagan embun merupakan tanaman yang tumbuh merayap dengan ramping, dapat tumbuh subur di tempat yang lembab, terbuka maupun teduh, di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan di tempat lain sampai setinggi kira-kira m dari permukaan laut. Tanaman pegagan embun mempunyai batang yang lunak dan berongga dengan panjang 45 cm/lebih, berdaun tunggal berseling, mempunyai tangkai panjang berbentuk bulat atau reniform dengan pinggir terbagi menjadi 5-7 lekukan dangkal, serta berwarna hijau. Bunga tanaman pegagan embun merupakan bunga majemuk berbentuk bongkol yang keluar dari ketiak daun dan berwarna kuning (Anonim,2002).

22 6 4. Kandungan kimia Herba pegagan embun yang berkhasiat untuk mengobati tumor, reumatik, infeksi saluran nafas, gangguan pencernaan, dan masalah kulit mempunyai kandungan kimiawi yang antara lain terdiri dari: terpenoid minyak atsiri (trans-βfarnesene, β-pinene, α-pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan ocimene yang keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan flavonoid (quersetin 3-galaktosid) (Anonim, 2002). B. Artemia salina Leach 1. Keterangan zoologi Artemia (Artemia salina Leach) yang digunakan dalam penelitian ini termasuk dalam familia Artemidae (Oemarjati dan Wardhana, 1990). 1. Morfologi a. Telur Istilah untuk telur artemia yang benar adalah siste, yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian, diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan mempermudah penguapan, sehingga ia sangat tahan terhadap keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989). b. Burayak Apabila telur-telur artemia direndam dalam air laut yang bersuhu 25ºC, akan menetas dalam waktu jam. Dari dalam cangkang keluar beruyak

23 7 (larva) yang dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis) setelah itu berubah menjadi artemia dewasa. c. Artemia dewasa Bentuk artemia dewasa lebih sempurna, dengan ukuran panjang sekitar 1 cm dan beratnya 10 mg. Bentuk artemia dewasa menyerupai udang kecil, bagian kepala berukuran lebih besar kemudian mengecil pada bagian ekor. Panjang ekor kurang lebih sepertiga dari total panjang tubuh. Dibagian kepala terdapat sepasang mata dan sepasang antenula (sungut). Pada bagian tubuh terdapat sebelas pasang kaki atau secara khusus disebut torakopoda, antara ekor dan pasangan kaki belakang terdapat sepasang alat kelamin, penis pada jantan dan ovarium pada betina (Mudjiman, 1989). Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa (Mudjiman, 1989) 3. Lingkungan hidup

24 8 Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6ºC atau lebih dari 35ºC. Akan tetapi, hal ini sangat jelas tergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidup mereka. Suhu yang baik untuk pertumbuhan artemia berkisar antara 25-30º C. Telur artemia yang kering akan bertahan pada suhu -273ºC dan 100ºC. Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air ternyata juga sangat tinggi. Untuk perkembangan artemia yang baik, mereka membutuhkan kadar garam yang tinggi. Sebab pada kadar garam yang tinggi dapat terhindar dari musuh-musuh yang tidak dapat hidup pada kadar garam yang tinggi. Sedangkan untuk pertumbuhan telur (siste) dibutuhkan kadar garam yang lebih rendah daripada batas tertentu. Batas ini berlainan untuk setiap jenis artemia (Mudjiman, 1989). Agar artemia dapat hidup lebih baik, kadar oksigen terlarutnya harus mendekati titik kejenuhan, yaitu sekitar 3 ppm (bagian per juta). Terhadap perubahan-perubahan kadar oksigen terlarut ini, sebenarnya artemia sangat pandai menyesuaikan diri. Pada kadar oksigen yang hanya 1 ppm, artemia masih juga dapat bertahan. Sebaliknya, merekapun dapat hidup pada kejenuhan oksigen lebih dari 1,5 x 10 6 ppm (Mudjiman, 1989). Pengaruh ph terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh terhadap penetasan telur. Apabila ph untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasan akan menurun. Siste banyak yang tidak menetas atau waktu penetasannya menjadi lebih panjang (Mudjiman,1989). 4. Perkembangan dan siklus hidup

25 9 Ditinjau dari segi cara berkembang biaknya, ada dua jenis artemia yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenetik. Jenis biseksual tidak dapat berkembang biak secara parthenogenesis, dan sebaliknya jenis partenogenetik tidak dapat berkembang biak secara biseksual (Mudjiman, 1989). Pada perkembangbiakan biseksual maupun parthenogenesis dapat terjadi secara ovovivipar maupun ovipar. Cara ovovivipar yang keluar dari induknya sudah berupa burayak atau larva (nauplis), sedangkan cara ovipar yang keluar dari induknya berupa telur bercangkang. Sebutan yang tepat untuk telur ini yaitu siste karena berisi embrio. Apabila telur artemia berada dalam lingkungan yang sesuai misalnya kadar garam, suhu, dan ph yang sesuai maka telur dapat memetas menjadi nauplis dalam waktu 14 hari menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989). Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual (Mudjiman, 1989) 5. Metode BST

26 10 a. Penggunaan artemia pada metode BST Artemia digunakan sebagai hewan coba dalam praskrining aktivitas antikanker di National Cancer Institute (NCI), Amerika Serikat. Metode ini sering digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa aktif yang terdapat di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak memerlukan kondisi aseptis), dan dapat dipercaya. Metode BST juga memiliki kekurangan karena artemia tidak mampu mendeteksi senyawa yang dalam aktivitas fisiologinya memerlukan aktivasi di dalam tubuh mamalia seperti 6-merkaptopurin dan siklofosfamida (Meyer et al., 1982). Meskipun pengujian ini tidak dapat mendeteksi senyawa yang dibutuhkan untuk aktivasi metabolik pada mamalia, tetapi uji BST ini dapat dipercaya sebagai detektor aktivitas biologik (Solis, Wright, Gupta, and Phillipson 1992). Uji larva udang ini juga dapat digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji ini sering sekali mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor (Anderson, Goets, and Mc Laughin, 1991). Penggunaan larva artemia memang tidak spesifik untuk antitumor, namun dapat menunjukkan kemampuannya untuk memonitor kemungkinan adanya efek toksik secara lebih cepat dibandingkan dengan prosedur pengujian sitotoksitas menggunakan biakan sel kanker (Meyer et al., 1982). Kemampuan artemia untuk mendeteksi efek sitotoksik sangat dimungkinkan karena artemia mempunyai kesamaan sistem enzim dengan sistem enzim pada mamalia, yaitu tipe DNA-dependent RNA polymerase dan oubaine

27 11 sensitive Na + dan K + dependent ATPase (Solis et al., 1993), sehingga senyawa maupun ekstrak yang mempunyai aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi. DNA-dependent RNA polymerase merupakan sistem enzim yang berperan dalam sistesis protein (polinukleotida). RNA polymerase akan berikatan dengan DNA pada tahap transkripsi di dalam nukleus. Dalam hal ini DNA berperan sebagai cetakan dalam pembuatan nukleotida RNA yang baru. RNA, khususnya RNA messenger (mrna) inilah yang membawa pesan genetik, yang kemudian akan diterjemahkan RNA translasi (trna) dalam proses sintesis protein (Campbell, Recee, and Mitchell, 2002). Na + -K + ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh manusia. Na + -K + ATPase mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi ADP serta menggunakan tenaga untuk menggerakkan 3 Na + keluar dari sel dalam pertukaran bagi tiap 2 K + yang digerakkan ke dalam sel bagi tiap mol ATP yang dihidrolisis. Ouabain merupakan penghambat Na + -K + ATPase yang paling aktif, di mana tempatnya berikatan yaitu pada subunit terkecil dari suatu kompleks enzim dan letaknya tak jauh dari tempat berikatannya ATP. Suatu penghambat (inhibitor) dalam darah manusia akan bersaing dengan ikatan ouabain dan memungkinkan mengontrol transport Na + -K +. Na + -K + ATPase secara tidak langsung mempengaruhi transport Ca 2+ di dalam jantung. Jika kerja Na + -K + ATPase dihambat oleh ouabain maka Ca 2+ akan meningkat, keadaan ini sangat bermanfaat dalam terapi payah jantung karena akan memudahkan kontraksi otot jantung. Pada hewan, pemeliharaan tekanan dan volume sel yang normal tergantung atas pompa Na + dan K +. Tanpa pompa ini, Cl - dan Na + akan memasuki sel menuruni perbedaan konsentrasinya, serta air akan

28 12 mengikuti sepanjang perbedaan osmotik yang diciptakan sehingga sel membengkak (Ganong, 1995). Sel yang membengkak selanjutnya dapat mengalami lisis sehingga sel tersebut mati. Artemia dinilai sukup akurat mewakili model sel kanker, hal ini telah dibuktikan oleh Meyer (1982) lewat penelitiannya. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa suatu ekstrak yang berpotensi toksik dan bersifat sitotoksik, ketika diujikan pada artemia juga memberikan hasil yang sama. b. Parameter toksisitas Toksisitas merupakan suatu istilah relatif yang biasa digunakan untuk membandingkan apakah zat kimia yang satu lebih toksik dari yang lain. Uji toksisitas tidak khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan potensi toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji. Termasuk dalam uji toksisitas tidak khas ialah uji toksisitas akut. Uji toksisitas akut merupakan uji toksisitas dengan pemberian suatu senyawa yang diberikan dengan dosis tunggal pada hewan uji tertentu dan pengamatan dilakukan selama 24 jam. Maksud uji toksisitas akut adalah untuk menentukan gejala toksik sebagai akibat pemberian suatu senyawa dan untuk menentukan tingkat letalitasnya (Loomis, 1978). Selain uji toksisitas akut, di dalam uji toksisitas tidak khas termasuk pula uji toksisitas subkronis dan uji toksisitas kronis. Uji toksisitas yang khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi secara rinci potensi toksik yang spesifik suatu senyawa pada aneka ragam hewan uji. Termasuk dalam uji ini ialah uji potensial, uji kekarsinogenikan, uji kemutagenikan, uji keteratogenikan, uji mata dan uji kulit.

29 13 Tolok ukur pengamatan potensi ketoksikan meliputi tolok ukur kualitatif dan kuantitatif. Tolok ukur kualitatif terdiri dari mekanisme efek toksik, wujud efek toksik, sifat efek toksik dan gejala klinis. Tolok ukur kuantitatif berupa LC 50, yaitu konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian pada 50% hewan uji. Dalam tolok ukur kuantitatif ini terdapat hubungan antara konsentrasi dengan ketoksikan suatu senyawa. Hubungan antara konsentrasi-respon lebih banyak digunakan dalam evaluasi ketoksikan suatu senyawa karena tujuannya lebih ditujukan pada resiko (ukuran kemungkinan timbulnya potensi toksik pada sekelompok hewan uji). Uji toksisitas akut digunakan untuk menentukan harga LD 50 atau LC 50 suatu senyawa bilamana lama pengamatan tidak ditunjukkan, maka dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Donatus, 2001). Parameter LC 50 digunakan dalam metode BST dan bukan LD 50 karena dalam hal ini larva artemia terpejani senyawa toksik yang ada pada media hidupnya, yaitu Air Laut Buatan (ALB). Uji toksisitas akut dengan hewan uji Artemia salina Leach digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarah pada uji sitotoksik. Suatu senyawa disebut toksik jika harga LC 50 dari uji toksisitas akut < 1000 µg/ml (Meyer et al., 1982). Parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologis suatu senyawa pada artemia adalah kematian. Keuntungan penggunaan arrtemia sebagai hewan uji adalah kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat, dan konsentrasi kecil sudah dapat menimbulkan aktivitas biologis (Meyer et al., 1982)

30 14 Tabel I. Kriteria ketoksikan akut (Loomis, 1978) KRITERIA Luar biasa toksik LC 50 (µg/ml) 1 atau kurang Sangat toksik 1 50 Cukup toksik Sedikit toksik Praktis tidak toksik Relatif kurang berbahaya C. Apoptosis Kematian sel (apoptosis) meruoakan bagian penting dalam perkembangan manusia, yang terjadi selama proses oogenesis, perkembangan otak dan pada pembentukan kaki serta tangan. Apoptosis melibatkan gen-gen khusus dan jalur pemberi signal yang mendasari program kematian sel. Apoptosis dapat terjadi pada suatu sel tanpa menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan di sekitarnya (Rajesh, et al., 2003). Karakteristik apoptosis bila ditinjau dari segi morfologi : 1. penyusutan sel : sel menjadi lebih kecil dan kehilangan kontak dengan selsel yang berada di sekelilingnya. 2. terjadi blebbing yaitu adanya tonjolan-tonjolan kecil di permukaan membran sel.

31 15 3. pemecahan sel membentuk badan apoptotik dan terjadi fagositosis dari pecahan-pecahan sel ini oleh makrofag. Apoptosis diatur oleh berbagai jalur pemberi signal yang kesemuanya itu melibatkan caspase. Caspase merupakan kelompok dari sistein protease, yaitu suatu enzim yang bertugas mencerna protein. Dalam tubuh manusia, kebanyakan caspase berada dalam bentuk inaktif yang kemudian akan diaktivasi melalui proses proteolisis menjadi bentuk yang lebih aktif. Monoterpenoid/sesquiterpenoid berpotensi menginduksi apoptosis melalui jalur Fas/Fas ligand. Potensi monoterpenoid/sesquiterpenoid dalam menginduksi apoptosis disebabkan karena monoterpenoid/sesquiterpenoid dapat menghambat peralihan fase G 2 /M dalam siklus sel (Rajesh, et al 2003). Flavonoid menginduksi apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert et al., 2002). D. Penyarian Kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair disebut dengan istilah penyarian. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang dapat larut melalui lapisanlapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut. Untuk melakukan penyarian harus diketahui zat aktif yang dikandungnya sehingga mempermudah pemilihan cairan penyari serta cara penyarian yang tepat. Secara umum ada 4 metode penyarian yaitu maserasi, infundasi, perkolasi dan destilasi uap (Anonim, 1986).

32 16 Perkolasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyarian melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Metode perkolasi digunakan dalam penelitian ini karena dapat menyari zat aktif lebih optimal dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi. Hal tersebut dikarenakan: 1. aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. 2. ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat mengalir cairan penyari. Oleh karena kecilnya cairan kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan atas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986). Selain itu, perkolasi lebih efisien bila dibandingkan dengan maserasi karena prosesnya yang berkesinambungan di mana cairan penyari yang telah jenuh akan digantikan dengan cairan penyari yang lebih segar terus-menerus (Silva, Lee, Kinghorn, 1998) Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut : serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dapat dilalui sampai mencapai keadaan jenuh, gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan. Kekuatan yang berperan dalam perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut,

33 17 tegangan permukaan, difusi osmosa, adhesi, daya kapiler dan daya geseran (Anonim, 1986). Alat yang digunakan untuk perkolasi adalah perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari yang disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukan penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986). E. Senyawa Yang Diidentifikasi 1. Terpenoid Senyawa terpenoid pada umumnya terdapat dalam sitoplasma sel tumbuhan serta berperan penting baik dalam pertumbuhan dan metabolisme maupun pada ekologi tumbuhan. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa, mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpena dan sesquiterpena, diterpena, triterpena, sterol serta pigmen karotenoid. Semua senyawa terpenoid berasal dari molekul isoprena CH 2 =C(CH 3 )-CH=CH 2. Terpenoid biasanya dapat diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan menggunakan petroleum eter, dietil eter atau kloroform (Harborne, 1987). Senyawa terpenoid berpotensi sebagai agen antikanker karena mempunyai sifat sitotoksik yaitu dengan menahan peralihan fase G 2 /M dalam siklus sel(rajesh et al., 2003).

34 18 Gambar 3. Siklus sel (Katzung and Trevor. 1993) Menurut (Mursyidi, 1990), senyawa terpenoid dapat dipisahkan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase gerak yang digunakan yaitu toluen-etil asetat (93:7 v/v). Sedangkan fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254 atau selulosa. Terpenoid dideteksi dengan menggunakan pereaksi vanilin asam sulfat. 2. Flavonoid Senyawa fenol alam, flavonoid terdapat dalam hampir semua tumbuhan dari bangsa algae hingga Gymnospermae. Di dalam tumbuhan, flavonoid biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula disebut aglikon. Aglikon flavonoid adalah polifenol sehingga flavonoid mempunyai sifat kimia fenol (Mursyidi,1990). Golongan senyawa flavonoid bersifat polar karena mempunyai gugus hidroksil yang tidak tersulih atau mempunyai suatu gula, sehingga pada umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar. Golongan senyawa flavonoid bersifat polar sehingga pada umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol

35 19 (MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida (DMSO) serta air. Gula yang terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air, dengan demikian campuran pelarut dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Efek flavonoid terhadap macam-macam organisme sangat banyak macamnya dan dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional (Mursyidi, 1990). Menurut Anonim (2006), flavonoid merupakan salah satu jenis metabolit sekunder yang diduga menunjukkan adanya aktivitas sebagai antikanker. Flavonoid sebagai senyawa antikanker pada prinsipnya bersifat sitotoksik, antimetabolit, antimitotik/mitostatik, menghambat salah satu atau beberapa fase siklus metabolisme sel (Colis, 1874 cit Santa, 1998). Adanya senyawa flavonoid dalam suatu bahan dapat dianalisis dengan KLT. Biasanya digunakan fase diam selulosa dan fase gerak seperti n-butanolasam asetat-air (4:1:5 v/v) diambil lapisan atas, kloroform-etil asetat (60:40 v/v), dan kloroform-aseton-asam format (75:16,5:8,5 v/v). Deteksi terhadap bercak yang timbul setelah pengembangan dapat menggunakan sinar UV, pereaksi semprot seperti sitroborat, pereaksi alumunium klorida, dan antimoni triklorida (Wagner, Brady, dan Zgainski, 1984). F. Kromatografi Lapis Tipis Metode pemisahan fisikokimia yang banyak digunakan dalam berbagai penelitian adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Campuran senyawa yang akan

36 20 dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita pada lempeng kromatografi, selanjutnya dikembangkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (Stahl, 1985). Fase diam (lapisan penjerap) dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT. Penjerap yang umum digunakan adalah silika gel, alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan lain-lain. Fase gerak ialah medium yang terdiri dari satu atau beberapa pelarut, bergerak di dalam fase diam yang merupakan lapisan berpori, yang dipengaruhi oleh gaya kapiler. Pelarut yang digunakan memiliki tingkat mutu analitik dan jika perlu dapat digunakan campuran pelarut yang terdiri dari 3 jenis pelarut (Stahl, 1985). Deteksi senyawa pada plat KLT paling sederhana adalah jika senyawa yang menunjukkan penyerapan di daerah UV dengan panjang gelombang 254 nm (gelombang pendek) atau gelombang 365 nm (gelombang panjang) (Stahl, 1985). Deteksi senyawa pada plat KLT biasanya juga dilakukan dengan penyemprotan dan karena permukaan lebih sempit, maka penyemprotannya merupakan prosedur nisbi yang sederhana (Harborne, 1987). Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap, berkisar antara 0,00-1,00 dan ditentukan hanya dua desimal. Bilangan hrf merupakan angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berkisar antara Harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar (Stahl, 1985). Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa.

37 21 Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf = Jarak garis depan dari titik awal Kelebihan khas KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada plat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada plat dan merupakan keuntungan bila digunakan untuk menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya kurang dari ukuran µg (Harborne, 1987). G. Keterangan Empiris Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan data empiris tentang potensi toksik ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun terhadap larva artemia dengan metode BST yang dinyatakan dalam LC 50, serta untuk memperoleh profil kromatografi lapis tipis ekstrak aktif herba pegagan embun. Data empiris yang diperoleh melalui uji toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun ini memungkinkan untuk dilakukan eksplorasi guna mendapatkan senyawa toksik yang dapat dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas untuk mendapatkan senyawa antikanker.

38 22 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan Posttest Only Control Group Design. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel bebas Jenis ekstrak yang digunakan yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanolair herba pegagan embun dengan berbagai seri konsentrasi. b. Variabel tergantung Nilai LC 50 ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun yang diperoleh dari analisis probit. c. Variabel pengacau terkendali 1) Lingkungan tempat percobaan: sinar lampu 5 watt, suhu penetasan sebesar 25º C, serta ph air laut buatan antara 7-8 dengan kadar garam 5 permil 2) Umur larva artemia adalah 48 jam. 2. Definisi operasional a. Herba pegagan embun yang digunakan dalam penelitian ini adalah seluruh bagian tanaman yang berada di atas tanah meliputi bunga, daun, dan batang.

39 23 b. Konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun yaitu 10, 32, 102, 328 dan 1049 µg/ml dan konsentrasi ekstrak metanol- air herba pegagan embun yaitu 250; 500; 1000; 2000 dan 4000 µg/ml c. Ekstrak dietil eter merupakan sari yang diperoleh dari hasil perkolasi serbuk herba pegagan embun menggunakan penyari dietil eter d. Ekstrak metanol-air merupakan sari yang diperoleh dari hasil perkolasi serbuk herba pegagan embun menggunakan penyari metanol-air e. Jumlah kematian larva artemia setelah diberi perlakuan selama 24 jam. f. Kematian artemia ditunjukkan dengan keadaan dimana tidak ada lagi pergerakkan dari artemia, baik itu tenggelam, melayang maupun mengapung. C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian Bahan utama penelitian ini adalah herba pegagan embun yang telah dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, telur artemia, ragi Saccharomyces cerevisae, aquadest, selulosa, pereaksi semprot AlCl 3 dan amonia, natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, natrium hidrokarbonat, n-butanol, asam asetat, serta bahan kimia yang bila tidak disebutkan lain berderajat pro analisys meliputi: dietil eter dan metanol. 2. Alat penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi perkolator, waterbath (Memmert), oven (Mettler), bak penetasan artemia, flakon, aerator, lampu 5 watt,

40 24 mikropipet, pipet volume 5 ml (Pyrex), pipet tetes, bejana kromatografi, kertas saring, alat semprot, lampu UV 254 nm dan 365 nm, gelas ukur (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), cawan porselen, batang pengaduk, sendok, blender (Retch bv), pengayak, neraca analitik (Mettler Toledo AB 204). D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi herba pegagan embun Determinasi dilakukan terhadap tanaman pegagan embun dengan menggunakan buku acuan (Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965) dengan tujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah Hydrocotyle sibthorpioides Lmk. Hasil determinasi berupa nama jenis (spesies) tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. 2. Pengumpulan bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba pegagan embun yang telah dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan dikumpulkan pada bulan Januari, sedangkan hewan uji yang digunakan berupa telur Artemia salina Leach (Ocean Star International, Inc.). 3. Pembuatan simplisia Herba pegagan embun yang sudah diambil dicuci dengan air bersih yang mengalir, kemudian diangin-anginkan. Apabila sudah bersih daun herba pegagan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam. Pengeringan dapat dilanjutkan dengan menggunakan oven agar diperoleh

41 25 simplisia yang benar-benar kering. Simplisia dapat diasumsikan kering apabila diremas dapat hancur. Setelah kering dipotong kecil-kecil dan dibuat menjadi serbuk dengan menggunakan blender kering dan kemudian diayak menggunakan ayakan tepung. Serbuk diayak sampai seluruhnya dapat melewati ayakan sehingga diperoleh serbuk yang halus. 4. Penyarian Metode penyarian yang dilakukan pada penelitian ini yaitu dengan metode perkolasi menggunakan alat perkolator. Cairan penyari yang digunakan yaitu dietil eter dan campuran metanol-air (1:1 v/v). a. Penyarian untuk mendapatkan ekstrak dietil eter Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 200 gram. Kemudian dilakukan maserasi pendahuluan terlebih dahulu selama 3 jam menggunakan pelarut dietil eter. Sebelum serbuk yang telah dimaserasi dimasukkan ke dalam perkolator, bagian leher perkolator diberi saringan yang dibalut dengan kapas dan kertas saring. Saringan dengan lubang yang kasar diletakkan paling atas kemudian di bawahnya saringan yang lebih halus dengan tujuan agar kotoran dan serbuk dapat tersaring sehingga tidak menyumbat aliran perkolat serta tidak masuk ke dalam perkolat. Serbuk dimasukkan sedikit demi sedikit sambil ditekan-tekan. Selanjutnya dietil eter dituangkan secukupnya sampai di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit (Anonim, 1986) dan ditambahkan berulang-ulang dietil eter secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Penyarian dihentikan jika

42 26 pada perkolat yang terakhir hasilnya negatif yang ditandai dengan tetesan terakhir yang jernih. Zat aktif diperoleh setelah perkolat diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator sampai kental. Agar proses penguapan dietil eter sempurna maka setelah divaccum, diuapkan di atas waterbath sampai bau dietil eter hilang menggunakan cawan porselen. b. Penyarian untuk mendapatkan ekstrak metanol-air Setelah didapatkan ekstrak dietil eter, serbuk (ampas) dikeringkan terlebih dahulu di dalam oven. Setelah serbuk benar-benar kering, penyarian dilanjutkan dengan menggunakan pelarut metanol-air (1:1 v/v). Sebelumnya dilakukan maserasi pendahuluan terlebih dahulu selama 3 jam menggunakan pelarut metanol-air (1:1 v/v). Selanjutnya serbuk dimasukkan ke dalam perkolator sedikit demi sedikit sambil ditekan-tekan, lalu dituangkan campuran pelarut metanol-air (1:1 v/v) secukupnya sampai di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit (Anonim, 1986) dan ditambahkan berulang-ulang campuran pelarut metanol-air (1:1 v/v) secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Penyarian dihentikan jika pada perkolat yang terakhir hasilnya negatif yang ditandai dengan tetesan terakhir yang jernih. Zat aktif diperoleh setelah perkolat diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator sampai kental. Agar proses penguapan campuran pelarut metanol-air sempurna maka setelah divaccum, diuapkan di atas waterbath sampai didapatkan ekstrak kental menggunakan cawan porselen.

43 27 5. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) Komposisi bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berkadar garam 5 permil adalah 5 gram natrium klorida (NaCl); 1,3 gram magnesium sulfat (MgSO 4 ); 1 gram magnesium klorida (MgCl 2 ); 0,3 gram kalsium klorida (CaCl 2 ); 0,2 gram kalium klorida (KCl), dan 2 gram natrium hidrokarbonat (NaHCO 3 ) dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan-bahan sebagian dilarutkan dalam sebagian aquadest dalam labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam air panas, sedangkan natrium hidrokarbonat dilarutkan dengan air bebas CO 2. Kemudian ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter. Air laut buatan berkadar garam 5 permil dan ph antara 7,3-8,4 (Mudjiman, 1989). 6. Penetasan telur artemia Artemia diteteskan dari telurnya dengan media ALB berkadar 5 permil. ALB yang akan digunakan untuk menetaskan telur artemia diaerasi terlebih dahulu selama 2 jam. Telur artemia diteteskan dalam aquarium yang disekat menjadi dua bagian, bagian gelap dan bagian terang, dengan sekat berlubang. Bagian gelap merupakan telur artemia ditaburkan. Telur menetas kira-kira jam kemudian menjadi nauplius (Mudjiman, 1991). Nauplius yang aktif akan bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Setelah 48 jam, nauplius diambil dari bagian yang terang menggunakan pipet dan digunakan sebagai hewan uji (Meyer et al., 1982).

44 28 7. Pembuatan larutan uji a. Pembuatan larutan stok Larutan stok ekstrak dietil eter juga dipersiapkan sebagai larutan A dan larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental dietil eter menggunakan cawan porselen yang telah ditara, kemudian dilarutkan dengan 10 ml dietil eter p.a. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A dengan 10 ml dietil eter p.a. Larutan stok ekstrak metanol-air dipersiapkan sebagai larutan A dan larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental metanol-air menggunakan cawan porselen yang telah ditara, kemudian dilarutkan dengan 10 ml metanol p.a. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A dengan 10 ml metanol p.a. b. Pembuatan larutan sampel Dari larutan stok tersebut dibuat seri konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml sebagai uji awal BST (Meyer et al., 1982). Kelompok kontrol dan kelompok perlakuan masing-masing dibuat dalam tiga kali replikasi. Setelah dilakukan uji awal BST dan diperoleh hasil yang baik kemudian dibuat menjadi lima seri konsentrasi. Ekstrak dietil eter dibuat dalam seri konsentrasi 10, 32, 102, 328 dan 1049 µg/ml serta untuk ekstrak metanol-air dibuat dalam seri konsentrasi 250, 500, 1000, 2000 dan 4000 µg/ml Kelompok kontrol dan kelompok perlakuan masing-masing dibuat dalam lima kali replikasi. 9. Toksisitas akut dengan BST Uji toksisitas akut dengan dilakukan BST menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam (Meyer et al., 1982). Flakon yang telah berisi sampel,yaitu

45 29 masing-masing berupe ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter dengan berbagai seri konsentrasi terlebih dahulu dikeringuapkan di atas waterbath. Hal ini bertujuan supaya pelarut menguap dan diharapkan hanya ekstrak herba pegagan embun yang tertinggal. Ditambahkan ± 3 ml ALB, kemudian divortex. Sepuluh ekor larva artemia yang berumur 48 jam, diambil secara acak dan dimasukkan ke dalam flakon. Kemudian ditambah ALB hingga volumenya mencapai 5 ml dan diberi 1 tetes ragi (3mg/5ml) sebagai makanan. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan masing-masing konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi. Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva artemia yang mati dihitung dan dianalisis untuk mengetahui harga LC 50. Larva udang dikatakan mati bila larva tersebut tidak dapat menunjukkan gerakan aktif lagi (Carballo et al., 2002). 10. KLT ekstrak aktif herba pegagan embun Uji kualitatif ekstrak yang aktif herba pegagan dengan KLT ini bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa terpenoid dan flavonoid yang terdapat dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air daun pegagan embun. a. Identifikasi terpenoid Dalam identifikasi senyawa terpenoid menggunakan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak toluen-etil asetat (93:7 v/v). Deteksi bercak terpenoid dilakukan menggunakan pereaksi semprot vanilin asam sulfat. Lempeng KLT yang sudah disemprot dengan pereaksi vanilin asam sulfat, dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 C selama 10 menit hingga muncul warna ungu keabu-abuan. Pengamatan dilakukan pada sinar tampak (secara visibel).

46 30 b. Identifikasi flavonoid Dalam identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan menggunakan fase diam selulosa, sedangkan fase geraknya n-butanol:asam asetat:air (4:1:5 v/v). Pembanding yang digunakan yaitu rutin. Lempeng KLT dimasukkan dalam bejana berisi fase gerak yang telah jenuh lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm. Pengamatan bercak dilakukan di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Deteksi juga dilakukan dengan menggunakan uap amonia untuk memastikan keberadaan senyawa flavonoid. Caranya adalah dengan meletakkan lempeng KLT yang telah selesai dielusi dalam sebuah chamber yang di dalamnya sudah diletakkan larutan amonia. Lempeng KLT dibiarkan terkena uap dari amonia tersebut selama beberapa saat hingga muncul warna kuning. 11. Analisis hasil Presentase kematian larva artemia dapat dihitung menggunakan rumus Abott, hal ini dilakukan karena terdapat kematian larva artemia pada kontrol (Negara, 2003). Jml. kematian pada tes uji Jml. Kematian pada kontrol % kematian = X 100% Jml. hewan uji Jml. kematian pada kontrol Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh kemudian dianalisis menggunakan analisis probit menggunakan program SPSS dengan memplotkan antara log konsentrasi vs respon (nilai probit) untuk menetapkan harga LC 50. Adanya kandungan senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid serta senyawa flavonoid dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air dipastikan melalui uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

47 31 BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Tanaman Identifikasi tanaman menjadi langkah awal dalam penelitian yang menggunakan herba pegagan embun. Identifikasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran identitas tanaman menggunakan kunci determinasi menurut Backer and Bakhuizen van den Brink Jr (1965). Berdasarkan identifikasi tanaman yang telah dilakukan (lampiran 1), diperoleh kesimpulan bahwa tanaman yang digunakan adalah benar-benar herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.). B. Pengumpulan Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba pegagan embun yang telah dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan dikumpulkan pada bulan Januari. Herba pegagan embun yang digunakan meliputi seluruh bagian tanaman yang berada di atas tanah yaitu bunga, daun, dan batang. Herba pegagan embun ini dibudidayakan dengan tujuan untuk menghindari variasi kandungan kimia tanaman yang terlalu besar karena perbedaan kondisi lingkungan. Umur tanaman (± 2 bulan) yang digunakan dalam penelitian ini diupayakan seragam, supaya kadar senyawa aktif di dalam herba

48 32 pegagan embun tidak berbeda secara bermakna, begitu pula dengan bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. C. Pembuatan Simplisia Herba pegagan embun yang telah dikumpulkan dibersihkan dan dicuci dengan air yang mengalir dengan tujuan agar kotoran yang melekat pada daun dapat terlepas serta tidak menempel lagi. Herba dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam sehingga senyawa aktif yang terdapat di dalam herba pegagan embun tidak rusak. Pengeringan ini menurut Anonim (1986) dimaksudkan untuk menurunkan kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, mempermudah pembuatan serbuk, dan menjamin agar kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Reaksi enzimatis serta perubahan kimiawi dapat juga diminimalkan, sehingga senyawa aktif yang terkandung dalam herba pegagan embun tidak hilang terurai. Pengeringan dihentikan apabila apabila kadar air yang terkandung dalam simplisia kurang dari 10% karena reaksi enzimatis yang dapat menguraikan senyawa aktif sudah tidak berlangsung (Anonim, 1986). Untuk mengetahui kapan proses pengeringan dihentikan adalah dengan meremas herba sampai hancur. Jika kadar air masih tinggi, maka herba tersebut masih lembab dan tidak hancur jika diremas. Simplisia kering dibuat menjadi serbuk dengan tujuan untuk memperluas permukaan serbuk yang kontak dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses penyarian lebih banyak dan penyarian dapat berlangsung lebih sempurna (Anonim, 1986). Pada umumnya penyarian akan

49 33 bertambah baik bila permukaan serbuk yang bersentuhan dengan cairan penyari semakin luas, sehingga semakin halus serbuk yang dihasilkan maka akan semakin baik pula penyariannya. Namun menurut Anonim (1986) pada metode perkolasi, serbuk yang terlalu halus menyebabkan cairan penyari tidak dapat mengalir sehingga mengakibatkan penyarian tidak optimal. Pada penelitian ini serbuk yang dihasilkan halus, namun tidak menyumbat perkolator sehingga cairan penyari dapat menembus pori-pori serbuk dan penyarian berlangsung dengan sempurna. D. Penyarian Herba Pegagan Embun Menggunakan Pelarut Dietil Eter dan Metanol Penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga di dalam cairan penyari terdapat zat aktif. Perkolasi merupakan suatu metode penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi (Anonim, 1986). Perkolasi dipilih sebagai metode penyarian dalam penelitian ini karena lebih efisien bila dibandingkan dengan metode maserasi, hal ini dikarenakan prosesnya yang berkesinambungan dimana cairan penyari yang telah jenuh akan digantikan dengan cairan penyari yang lebih segar terus-menerus (Silva, Lee, Kinghorn, 1998). Cairan penyari yang digunakan yaitu dietil eter dan campuran metanol-air (1:1 v/v). Dietil eter merupakan pelarut organik yang bersifat non polar dibandingkan dengan metanol. Dalam penelitian ini penggunaan dietil eter dimaksudkan untuk menarik senyawa atau zat aktif yang terkandung dalam herba pegagan embun terutama yang bersifat non polar seperti

50 34 senyawa terpenoid. Sedangkan penggunaan metanol yang bersifat lebih polar dibandingkan dietil eter dimaksudkan untuk menarik senyawa ataupun zat aktif yang terkandung dalam herba pegagan embun yang bersifat polar seperti flavonoid. Maserasi pendahuluan dilakukan sekurang-kurangnya 3 jam untuk membuka pori-pori serbuk sehingga cairan penyari dapat menembus sel dan melarutkan zat aktif dengan sempurna. Serbuk simplisia yang sebelumnya telah dibasahi dengan cairan penyari yang cukup untuk mengembangkan sel dengan sempurna, maka aliran cairan penyarinya tidak akan mengalami hambatan. Perendaman dengan dietil eter selama 24 jam pada proses perkolasi dimaksudkan supaya serbuk simplisia menjadi terbasahi dan serbuk menjadi lebih mengembang sehingga dapat tersusun dengan baik. Penyusunan dikatakan baik apabila tidak ada rongga udara dalam serbuk simplisia dan kondisi simplisia tidak terlalu padat sehingga cairan penyari dapat membasahi seluruh serbuk simplisia dengan sempurna dan dapat menyari dengan optimal. Pada penelitian ini penyusunan serbuk simplisia telah diusahakan sebaik mungkin sehingga tidak lagi terdapat rongga udara. Perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit atau 20 tetes/menit. Jika tetesan terlalu cepat yaitu lebih dari 20 tetes/menit maka penyarian berjalan tidak sempurna. Sedangkan jika tetesan terlalu lambat yaitu kurang dari 20 tetes/menit maka besar kemungkinan cairan penyari untuk menguap sehingga akan terjadi pemborosan cairan penyari dan juga pemborosan waktu. Pada penelitian ini kecepatan penetesan perkolat 1 ml/menit atau 20

51 35 tetes/menit sehingga penyarian berlangsung sempurna. Kecepatan penetesan dietil eter harus sama dengan kecepatan menetesnya perkolat, supaya permukaan serbuk tidak menjadi kering sehingga penyarian zat aktif optimal. Perkolat yang dihasilkan pertama kali merupakan cairan yang berwarna sangat pekat, hal ini menandakan bahwa banyak zat aktif yang terlarut dalam dietil eter. Perkolasi dihentikan setelah perkolat terakhir yang menetes sudah tidak berwarna (jernih), hal ini menandakan bahwa sudah tidak ada lagi zat aktif yang terlarut dalam dietil eter. Sari dietil eter diuapkan di atas waterbath untuk mendapatkan ekstrak kental menggunakan cawan porselen. Penguapan dilakukan pada suhu 60º C. Suhu 60º C merupakan suhu optimal untuk penguapan di atas waterbath karena suhu yang lebih tinggi dapat menyebabkan rusaknya zat aktif. Karena penguapan tidak selesai dalam satu hari maka sari dietil eter disimpan di kulkas untuk mencegah tumbuhnya mikroorganisme. Hasil yang diperoleh berupa ekstrak kental. Ekstrak metanol-air diperoleh dengan mengeringkan terlebih dahulu serbuk simplisia yang telah disari dengan dietil eter. Pengeringan serbuk simplisia dilakukan dengan cara dioven sampai sisa dietil eter benar-benar hilang, kemudian dilakukan maserasi pendahuluan dengan penyari metanol-air (1:1 v/v) selama sekurang-kurangnya 3 jam untuk membuka pori-pori serbuk sehingga cairan penyari dapat menembus sel dan melarutkan zat aktif dengan sempurna. Untuk mendapatkan ekstrak kental metanol, maka sari metanol diuapkan di atas

52 36 waterbath pada suhu 60º C menggunakan cawan porselen. Untuk ekstrak metanol, hasil yang didapat berupa ekstrak kental. Ekstrak yang telah diperoleh kemudian disimpan di dalam eksikator. Dalam eksikator tidak ada lagi air dan udara yang dapat masuk, yang memungkinkan terjadinya perubahan senyawa dalam ekstrak tersebut atau dapat merusak senyawa oleh adanya bakteri atau cendawan. E. Air Laut Buatan (ALB) Pembuatan ALB dimaksudkan untuk menyesuaikan lingkungan hidup artemia sehingga sama seperti air laut alami. Bahan yang digunakan untuk membuat air laut buatan terdiri dari natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalisum klorida dan natrium hidrokarbonat. Bahan-bahan tersebut secara keseluruhan berbentuk padat dan bersifat higroskopis. Khusus untuk magnesium klorida sebelum dicampur dengan bahan lain terlebih dahulu dilarutkan dalam air panas untuk mempermudah proses pelarutannya, sedangkan untuk natrium hidrokarbonat terlebih dahulu dilarutkan dengan air bebas karbondioksida untuk mempertahankan kebasaan atau agar ph ALB stabil (antara 8-9). Pemecahan cangkang siste dibantu oleh kegiatan enzim penetasan yang membutuhkan ph lebih dari 8, sehingga ph berpengaruh terhadap penetasan siste. Apabila ph kurang dari 8 maka efisiensi penetasannya akan menurun, siste yang tidak menetas banyak atau waktu penetasannya menjadi lebih lama. Air laut buatan tersebut mempunyai kadar garam 5 permil yang artinya dalam 1 ml aquadest mengandung 5 mg natrium klorida. Air laut yang digunakan

53 37 dalam penelitian ini berkadar garam 5 permil supaya telur artemia menetas secara optimal (Mudjiman, 1989). Dalam penelitian ini, selama penetasan siste maupun pelaksanaan uji BST selalu digunakan ALB dengan kadar garam yang sama yaitu 5 permil supaya artemia hidup dalam kondisi yang sama. Dalam kondisi lingkungan hidup yang sama diharapkan siste dapat menetas dengan sempurna dan pada waktu digunakan dalam uji BST dapat memberikan hasil yang optimal, yiatu berupa kematian artemia yang harus terjadi akibat zat aktif yang terkandung dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air.. F. Penetasan Siste Siste yang digunakan dalam penelitian ini dalam bentuk kering. Siste kering memiliki kadar air kurang dari 10% yang berisi embrio dalam keadaan diapauze (metabolisme terhenti sementara). Untuk menetaskan siste kering, terlebih dahulu diperlukan perendaman dalam aquadest selama 1 jam yang bertujuan agar siste menyerap sejumlah air dan diperkirakan dalam waktu 1 jam kadar air di dalam siste sudah mencapai lebih dari 65%, sehingga embrio yang semula berada dalam keadaan diapauze metabolismenya dapat aktif kembali. Proses penyerapan air ke dalam telur berlangsung secara hiperosmotik (tekanan osmose di dalam telur yang lebih tinggi daripada di luarnya). ALB yang akan digunakan untuk menetaskan siste diaerasi selama 2 jam. Aerasi ini bertujuan untuk memberikan oksigen yang cukup bagi kelangsungan hidup artemia. Kekuatan aerasi sedang, tidak terlalu kuat dan tidak terlalu lemah. Siste ditetaskan dalam bak penetasan bersekat. Bak penetasan tersebut terdiri dari

54 38 dua bagian yaitu bagian gelap dan bagian terang yang dipisahkan oleh sebuah sekat yang bercelah. ALB yang telah diaerasi dituangkan ke dalam bak penetasan pada bagian gelap dengan ketinggian melebihi bagian terbawah dari sekat. Hal ini dimaksudkan agar ketika siste ditebarkan tidak mengalir ke bagian terang. Siste ditebarkan ke bagian yang gelap. Suhu ALB selama penetasan perlu dipertahankan antara C untuk mempercepat pemisahan cangkang siste dengan nauplius. Hal ini dapat dicapai dengan bantuan lampu 5 watt yang digantungkan di atas bak penetasan pada bagian yang terang. Penetasan siste menjadi nauplius berlangsung selama jam. Nauplius akan menuju ke bagian terang karena artemia memiliki sifat fototropik positif (tertarik pada cahaya). Nauplius yang berada pada bagian terang inilah yang akan digunakan untuk BST, karena nauplius yang mampu bergerak menuju bagian yang terang menandakan bahwa nauplius tersebut sehat. Nauplius dapat bertahan selama ± 2 hari setelah menetas tanpa diberi makanan. Nauplius yang baru menetas berwarna kemerah-merahan karena masih mengandung makanan cadangan, namun setelah 24 jam cadangan makanan larva habis bersamaan dengan terbentuknya mulut, saluran pencernaan dan dubur. Dengan demikian maka nauplius mulai membutuhkan lebih banyak makanan demi kelangsungan hidupnya. Suspensi ragi Saccharomyces cerevisae diberikan sebagai sumber makanan bagi larva artemia. Sebelum dibuat suspensi, ragi dipanaskan terlebih dahulu dengan oven pada suhu 100 C selama 10 menit untuk menghindari tumbuhnya jamur dan bakteri pada ragi yang dapat mengganggu jalannya

55 39 penelitian. Hal ini perlu diperhatikan supaya kematian artemia benar- benar disebabkan karena bahan uji, yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun, bukan karena jamur atau bakteri. G. Toksisitas Akut dengan Metode BST Uji toksisitas akut berdasarkan metode BST dilakukan dengan menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam, karena pada umur tersebut larva artemia masih sangat peka. Hal ini disebabkan karena pada umur 48 jam membran yang menyelubungi tubuh artemia masih tipis sehingga senyawa monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air bisa berdifusi masuk ke dalam tubuh artemia, sehingga kematian artemia benar-benar disebabkan karena keberadaan senyawa tersebut di dalam tubuh artemia. Bila artemia yang digunakan dalam uji BST berumur lebih dari 48 jam dikhawatirkan membran yang menyelubungi tubuh artemia sudah mengeras (terbentuk karapak) sehingga monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air tidak bisa berdifusi masuk ke dalam tubuh artemia dan tidak dapat menimbulkan kematian. Bila artemia yang digunakan dalam uji BST berumur kurang dari 48 jam dikhawatirkan organ-organ belum terbentuk dengan sempurna, sehingga kematian artemia bukan disebabkan keberadaan monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air.

56 40 Selain itu, penggunaan larva artemia dalam mendeteksi senyawa yang memiliki aktivitas sitotoksik berdasarkan pada adanya kesamaan sistem enzim antara artemia dengan mamalia. Sistem enzim tersebut adalah tipe DNAdependent RNA polymerase dan oubaine sensitive Na + and K + dependent ATPase (Solis et all., 1993), sehingga jika suatu senyawa antikanker berefek toksik terhadap larva artemia maka senyawa tersebut dapat digunakan pada mamalia. Tetapi perkembangan larva artemia tidak dapat dikaitkan dengan perkembangan sel kanker karena memang tidak ada penelitian yang menegaskan hal tersebut. Senyawa yang diduga mempunyai aktivitas sitotoksik dalam herba pegagan embun adalah senyawa monoterpenoid/esquiterpenoid dan flavonoid. Namun mekanisme kedua senyawa tersebut dalam membunuh sel kanker belum diketahui secara terperinci. Mekanisme sitotoksisitas dari monoterpenoid/sesquiterpenoid yaitu dengan menginduksi terjadinya apoptosis. Sel akan mendapatkan signal terlebih dahulu sebelum melakukan apoptosis. Signal untuk melakukan apoptosis ini diatur oleh protein sel. Protein sel akan mempengaruhi mitokondria untuk meningkatkan permeabilitas membrannya, sehingga mengakibatkan keluarnya faktor-faktor pemicu terjadinya apoptosis, seperti sitokrom c dan Apaf 1. Sitokrom c dilepaskan seiring dengan meningkatnya permeabilitas membran mitokondria, berikatan dengan Apaf 1 dan ATP. Kemudian akan mengikat procaspase 9 membentuk kompleks apoptosome. Kompleks ini akan memotong procaspase 9 menjadi bentuk yang lebih aktif yaitu caspase 9, yang kemudian akan mengaktivasi caspase 3 dan terjadi apoptosis.

57 41 Gambar 6. Bagan mekanisme terjadinya apoptosis (Rajesh et al., 2003) Monoterpenoid/sesquiterpenoid menginduksi apoptosis melalui jalur ekstrinsik dengan jalur Fas/Fas ligand. Dalam menjalankan tugasnya suatu Fas reseptor harus berinteraksi dengan Fas ligand. Interaksi antara Fas reseptor dan Fas ligand membentuk death-induced signaling complex (DISC). DISC terdiri dari berbagai protein di antaranya FADD, caspase 8 dan caspase 10. DISC merupakan kompleks protein yang akan memberikan sinyal untuk melakukan apoptosis. Monoterpenoid, khususnya dapat menghambat peralihan fase G2/M dalam siklus sel dan selama penghambatan ini tidak dihasilkan FADD. FADD dapat mempercepat terjadinya apoptosis di dalam sel, akan tetapi FADD dapat pula melindungi sel dari radiasi yang dimaksudkan untuk menghancurkan sel kanker. Dalam hal ini, monoterpenoid akan menggantikan kedudukan FADD sehingga proses apoptosis dapat tetap berlangsung dan sel kanker dapat dimatikan.

58 42 Gambar 7. Mekanisme monoterpenoid menginduksi apoptosis (Rajesh, et al., 2003) Senyawa flavonoid banyak disebut-sebut berpotensi sebagai antitumor atau antikanker. Flavonoid dapat menginduksi terjadinya apoptosis (mekanisme kematian sel yang terprogram) pada sel kanker dengan mencegah terjadinya mutasi protein 53 (p53). Pada sel normal, jika suatu sel terpapar radiasi ionisasi atau promoter-promoter lain yang dapat menyebabkan kerusakan DNA maka protein 53 bekerja dengan memutus siklus sel tersebut. Langkah selanjutnya ada dua kemungkinan yaitu sel ini akan memperbaiki kerusakan DNA sehingga menjadi sel normal kembali yang kemudian dapat membelah menghasilkan sel-sel normal atau kemungkinan kedua yaitu jika kerusakan DNA sangat parah dan tidak dapat diperbaiki lagi, maka akan terjadi kematian sel yang terprogram atau yang lebih dikenal dengan apoptosis (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter, 2002). Namun pada sel yang kekurangan atau tidak mempunyai p53, salah satunya akibat terjadinya mutasi p53, jika sel tersebut terkena radiasi ionisasi atau promotor-promotor lain dan menyebabkan kerusakan DNA, maka tidak terjadi pemutusan siklus sel tersebut. Langkah selanjutnya juga ada dua kemungkinan yaitu pembelahan sel dengan kerusakan kromosom terus berlangsung menyebabkan kegagalan mitosis dan sel mati sehingga tumor menjadi jinak atau

59 43 kemungkinan kedua yaitu sel tumor mengalami mutasi, seleksi dan evolusi yang berkepanjangan yang menyebabkan terjadinya kanker. Gambar 8. Mekanisme flavonoid menginduksi apoptosis (Albert, et al., 2002) Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid seperti sudah dijelaskan di atas, diketahui dapat menyebabkan kematian sel. Kematian sel dapat terjadi apabila monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid berada di dalam tubuh artemia. Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid dapat masuk ke dalam tubuh artemia melalui kulit artemia yang belum terselubungi karapak (pada umur 48 jam). Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid dapat masuk ke dalam tubuh artemia melalui mekanisme difusi pasif. Artemia diibaratkan sebagai sebuah sel yang dilapisi membran semipermeabel, kemudian molekul-molekul monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid akan bergerak melewatinya. Molekul-molekul tersebut bergerak dari sisi yang kadarnya lebih tinggi menuju sisi lain yang kadarnya lebih rendah. Di dalam sel, molekul-molekul itu akan

60 44 merusak sistem enzim yang ada (DNA-dependent RNA polymerase atau Na + -K + ATPase) sehingga dapat mengakibatkan kematian sel. Sampel yang digunakan adalah ekstrak ekstrak dietil eter dengan konsentrasi 10, 32, 102, 328 dan 1049 µg/ml dan metanol dengan konsentrasi 250, 500, 1000, 2000 dan 4000 µg/ml. Konsentrasi tersebut didapatkan setelah melakukan uji BST awal dengan konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml. Setelah dilakukan pengujian dengan masing-masing ekstrak pada konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml, diperoleh jumlah larva yang mati dan kemudian digunakan untuk menghitung persentase kematian larva tersebut. Dari data persentase kematian ini diambil konsentrasi yang memberikan harga persentase kematian larva antara 20%-80% sebagai konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi. Digunakan persentase kematian larva antara 20%-80% karena dengan persentase kematian tersebut sudah dapat memberikan kurva yang lebih linier, sehingga LC 50 yang didapatkan pada uji BST ini lebih dapat menggambarkan hasil yang sebenarnya. Flakon-flakon yang telah berisi larutan uji dikeringuapkan diatas waterbath pada suhu 60ºC. Hal ini dimaksudkan untuk menguapkan pelarut, sehingga yang tertinggal di dalam flakon hanya ekstrak yang berisi zat aktif dan jika terdapat kematian pada artemia bukan disebabkan oleh adanya pelarut. ALB yang digunakan untuk uji toksisitas akut ini juga diaerasi selama 2 jam untuk memberikan oksigen yang cukup bagi kelangsungan hidup artemia, sehingga bila terdapat artemia yang mati bukan disebabkan karena kekurangan oksigen. Dalam uji toksisitas ini juga digunakan kelompok kontrol yang berfungsi sebagai faktor koreksi akan kematian larva yang bukan disebabkan oleh pengaruh ekstrak herba

61 45 pegagan embun. Pembuatan kontrol sama dengan pembuatan sampel uji, hanya saja pada kontrol tidak berisi sampel (ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air). Suspensi ragi diberikan sebagai sumber makanan bagi larva artemia. Suspensi ragi ini dibuat dengan melarutkan 3 mg ragi dalam 5 ml ALB. Pemberian makanan pada larva artemia ini tidak boleh berlebihan cukup setetes saja pada tiap flakonnya. Hal ini dikarenakan artemia merupakan filter feeder, yaitu makan dengan cara menyaring makanannya. Sebagai filter feeder, artemia menelan apa saja yang ukurannya kecil (kurang dari 50 µm). Artemia tidak bisa membedakan mana makanan dan mana yang bukan makanan. Apabila makanan baru masuk ke dalam tubuh artemia secara terus-menerus dalam jumlah yang berlebihan, maka akan mendesak makanan yang sudah ada sebelumnya yang belum sempat dicerna dengan sempurna. Bila terjadi demikian, maka makanan yang belum sempat dicerna dengan sempurna tersebut akan keluar lagi dari usus. Keadaan seperti ini akan membuat artemia menjadi kelaparan dalam timbunan makanan dan dapat menyebabkan kematian. Hal tersebut dapat mengacaukan pengambilan data karena larva mati bukan karena pemberian perlakuan melainkan karena pemberian makanan yang berlebihan. Flakon-flakon tersebut diletakkan dalam suatu kotak yang ditutupi dengan kain supaya terhindar dari serangga dan diberi penerangan dengan lampu 5 watt supaya suhu pada waktu penelitian sama dengan suhu pada waktu penetasan siste. Jumlah larva artemia yang hidup dihitung setelah 24 jam. Larva dikatakan masih hidup jika masih menunjukkan pergerakan yang aktif. Pergerakan pada larva dilakukan oleh sungut besar atau antena II-nya. Sungut tersebut akan terus-

62 46 menerus bergerak selama larva masih hidup karena selain berfungsi sebagai alat gerak, sungut tersebut berfungsi juga sebagai alat pernafasan. Dengan menghitung larva artemia yang hidup, maka besarnya kematian larva bisa ditentukan. Hasil perhitungan dengan menggunakan rumus Abbot data yang diperoleh berupa besarnya persen kematian dikarenakan ada kontrol yang mati. Kontrol digunakan untuk mengoreksi kematian larva yang bukan disebabkan oleh pengaruh ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun. Tabel II. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak dietil eter herba pegagan embun Konsentrasi ekstrak dietil eter (µg/ml) Kematian (%) 10 19, , , , ,9 Hasil penelitian menunjukkan bahwa besarnya konsentrasi senyawa uji berbanding lurus dengan persen kematian artemia (Tabel II dan III), semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi persen kematian artemia. Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan metode analisis probit menggunakan program SPSS 10.0 dengan taraf kepercayaan 95% untuk menentukan nilai LC 50. Analisis probit digunakan dalam penentuan LC 50, karena analisis probit dapat mengamati efek yang terjadi akibat pemberian suatu konsentrasi, selain itu dapat memberikan nilai regresi yang menghasilkan garis linear sehingga memudahkan dalam penentuan nilai LC 50. Pada analisis probit, konsentrasi sampel ditransformasikan ke dalam bentuk logaritma konsentrasi sebagai variabel tetap

63 47 (nilai x), sedangkan nilai probit dari prosentase kematian ditetapkan menjadi variabel tergantung (nilai y). Persamaan garis linear untuk ekstrak dietil eter yang diperoleh dari hasil analisis probit yaitu y = 0,83893x 1,98107 (lampiran 4). Nilai LC 50 yang diperoleh sebesar 229 µg/ml. Kurva hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi ekstrak dietil eter dapat dilihat pada gambar 3.,8,6 Probit Transformed Responses,4,2,0 -,2 -,4 -,6 Probit -,8-1,0 Rsq = 0,8566,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Log of KONS Gambar 4. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun Konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun dimana dapat membunuh 50% hewan uji (LC 50 ) juga dapat diketahui dengan menggunakan kurva di atas, yaitu dengan menarik garis lurus pada probit 0,0 ke arah kanan sampai pada garis, lalu ditarik garis ke arah bawah, didapatkan log konsentrasi sebesar 2,36 sehingga konsentrasinya sebesar 229 μg/ml. Berdasarkan kurva (Gambar 3) diperoleh pula nilai Rsq yang merupakan koefisien determinasi. Nilai Rsq mengukur tingkat ketepatan/kecocokan dari

64 48 regresi linier sederhana, yaitu merupakan proporsi/presentase sumbangan x terhadap variasi (naik dan turunnya) y. Nilai Rsq yang diperoleh sebesar 0,8566, berarti bahwa presentase sumbangan x yaitu konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun terhadap variasi yaitu respon (jumlah kematian artemia) sebesar 85,66%. Berdasarkan kurva hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi ekstrak dietil eter yang dihasilkan, terdapat korelasi yang diharapkan antara konsentrasi dengan respon (nilai probit). Korelasi yang positif ditunjukkan dengan meningkatnya nilai probit seiring dengan meningkatnya log konsentrasi serta nilai koefisien korelasi yang mendekati 1 (r = 0,9255). Nilai r menggambarkan hubungan yang kuat antara variabel x dan y, yang diperoleh dengan mengambil akar dari Rsq. Pada tabel nilai r dengan taraf kepercayaan 95% didapatkan nilai r sebesar 0,88 sehingga nilai r hitung lebih besar daripada nilai r tabel. Hal ini menunjukkan adanya korelasi yang linier antara konsentrasi dengan nilai probit. Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak metanol-air herba pegagan embun Konsentrasi ekstrak metanol-air (µg/ml) Kematian (%) , , , , ,5 Persamaan garis linear untuk ekstrak metanol-air diperoleh persamaan garis linear y = 1,82781x 5,27533 (lampiran 5). Nilai LC 50 yang diperoleh

65 49 sebesar 769 µg/ml. Kurva hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi ekstrak dietil eter dapat dilihat pada gambar 4. 1,5 Probit Transformed Responses 1,0,5 0,0 -,5 Probit -1,0 Rsq = 0,9975 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 Log of KONS Gambar 5. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak metanol-air herba pegagan embun Menurut Meyer et all. (1982), suatu bahan uji dikatakan bersifat toksik terhadap larva artemia jika mempunyai nilai LC 50 < 1000 µg/ml, semakin kecil nilai LC 50 berarti toksisitasnya semakin besar. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa nilai LC 50 dari kedua ekstrak < 1000 µg/ml yaitu untuk ekstrak dietil eter sebesar 229 µg/ml dan ekstrak metanol-air sebesar 769 µg/ml. Dari hasil tersebut diketahui bahwa ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air sama-sama bersifat toksik terhadap larva artemia karena mempunyai nilai LC 50 < 1000 µg/ml, namun ekstrak yang bersifat lebih toksik adalah ekstrak dietil eter. Menurut kriteria ketoksikan akut (Loomis, 1978), ekstrak dietil eter dengan nilai LC µg/ml bersifat cukup toksik dan ekstrak metanol-air dengan nilai LC µg/ml bersifat sedikit toksik.

66 50 H. Uji Kualitatif Ekstrak Aktif dengan KLT Uji kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak toksik herba pegagan embun yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air. Metode KLT dipilih karena memiliki banyak kelebihan dibandingkan kromatografi lain, diantaranya yaitu membutuhkan waktu yang singkat, memerlukan jumlah cuplikan yang sedikit serta pengerjaan yang sederhana. Pemeriksaan kandungan kimia secara KLT ini bertujuan untuk mendapatkan gambaran mengenai kandungan senyawa terpenoid dan flavonoid dalam ekstrak aktif herba pegagan embun. Pereaksi-pereaksi yang digunakan dalam KLT mampu memberikan hasil berupa informasi umum mengenai golongan senyawa terpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun namun belum dapat memberikan informasi mengenai senyawa yang lebih terperinci. 1. Identifikasi terpenoid Fase diam yang digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa terpenoid adalah silika gel GF 254. Silika gel GF 254 merupakan silika gel yang mengandung gypsum (CaSO 4 ) yang berfungsi sebagai perekat agar silika gel lebih terikat pada lempeng pendukungnya yang mengandung indikator fluoresensi pada panjang gelombang 254 nm. Jika senyawa pada bercak memiliki ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik maka bercak akan meredam pada panjang gelombang 254 nm, sedangkan pada panjang gelombang 365 nm bercak akan berfluoresensi. Fase gerak yang digunakan toluene-etil asetat (93:7 v/v) (Stahl, 1985). Deteksi yang digunakan untuk mengidentifikasi senyawa golongan

67 51 terpenoid yaitu pereaksi vanilin asam sulfat. Pada pemeriksaan senyawa terpenoid pada ekstrak dietil eter tidak digunakan pembanding karena pemeriksaan ini ditujukan untuk mengetahui keberadaan senyawa terpenoid, khususnya monoterpenoid dan sesquiterpenoid. Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan terpenoid dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun Bercak Vanillin asam sulfat Rf Warna 1. Sampel 1. 0,17 Ungu 2. 0,41 Ungu keabu-abuan 3. 0,87 Ungu Gambar 10. Kromatogram ekstrak dietil eter herba pegagan embun untuk pemeriksaan senyawa terpenoid Keterangan : Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : Toluene-etil asetat (97:3 v/v) Sampel : ekstrak dietil eter herba pegagan embun Deteksi : vanillin asam sulfat (110 C, 10 menit) Berdasarkan deteksi menggunakan pereaksi semprot vanilin asam sulfat terdapat bercak berwarna ungu keabu-abuan dengan nilai Rf 0,41. Secara umum,

68 52 pemeriksaan senyawa terpenoid menggunakan peraksi vanilin asam sulfat menghasilkan bercak berwarna biru keabu-abuan, sehingga dapat disimpulkan bahwa dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun terdapat senyawa terpenoid, khususnya monoterpenoid atau sesquiterpenoid. Keberadaan monoterpenoid/sesquiterpenoid ini dalam ekstrak dietil eter yang memungkinkan adanya khasiat antitumor pada herba pegagan embun, karena monoterpenoid/sesquiterpenoid telah diketahui dapat mematikan sel. O CH 3 + O C H + H 2 SO 4 HO CH 2 OH Terpenoid Vanilin CH 3 O OH O kompleks ungu keabu-abuan Gambar 9. Reaksi vanilin asam sulfat untuk pemeriksaan senyawa terpenoid

69 53 2. Identifikasi flavonoid Pemeriksaan senyawa flavonoid terhadap ekstrak metanol-air menggunakan fase diam selulosa. Selulosa digunakan dalam identifikasi flavonoid karena tidak mengandung logam pengotor bila dibandingkan dengan fase diam silika gel yang mengandung logam Si dan gugus hidroksil. Semakin besar jumlah gugus hidroksil pada senyawa maka akan semakin kuat senyawa itu ditahan oleh fase diam (Johnson, 1991) sehingga menyebabkan flavonoid tidak dapat ikut terelusi bersama fase gerak. Fase gerak yang digunakan yaitu n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v) diambil fase atasnya, sedangkan pembanding yang digunakan adalah rutin. Rutin merupakan suatu glikosida flavonol. Menurut Harborne (1987), kebanyakan senyawa fenol terutama flavonoid dapat dideteksi pada kromatogram berdasarkan warna atau fluoresensi di bawah sinar UV. Deteksi bercak dengan pereaksi uap ammonia menghasilkan bercak berwarna kuning (Wagner et al.,1984). Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak metanol air herba pegagan embun Bercak UV 365 nm Uap ammonia Rf Warna Rf Warna 1. Sampel 1. 0,86 Ungu 1. 0,86 Kuning 2. Rutin 1. 0,68 Ungu 1. 0,68 Kuning Hasil deteksi pada sinar UV 365 nm menunjukkan bahwa bercak-bercak sampel berfluoresensi menghasilkan warna ungu (lembayung gelap) dan setelah diuapi dengan ammonia berubah menjadi warna kuning dengan nilai Rf 0,86. Pada pembanding rutin juga ditemui warna bercak ungu (lembayung gelap) dan

70 54 setelah diuapi dengan ammonia berubah menjadi warna kuning dengan nilai Rf 0,68. Menurut Mursyidi (1990), glikosida flavonoid biasanya memberikan warna khas ungu tua yang kemudian berubah menjadi hijau kekuningan bila diuapi ammonia dengan nilai Rf 0,6-0,8. OH O - O + NH3 -NH 4 + O O O O O O - kompleks warna kuning Gambar 9. Reaksi dengan uap amonia untukpemeriksaan senyawa flavonoid Hasil uji KLT menunjukkan adanya kemiripan warna bercak dan nilai Rf antara sampel (ekstrak metanol-air) dengan pembanding rutin. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa ekstrak metanol-air mengandung flavonoid. Jenis flavonoid yang terdapat dalam ekstrak metanol-air yaitu glikosida flavonoid. Glikosida flavonoid mudah larut dalam pelarut dan campuran pelarut dengan air akan meningkatkan kelarutannya. Hal ini sesuai dengan pemilihan cairan penyari yang digunakan dan diharapkan kandungan flavonoid ini menunjukkan potensi sitotoksik karena mampu mematikan sel.

71 55 A B Gambar 11. Kromatogram ekstrak metanol-air herba pegagan embun untuk pemeriksaan senyawa flavonoid Keterangan : Fase diam : Selulosa Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5) a. Pembanding : rutin b. Sampel : ekstrak metanol-air herba pegagan embun A. Deteksi sinar UV 365 nm. B. Deteksi uap amonia

72 56 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Potensi toksik ekstrak dietil eter yang dinyatakan dengan nilai LC 50 sebesar 229 μg/ml dan ekstrak metanol-air sebesar 769 μg/ml. 2. Ekstrak dietil eter mempunyai potensi toksik lebih tinggi daripada ekstrak metanol-air (Meyer et al, 1982). Menurut Loomis (1978), ekstrak dietil eter bersifat cukup toksik & ekstrak metanol-air bersifat sedikit toksik. 3. Ekstrak dietil eter mengandung senyawa terpenoid (khususnya mono- & sesquiterpenoid) dan ekstrak metanol-air mengandung senyawa flavonoid B. Saran Perlu dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak dietil eter. Kemudian dari fraksi yang diperoleh dapat dilakukan uji sitotoksisitas menggunakan biakan sel kanker untuk mengetahui kemungkinannya sebagai senyawa antikanker.

73 57 DAFTAR PUSTAKA Albert, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter. P., 2002, Molecular Biology of The Cell, Fourth Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-17, Departemen Kesehatan Replubik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2002, Chemical compotition of two species of Hydrocotyle (Apiaceae), File : minijaj@usa.net. Diakses pada tanggal 22 Maret Anonim, 2006, Flavonoid, File : diakses pada tanggal 4 Mei Anonim, 2007, Kapsul Sarang Semut, File : diakses pada tanggal 14 April 2007 Backer, C.A., and Bakhuizen van den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol. II, 172, Noodoff, GGroningen, The Netherlands. Campbell, N.A., Recee, J.B., and Mitchell, L.G., 2002, BIOLOGY, diterjemahkan oleh Rahayu Lestari, Edisi 5, , Penerbit Erlangga, Jakarta. Carballo, J. Luis, Zaira, L.H., Perez, P., Garcia Gravalos, M.D., 2002, A comparison between two brine shrimp assay to detect in vitro cytoxicity in marine natural product, Diakses pada tanggal 10 Agustus Colis, B.M., Chemotheraphy of Cancer, Asian J Mod Med., 1874, 10; Dwiatmaka, Y., 2000, Skrining Tanaman Berkhasiat Antikanker dengan Metode BST dalam Yuswanto, (Eds), kanker, , Penerbit Sanata Dharma, Yogyakarta. Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, Alih bahasa Padmawinata, K., Soediro, I., 13, , Institut Tehnologi Bandung, Bandung. Ganong, W.F., 1995, Buku Ajar Fisiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh dr. Petrus Andrianto, Edisi 14, 22-29, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Johnson. L., Stevenson, 1991, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 56-57, Penerbit ITB, Bandung.

74 58 Katzung, B. E., Trevor, A. J., 1993, Pharmacology, Examination and Board Review, 4 th ed, 371, Prentice-Hall International Inc, USA. Loomis, T.A., 1978, Essential of Toxicology, Edisi III, diterjemahkan oleh Imono Argo Donatus, , IKIP Semarang, Semarang. Marby, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoid, 13, Springer Verlag, Berlin. Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 15-17, Penerbit ITB, Bandung. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., and McLaughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp : A Convinient General Bioassay Active Constituent, Planta Medica Volume 45, Mudjiman, A., 1989, Udang Renik Air Asin, 15-18, Bathara, Jakarta. Mudjiman, A., 1991, Makanan Ikan, 72-88, Penebar Swadaya, Jakarta. Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, , Penerbit UGM, Yogyakarta. Negara, A., 2003, Penggunaan Analisis Probit Untuk Pendugaan Tingkat Kepekaan Populasi Spodoptera Exigua Terhadap Deltametrin Di Daerah Istimewa Yogyakarta Diakses pada tanggal 12 Januari 2007 Oemarjati, B.S., dan Wardhana, W., 1990, Taksonomi Avertebrata, , Universitas Indonesia Press, Jakarta. Rajesh, D., Rachelle, A., Stenzel, and Howard, S.P., 2003, Perillyl Alcohol as a Radio/Chemosensitizer in Malignant Glioma Diakses pada tanggal 28 Juli 2007 Robinson, T., 1995, The Organic Constituent of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 71-71, , edisi VII, Penerbit ITB, Bandung. Silva, G.L., Lee, I.S., Kinghorn, A.D., 1998, Special Problem with the Extraction of Plants, in Cannel, R.J.R. (Ed), Natural Products Isolation, Humana Press Inc., Totowa, New Jersey,

75 59 Sirait, A.M., Soetiarto, F., Oemiati, R., 2003, Ketahanan Hidup Penderita Kanker Serviks di Rumah Sakit Dharmais Jakarta, Buletin Penelitian Kesehatan, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, DepKes RI, Jakarta, Siswandono dan Soekardjo, B., 2000, Kimia Medisinal, Edisi kedua, Airlangga Univercity Press, Surabaya. Solis, P.N., Wright, C.Q., Anderson, M.M., Gupta, M.P., and Phillipson, J.D., 1993, A Microwell Cytotoxicity Assay using Artemia salina (Brine Shrimp), Planta Medica Volume 59, Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-6, edisi VII, Penerbit ITB, Bandung. Tanu, I., 1998, Farmakologi dan Terapi, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta, Wagner, H., Brady, S., dan Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas, 8, 40-41, Springer Verlag, Berlin.

76 c.' fi*t L&dF4 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHAIIMA (bpus!r)r hi4a4 rdp. lo274j , 333e63 Fd (0274) 336s2e-r.rcsrm : sd sn yocya SURAT PENGESAHAN DETERMINASI No:!r /LKTO/Iai-USD/ d / 07 Laboralor ium Kc bun Tananra tr O bot Fak u lbs Famlsi Un ive6 ilrs S.nara Dhalma, ncntrhkd batrsa telah melakukan dcrcminasile adrp saru contoh ranaman. denge uma:!.lruc a 1t I e t i b t ha rp i o i.te s Lft k. (Pcsae.n Embun) Detcminasi lelah dilakukanecda benasesuai Backer,C.A..dd Backiruizen Vdn de Brink Jr., R.c't96J, ;lotu of Joa, vol. r,3-9, 25-26, N v.p. Nod.dho crcn ingen, Thc Nedolands. aacko.c.a,,md Backhuizen Vm dc Brirk lr., R.C.,t965,,rlrfa o/jo.4 Vot., l7t-t22, N.V.p. NNrdholi 6 ron insen, 'thc Ncdftands. Hins$ lclaeorir jenis Gpesies) Tar:man te^cbut dipak i drlam peneliri.n: ToksGibs Akut Ek$ok Mchnot Air dln Eksrak DiclilErcr Heda P.gdur [mbun(/trro.,,]/g sibltorpkides Lnk.) tcthtdtp /14euia satina Leaoi. Meia l{osa ImaBudi Cahyani Fakulbs Famasi UniveNiras Sanab Dhdma Hdbariur disimdon Laboanoium Biologi umun, F.&uliis F.m6i UnivcNilas Demikian su?t penbeentu deteminasi inidibu unruk dapat dipequnakm seblgoi t d'-*"on r.a,l

77 Lampiran 2. Foto tanaman pegagan embun

78 Lampiran 3. Foto aquarium untuk uji BST

79 Lampiran 4. Foto KLT untuk pemeriksaan terpenoid ekstrak dietil eter herba pegagan embun Keterangan : Fase diam : Silika gel GF 254 Fase gerak : Toluene-etil asetat (97:3 v/v) Sampel : ekstrak dietil eter herba pegagan embun Deteksi : vanillin asam sulfat (110 C, 10 menit)

80 Lampiran 5. Foto KLT untuk pemeriksaan flavonoid ekstrak metanol-air herba pegagan embun A B Keterangan : Fase diam : Selulosa Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5) a. Pembanding : rutin b. Sampel : ekstrak metanol-air herba pegagan embun A. Deteksi sinar UV 365 nm. B. Deteksi uap amonia

81 Lampiran 6. Analisis probit ekstrak dietil eter * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * Parameter estimates converged after 11 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. KONS,83893, ,00486 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1,98107, ,23635 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 1,510 DF = 3 P =,680 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Prob Number of Observed Expected KONS Subjects Responses Responses Residual, ,00 10,0 1,9 1,267,643 \, ,51 10,0 2,1 2,363 -,233, ,01 10,0 2,4 3,842-1,452, ,52 10,0 6,2 5,514,656, ,02 10,0 7,4 7,099,291

82 * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * Confidence Limits for Effective KONS 95% Confidence Limits Prob KONS Lower Upper,01,38764, ,30391,02,81916, ,90867,03 1,31684, ,35950,04 1,88201, ,78833,05 2,51637, ,24839,06 3,22218, ,76978,07 4,00218, ,37345,08 4,85953, ,07618,09 5,79774, ,89297,10 6,82071, ,83819,15 13,36626, ,03134,20 22,81528, ,21474,25 36, , ,68699,30 54, , ,45863,35 79, , ,14254,40 114, , ,30665,45 162, , ,26392,50 229, , ,32013,55 324, , ,30345,60 460, , ,34154,65 661, , ,64785,70 969, , ,18065, , , ,85099, , , ,33494, , , ,55573, , , ,8097, , , ,1125, , , ,7548, , , ,026, , , ,289, , , ,575, , , ,652, , , ,34, , , ,08, , , ,4

83 Probit Transformed Responses,8,6,4,2,0 -,2 -,4 -,6 Probit -,8-1,0 Rsq = 0,8566,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Log of KONS

84 Lampiran 7. Analisis probit ekstrak metanol-air * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * Parameter estimates converged after 12 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. KONS 1,82781, ,59785 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -5, , ,48413 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square =,037 DF = 3 P =,998 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * Observed and Expected Frequencies Prob Number of Observed Expected KONS Subjects Responses Responses Residual, ,40 10,0 1,8 1,861 -,021, ,70 10,0 3,8 3,661,139, ,00 10,0 5,7 5,824 -,084, ,30 10,0 7,6 7,759 -,149, ,60 10,0 9,2 9,047,103

85 * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * Confidence Limits for Effective KONS 95% Confidence Limits Prob KONS Lower Upper,01 41,05819, ,84696,02 57, , ,80507,03 71, , ,00096,04 84, , ,57399,05 96, , ,02072,06 108, , ,07727,07 119, , ,16915,08 131, , ,56897,09 142, , ,46459,10 153, , ,99291,15 208, , ,14275,20 266, , ,01691,25 328, , ,28681,30 397, , ,32588,35 473, , ,59996,40 559, , ,97956,45 656, , ,57345,50 769, , ,50655,55 901, , ,12049, , , ,66731, , , ,78230, , , ,48621, , , ,00235, , , ,02268, , , ,67747, , , ,73272, , , ,94437, , , ,71175, , , ,11172, , , ,29420, , , ,09251, , , ,83596, , , ,31315, , , ,50432, , , ,56126

86 Probit Transformed Responses 1,5 1,0,5 0,0 -,5 Probit -1,0 Rsq = 0,9975 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 Log of KONS

87 Lampiran 8. Cara perhitungan pembuatan seri konsentrasi larutan sampel herba pegagan embun a. Pembuatan larutan stok Larutan stok ekstrak metanol-air dipersiapkan sebagai larutan A dan larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental metanolair yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml metanol pa. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A dengan 10 ml metanol pa. Larutan stok ekstrak dietil eter juga dipersiapkan sebagai larutan A dan larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental dietil eter yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml dietil eter pa. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A dengan 10 ml dietil eter pa. b. Pembuatan seri konsentrasi untuk ekstrak metanol-air Untuk konsentrasi 250 µg/ml (0,25 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,25 mg/ml 5 ml x 0,25 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,125 ml Untuk konsentrasi 500 µg/ml (0,50 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,50 mg/ml 5 ml x 0,50 mg/ml V 1 = mg/ml = 0,25 ml V 1

88 Untuk konsentrasi 1000 µg/ml (1 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 1 mg/ml 5 ml x 1 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,5 ml Untuk konsentrasi 2000 µg/ml (2 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 2 mg/ml 5 ml x 2 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 1 ml Untuk konsentrasi 4000 µg/ml (4 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 4 mg/ml 5 ml x 4 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 2 ml c. Pembuatan seri konsentrasi untuk ekstrak dietil eter Untuk konsentrasi 10 µg/ml (0,01 mg/ml): Diambil dari larutan B V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,01 mg/ml 5 ml x 0,01 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,05 ml

89 Untuk konsentrasi 32 µg/ml (0,032 mg/ml): Diambil dari larutan B V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,032 mg/ml 5 ml x 0,032 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,16 ml Untuk konsentrasi 102 µg/ml (0,102 mg/ml): Diambil dari larutan B V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,102 mg/ml 5 ml x 0,102 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,5 ml Untuk konsentrasi 328 µg/ml (0,328 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,328 mg/ml 5 ml x 0,328 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,16 ml Untuk konsentrasi 1049 µg/ml (1,049 mg/ml): Diambil dari larutan A V 1 x C 1 = V 2 x C 2 V 1 x 10 mg/ml = 5 ml x 1,049 mg/ml 5 ml x 1,049 mg/ml V 1 = mg/ml V 1 = 0,52 ml

90 BIOGRAFI PENULIS Maria Rosa Irma Budi Cahyani dilahirkan di Magelang, Jawa Tengah pada tanggal 2 Oktober 1984 sebagai putri kedua dari pasangan YB. Sudono dan Lea Budiningsih. Penulis menempuh pendidikan di Taman Kanak-Kanak St. Theresia Muntilan pada tahun , dan pada tahun 1997 menyelesaikan pendidikan di Sekolah Dasar Marsudirini Mater Dei Muntilan. Pada tahun , penulis menempuh pendidikan di Sekolah Menengah Pertama Negri I Muntilan, dan melanjutkan ke Sekolah Menengah Umum Stella Duce II Yogyakarta pada Pada tahun 2003, penulis,melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu (S1) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.