Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas

Transkripsi

1 Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu campuran senyawa. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tetap tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuranyang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, tetapi pada praktikum Farmakognosi II yang digunakan hanya 2 jenis kromatografi yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Oleh karena itu, pada makalah ini hanya akan dijelaskan kedua kromatografi tersebut. 1.2 Rumusan Masalah/Topik Bahasan

2 1. Apakah pengertian dari kromatografi? 2. Apakah macam-macam dari kromatografi? 1.3 Tujuan 1. Untuk mengetahui pengertian dan cara kerja dari kromatografi. 2. Untuk mengetahui macam-macam dan cara kerja masing-masing kromatografi. BAB II PEMBAHASAN 2.1 Pengertian Kromatografi Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk pemisahan tertentu. Cara ini dikenalkan oleh TSWETT, ia telah menggunakan untuk pemisahan senyawa senyawa yang berwarna, dan nama kromatografi diambillkan dari senyawa yang berwarna. Meskipun demikian pembatasan untuk senyawa- senyawa yang berwarna tak lama dan hampir kebanyakan pemisahan pemisahan secara kromatografi sekarang diperuntukkan pada senyawa senyawa yang tak berwarna (Sastrohamidjojo, 1985). Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam

3 kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009). Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan - perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam (fase stationer) dan fase gerak (fase mobil).fase gerak membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004). Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sifatsifat dari senyawa, yaitu : 1) kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan) 2) kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk padat (absorbsi) 3) kecenderungan suatu molekul untuk menguap Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan cara berikut (Dirjen POM, 1979) : 1. Pengamatan langsung, jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet. 2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas disemprotkan dengan pereaksi yang dapat membuat bercak tersebut tampak. 3. Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau tekhnik otoradiografi, jika zat radioaktif. 4. Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium pembiakan yang tealh ditanami, untuk melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri. 2.2 Macam-macam Kromatografi

4 Pembagian ini selanjutnya dapat dibagi lagi seperti telihat pada skema berikut: KROMATOGRAFI : 1. Kromatografi Gas a. GLC b. GSC 2. Kromatografi Cair a. HPLC b. LLC-PC c. LSC-TLC, Kolom d. Ion Excange e. Ekslusi : - GP - GF Keterangan GLC GSC LLC LSC PC TLC GP GF HPLC = Gas Liquid Chromatography = Gas Solid Chromatography = Liquid Liquid Chromatography = Liquid Solid Chromatography = Paper Chromatography = Thin Layer Chromatography = Gel Permeation = Gel Filtration = High Performance Liguid Chromatography 1. Liquid Liquid Chromatography (LLC)

5 LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak. 2. Liquid Solid Chromatography (LSC) LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini. 3. Ion-exchange chromatography Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion. Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang digunakan dapat dipisahkan. 4. Exclusion chromatography Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM). 5. HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang dan walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium. Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :dua macam

6 a) Kromatografi Cair Retensif Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup fase normal, fase terbalik, dan kromatografi ion. b) Kromatografi Cair Non-retensif Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe.ini dikenal sebagai kromatografi ekslusi. 6. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi penukar ion, kromatografi penyaringan gel, dan elektroforesis. a. Kromatografi Lapis Tipis. Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat

7 yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda (Dirjen POM, 1979, hal. 782). Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok ( gambar 2). Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) (gambar 2). Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponenkomponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Gambar 1. Bejana berisi KLT sebelum pengembangan Gambar 2 : bejana berisi plat KLT sebelum pengembanga. Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai

8 pemisahan. Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan, atmosfer bejana dan lain- lain. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hrf. Rf = Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awal Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hrf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hrf lebih tinggi dari hrf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hrf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (Stahl 1985). Sifat sifat umum dari penyerap- penyerap untuk kromatografi lapis tipis adalah mirip dengan sifat sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat penting dar penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 25 mikron. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus. Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan diberi nama dengan kode silika gel G (Sastrohamijojo 1985).

9 Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang kelompok kandungan kimianya telah diketahui. Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain : 1. Alkaloid 2. Antraglikosida 3. Arbutin 4. Glikosida Jantung 5. Zat pahit 6. Flavonoid 7. Saponin 8. Minyak atsiri 9. Kumarin dan asam fenol karboksilat 10. Valepotriat Penyediaan larutan zat yang diperiksa 1. Alkaloid Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian dibasahi dengan 1 ml amonia encer P. Bahan disari dengan 5 ml metanol P dilakukan dengan cara dikocok pada suhu 60 C selama 15 menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT. 2. Antraglikosida, Arbutin, zat pahit dan flavonoid Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P. penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT. 3. Saponin

10 Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P. penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Sari diuapkan sampai diperoleh 1 ml, kemudian ditambah dengan 0,5 ml air dan 3 ml butanol P, sambil dikocok. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT. 4. Glikosida Jantung Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P 50 % dan 10 ml larutan timbal (II) asetat LP. Campuran dipanaskan di atas tangas air selama 10 menit. Filtrat setelah dingin disari 2 kali, masing-masing dengan 10 ml diklormetana P. Sari dikumpulkan, kemudian diuapkan. Sisa dilarutkan dalam campuran diklormetana P dan metanol P. (1:1). Filtrat sebanyak 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT. 5. Minyak atsiri, Kumarin, asam fenol karboksilat dan valepotriat Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 10 ml diklormetana P. Penyarian dilakukan dengan cara direfluks 15 menit. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan sampai kering. Sisa dilarutkan dalam 1 ml toluena P. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT. Lempeng KLT Lempeng yang digunakan lempeng silikagel 254P dengan ukuran 10 cm x 10 cm. Lempeng dapat berupa lempeng kaca atau lempeng lain yang cocok. Untuk menentukan kelompok kandungan kimia suatu simplisia sekurang-kurangnya diperlukan 10 lempeng. Cairan elusi 1. Dietil eter- toluene (1:1) Cairan elusi dijenuhkan dengan larutan asam setat P 10% digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung Kumarin.

11 2. Kloroform- etanol-asam asetat glasial (94:5:1) Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang diduga mengandung minyak atsiri. 3. Kloroform-metanol-air Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung saponin. 4. Toluene-etil asetat-dietilamin (70:20:10) Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung alkaloid. Pereaksi penampak Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat. 1. Anisaldehid-asam sulfat P Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain. 2. Dragendroof Untuk mengamati alkaloid. 3. Antimon (III) klorida Untuk mengamati glikosida jantung, saponin (Ditjen POM 1987). b. Kromatografi kertas Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini sangat sederhana. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-

12 air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut. Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas). Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau nodayang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksiyang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.

13 Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal Jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu: 1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf. 2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran. 3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf. 4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi. 5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka. c. Kromatografi Penukar Ion Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. d. Kromatografi Penyaringan Gel

14 Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. e. Elektroforesis Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. 2.3 Peranan Kromatografi dalam Pembelajaran Di dalam pembelajaran sains, kromatografi berperan sebagai alat penunjang dalam pembelajaran. Khususnya dalam hal, teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut. 2.4 Penyimpanan Kromatografi Dalam hal ini, penyimpanan kromatografi sebaiknya ditempatkan pada tempat yang kering tidak pada tempat yang lembab. Idealnya diletakkan pada posisi yang siap untuk digunakan (tidak dipindah atau dipindah ditempat lain). Hal ini memungkinkan memperpanjang usia alat. Pemindahan atau merakit ulang alat memungkinkan terjadinya kesalahan atau gangguan terhadap fungsi alat. BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan 1. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

15 2. Jenis-jenis kromatografi ialah a. Liquid Liquid Chromatography (LLC) b. Liquid Solid Chromatography (LSC) c. Ion-exchange chromatography d. Exclusion chromatography e. HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). i. Kromatografi Cair Retensif ii. Kromatografi Cair Non-retensif 3. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi penukar ion, kromatografi penyaringan gel, dan elektroforesis. DAFTAR PUSTAKA Dirjen POM, (1979), Farmakope Indonesia Edisi III, Departemen Kesehatan RI, Jakarta Khopkar, S.M Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta. Rohman, (2009), Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta Sastrohamidjojo Hardjono, (1985 ), Kromatografi, Edisi kedua, Liberty, Yogyakarta Saifuddin Azis et all.,(2011), Standarisasi Bahan Obat Alam Edisi Pertama, Graha Ilmu, Yogyakarta Stahl Egon, (1985), Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung.

16 Underwood Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga. Jakarta KROMATOGRAFI KERTAS Juli 17, 2009annisanfushie Semester 4 15 Komentar LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK II PERCOBAAN V KROMATOGRAFI KERTAS NAMA NIM : ANNISA SYABATINI : J1B KELOMPOK : 1 ASISTEN : SYANA ASRI N PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM I. TUJUAN PERCOBAAN UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT BANJARBARU 2009 PERCOBAAN V KROMATOGRAFI KERTAS Tujuan percobaan praktikum ini adalah untuk mempelajari Ag(I) dan Pb(II) dengan menggunakan metode kromatografi kertas. II. TINJAUAN PUSTAKA

17 Pada awalnya kromatografi dianggap semata-mata sebagai bentuk partisi cairan cairan. Serat selulosa yang hidrofilik dari kertas tersebut dapat mengikat air, setelah disingkapkan ke udara yang lembab, kertas saring yang tampak kering itu sebenarnya dapat mengandung air dengan persentase tinggi, katakan 20 % (bobot/bobot) akan lebih. Jadi kertas itu sebenarnya dapat mengandung air dengan persentase tinggi dan kertas itu dipandang sebagai analog dengan sebatang kolom yang berisi stasioner berair. Zat-zat terlarut itu padahal fase geraknya dapat campur dengan air akan dalam beberapa kasus, malahan fase geraknya adalah larutan itu sendiri (Day & Underwood, 1980). Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai tempat untuk mengalirkannya fase bergerak. Berbagai macam tempat kertas secara komersil tersedia adalah Whatman 1, 2, 31 dan 3 MM. Kertas asam asetil, kertas kieselguhr, kertas silikon dan kertas penukar ion juga digunakan. Kertas asam asetil dapat digunakan untuk zat zat hidrofobik (Khopkar, 1990). Selain kertas Whatman dalam teknik kromatografi dapat pula digunakan kertas selulosa murni. Kertas selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca. Untuk memilih kertas, yang menjadi pertimbangan adalah tingkat dan kesempurnaan pemisahan, difusivitas pembentukan spot, efek tailing, pembentukan komet serta laju pergerakan pelarut terutama untuk teknik descending dan juga kertas seharusnya penolak air. Seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas lainnya. Pengotor yang terdapat pada kertas saring adalah ion-ion Ca 2+, Mg 2+, Fe 3+, Cu 2+ (Basset, 1994). Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap. Pada kromatografi kertas naik, kertasnya digantungkan dari ujung atas lemari sehingga tercelup di dalam solven di dasar dan solven merangkak ke atas kertas oleh daya kapilaritas. Pada bentuk turun, kertas dipasang dengan erat dalam sebuah baki solven di bagian atas lemari dan solven bergerak ke bawah oleh daya kapiler dibantu dengan gaya gravitasi. Setelah bagian muka solven selesai bergerak hampir sepanjang kertas, maka pita diambil, dikeringkan dan diteliti. Dalam suatu hal yang berhasil, solut-solut dari campuran semula akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan kecepatan yang berbeda, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Apabila senyawa berwarna, tentu saja nodanodanya dapat terlihat (Day & Underwood, 1990). Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona realtif terhadap garis depan pengembang. Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh nilai-nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan oleh hubungan: Rf = Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona Jarak (cm) dari garis awal ke garis depan pelarut

18 Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan (pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan menunjukkan identitas suatu zat yang dicari, contohnya asam amino dan intensitas zona itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan noda-noda standar (Khopkar, 1990). Proses pengeluaran asam mineral dari kertas desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2 3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakan didalam ruangan yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai. Terdapat tiga tehnik pelaksanaan analisis. Pada tehnik ascending; pelarut bergerak keatas dengan gaya kapiler. Sedangkan ketiga dikenal dengan cara radial atau kromatografi kertas sirkuler (Basset, 1994). Kromatografi bergantung pada pembagian ulang molekul-molekul campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi absorpsi, kromatografi partisi cairan dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya komatografi kolom), kromatografi kertas dan lapisan tipis ( Svehla, 1979). Distribusi dapat terjadi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu pendukung, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastik (Basset, 1994). III. ALAT DAN BAHAN A. Alat Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah botol penyemprot, tabung gelas, penutup tabung gelas, pipa kapiler, penggaris, gunting, pensil, pipet tetes. 1. B. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah kertas Whatman no. 1 ukuran cm, larutan cuplikan 1 dan 2, larutan blanko 1 (Ag(I)) dan banko 2 (Pb(II)), larutan KI, larutan dikromat dan larutan asam asetat : air (1:1). 1. IV. PROSEDUR KERJA 1. Kertas Whatman no.1 dengan ukuran 12 x 25 cm disiapkan dan ditarik batas (dengan pensil) kira-kira 2 cm dari pinggir kertas. 2. Kertas dibagi menjadi 4 kolom dan diberi nomor pada tiap kolom.

19 3. Kolom 1 dan 3 ditetesi dengan cuplikan A dan B, dan kolom 2 dan 4 dengan larutan baku Ag (I) dan Pb (II). 4. Larutan pengembang disiapkan yang berisis dengan 12,5 ml larutan asam asetat:air (1:1). 5. Kertas ditempatkan dalam ruang pengembang, dijaga agar larutan pengembang tidak menyentuh cuplikan dan ditutup ruang pengembang. 6. Kertas diambil dari dalam larutan pengembang apabila kertas telah menyerap larutan pengembang hingga ¾-nya. 7. Pada kertas diberi tanda batas larutan pengembang dengan menggunakan pensil dan kertas dikeringkan. 8. Setiap dua buah kolom digunting dan disemprot dengan pereaksi pengenal. Larutan Ag (I) dengan dikromat menghasilkan warna merah dan Pb (II) dengan KI menghasilkan warna kuning. 9. Jarak perpindahan dari tiap komponen diukur dan dihitung nilai Rf nya. 1. V. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil dan Perhitungan 1. Hasil

20 No. Langkah percobaan Hasil pengamatan Kertas saring diukur, dititolkan cuplikan Ke dalam lar. Asam oksalat dimasukkan : Aquades:air (1:1), ditunggu larutan naik ¾ kertas whatman Kertas whatman dikeringkan, digunting setiap 2 kolom, disemprot dengan pereaksi pengenal Ag(I)+dikromat à merah Pb(II)+KI à kuning A Ag B Pb A Ag B Pb Pelarut A = 6,5 cm Ag = 6,5 cm B = 6,3 cm Pb = 6,3 cm Komponen A = 5,3 cm Ag = 5,6 cm B = 5,6 cm Pb = 5,8 cm

21 Perhitungan Diketahui : Kolom A: jarak komponen tertentu = 5,3 cm jarak gerak pelarut = 6,5 cm Kolom Ag: jarak komponen tertentu = 5,6 cm jarak gerak pelarut = 6,5 cm Kolom B: jarak komponen tertentu = 5,6 cm jarak gerak pelarut = 6,3 cm Kolom Pb: jarak komponen tertentu = 5,8 cm jarak gerak pelarut = 6,3 cm Ditanya : Nilai Rf cuplikan dan larutan standar? Jawab: Rf = 1. Rf larutan cuplikan Rf cuplikan A = = 0,8154 Rf cuplikan B = = 0,8889 Rf = 1. Rf larutan standar Rf larutan Ag (I) = = 0,8615 Rf larutan Pb (II) = = 0,9206 B. Pembahasan Dalam percobaan ini digunakan kertas kromatografi sebagai medium penyerapan larutan pengembang. Kertas tersebut diukur dan dibagi menjadi empat bagian. Pada kolom 1 sampai kolom empat secara berturut-turut ditetesi dengan cuplikan; larutan Ag (I); cuplikan; larutan Pb (II) dengan menggunakan mikro pipet. Setelah kering, kertas dicelupkan dalam larutan pengembang yang berisi 12,5 ml larutan asam asetat dalam air dengan perbandingan 1:1. Senyawa-senyawa yang akan dideteksi berupa blanko yang mengandung Ag(I) dan blanko 2

22 mengandung Pb(II) serta sampel 1 dan sampel 2 yang kemungkinan mengandung kedua senyawa diatas. Logam-logam Ag dan Pb dapat dipisahkan melalui perbedaan Ksp nya sebagai garam klorida, AgCl dan PbCl 2, karena ion-ion logam ini memiliki sifat yang polar yang dapat larut dalam pelarut-pelarut polar seperti air. Karenanya dalam pemisahan dengan metode kromatografi kertas ini digunakan ion-ion logam yang merupakan logam golongan I. Dalam percobaan ini digunakan metode ascending, dimana pelarut maupun komponen akan teradsopsi dan bergerak ke atas dengan gaya kapiler pada kertas kromatografi, berlawanan dengan gaya gravitasi hingga ¾ bagian dari panjang kertas kromatografi tersebut. Dari hasil percobaan didapatkan jarak gerak pelarut atau larutan pengembang pada kolom satu sampai dengan kolom empat secara berurutan yaitu sebesar 6,5 cm; 6,5 cm; 6,3 cm; 6,3 cm. Kertas kromatografi tersebut dikeringkan dan dibagi menjadi 2 bagian, bagian pertama terdiri dari kolom 1 dan 2, sedangkan bagian kedua terdiri dari kolom 3 dan 4. Kolom 1 dan 2 diuji dengan menyemprotkan larutan dikromat pada potongan kertas kromatografi. Sedangkan kolom 3 dan 4 diuji dengan menyemprotkan larutan KI pada potongan kertas kromatografi yang kedua. Penyemprotan dilakukan dengan hati-hati karena larutan tersebut cukup berbahaya. Jarak titik atau noda yang terbentuk setelah melalui proses penyemprotan dengan larutan pengenal dikromat dan KI yang tampak pada kertas kromatografi secara berurutan sebesar 5,3 cm; 5,6 cm; 5,6 cm; 5,8 cm. Penyemprotan dengan larutan dikromat menghasilkan noda berwarna orange kemerahan, sedangkan dengan larutan KI menghasilkan noda warna orange. Dari hasil warna tersebut maka diketahui bahwa pada cuplikan 1 terkandung ion-ion logam Ag(I), sesuai dengan senyawa yang terkandung dalam blanko 1. Sedangkan pada cuplikan 2 terbukti mengandung ion-ion logam Pb(II), seperti dalam larutan blanko 2 yang mengandung ion logam Pb(II). Reaksi yang terjadi pada sampel 1: 2 Ag + CH 3 COOH AgOH + CH 3 COOH AgOH Ag + + OH Ag CrO 4 Ag 2 CrO 4 merah Sedangkan pada sampel 2 yaitu: Pb CH 3 COOH Pb(OH) 2 + (CH 3 COO) 2 Pb Pb(OH) 2 Pb OH Pb KI PbI 2 kuning

23 Berdasarkan hasil perhitungan, didapatkan besarnya harga Rf untuk cuplikan 1 dan larutan Ag (I) adalah 0,8154 berwarna kuning dan 0,8615. Sedangkan besar Rf pada cuplikan 2 dan larutan Pb (II) yaitu sebesar 0,8889 berwarna kuning dan 0,9206. VI. KESIMPULAN Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini adalah: 1. Kromatografi kertas merupakan kromatografi dengan menggunakan kertas penyaring sebagai penunjang fase diam dan fase bergerak, berupa cairan yang terserap di antara struktur pori kertas. 2. Dalam cuplikan 1 terkandung ion-ion logam Ag(I), sesuai dengan senyawa yang terkandung dalam blanko 1. Sedangkan dalam cuplikan 2 terkandung ion-ion logam Pb(II), seperti pada blanko 2 yang mengandung ion logam Pb(II). 3. Besarnya harga Rf untuk cuplikan 1 dan larutan Ag (I) adalah 0,8154 dan 0, Besar Rf pada cuplikan 2 dan larutan Pb (II) yaitu sebesar 0,8889 dan 0,9206. DAFTAR PUSTAKA Basset, J, et al Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit buku kedokteran EGC. Jakarta. Day & Underwood Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta. Khopkar, S.M Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Svehla, G Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semi Mikro Jilid 1 Edisi Kelima. PT. Kalman Media Pustaka. Jakarta. Kromatografi Lapis Tipis BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan

24 untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Roy, 1991). Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda (Anggraeni, Megawati, 2009). Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa ( Sudarmadji, 2007 ). Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmenpigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat. Pada kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan fase bergerak ( mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Sudarmadji, 2007). Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (Gandjar, 2008). Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya menggunakan lapis tipis silica atau alumina yang seragam pada sebuah lempengan gelas atau logam atau plastic yang keras. Gel silica atau

25 alumina mengandung substansi dimana substansi tersebut dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina (aluminum oksida). Sedangkan fase gerak kromatografi disebut juga dengan eluent. Eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Pemisahan komponen sangat dipengaruhi oleh adanya interaksi antara adsorbent dan eluen. Dalam kromatografi lapis tipis, eluen biasanya disebut sebagai larutan pengembang ( Kantasubrata, 1993 ). Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan 2 sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat di jadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila di identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya berbeda, senyawa tersebut dapat di katakan merupakan senyawa yang berbeda (Lipsy, 2010) Perumusan Masalah Rumusan masalah dalam makalah ini antara lain: Apa pengertian kromatografi lapis tipis? Bagaimana prinsip kerja kromatografi lapis tipis? Bagaimana prosedur kerja pada pemisahan sampel menggunakan kromatografi lapis tipis? Apa saja fase diam dan fase gerak dalam kromatografi lapis tipis? Apa saja kelebihan dari kromatografi lapis tipis? Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam dunia farmasi? 1.3. Tujuan Penulisan Tujuan dari penulisan makalah ini adalah agar mahasiswa dapat memahami mengenai kromatografi lapis tipis sehingga dapat mengaplikasikannya.

26

27 BAB II PEMBAHASAN 2.1. Pengertian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya pembedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Atau secara sederhana kromatografi biasanya juga di artikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi di gunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip ini. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin di deteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika-kimia dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam (bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat gelas atau lapisan yang cocok. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) lalu hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf-nya paling kecil. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang. Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen (fase gerak) untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut: Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf juga disebut factor referensi. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga R f adalah :

28 Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya. Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekulmolekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga R f meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap. Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan. Teknik percobaan. Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan). Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga R f. Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahanperubahan fase. Kesetimbangan. Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah. jika

29 Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairanpadatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap. Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisiposisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. Gambar : Bercak yang ditimbulkan oleh sinar UV Gambar : Sebelum dan sesudah di lakukannya kromatografi pada plat KLT 2.2. Prinsip Kerja KLT Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus

30 fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul. Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLT Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan gel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika. Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Pada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan setetes larutan campuran

31 ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fase gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut. Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda. Gambar tersebut menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Jarak yang ditempuhpelarut Untuk identifikasinya dapat di gunakan harga R f meskipun harga-harga R f dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya pada kertas harga R f didefinisikan sebagai berikut : Harga-harga R f untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga R f yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga R f untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.

32 2.4. Fase Diam dan Fase Gerak KLT Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Fase Diam Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Fase Gerak Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada: Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :

33 Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Hanya membutuhkan sedikit pelarut. Waktu analisis yang singkat (15-60 menit) Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan). Preparasi sample yang mudah Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin Kebutuhan ruangan minimum Analisis KLT banyak digunakan karena : Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampel Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal Aplikasi Metode KLT Dalam Bidang Farmasi Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki. Setiap komponen memiliki harga R f sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO 4 dalam H 2 SO 4 yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu.

34 Noda kemudian dihitung harga Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.