PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI UMUM

Transkripsi

1 PENUNTUN PRAKTIKUM PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI MIKROBIOLOGI UMUM Hafsan, S.Si., M.Pd. Eka Sukmawaty, S.Si., M.Si. Dr. Mashuri Masri, S.Si., M,kes LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI N PURWOKERTO 2008 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR 2016 i

2 KATA PENGANTAR Alhamdulillah, kami panjatkan rasa syukur kepada Allah SWT karena hanya dengan taufiq dan hidayahnya sehingga penyusunan Penuntun Praktikum Mikrobiologi ini telah terselesaikan dan kini dapat dipergunakan. Kami sangat menyadari bahwa penuntun ini masih sangat jauh dari kesempurnaan, sehingga kepada para pengguna/pembaca yang arif, sangat diharapkan saran-saran yang konstruktif demi kesempurnaan tulisan berikutnya. Penyelesaian penuntun ini tak lepas dari peran serta berbagai pihak. Kepada pihak yang telah membantu proses penyusunan penuntun ini yang kesemuanya tidak dapat disebutkan satu persatu, kami mengucapkan banyak terimakasih. Semoga segenap aktivitas kita bernilai ibadah di sisinya. Amin Samata, September 2016 Tim Penyusun i

3 TATA TERTIB PRAKTIKUM Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi dan terkena khemikalia Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah disediakan oleh asisten. Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan dengan seksama. ii

4 DAFTAR ISI KATA PENGANTAR... i TATA TERTIB PRAKTIKUM... ii DAFTAR ISI.. iii PENGENALAN ALAT... 1 MEDIA PERTUMBUHAN STERILISASI ISOLASI MIKROBA MORFOLOGI MIKROBA FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME ANALISA COLIFORM BERDASARKAN NILAI MPN ANALISA Staphylococcus aureus PADA BAHAN PANGAN UJI BIOKIMIA (UJI IMVIC) DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME PENGUKURAN KADAR PROTEIN MIKROBA ISOLASI BAKTERIOFAGE DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN iii

5 PENGENALAN ALAT A. Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal: Alat-alat elektrik Mikroskop cahaya Mikroskop stereo Autoklaf elektrik Incubator Hot plate & stirrer Colony counter Biological Safety Cabinet (BSC) Mikropipet Alat-alat gelas dan keramik Cawan Petri Pipet ukur Pipet tetes Tabung reaksi Labu Erlenmeyer Glass beads Mortar & pestle Beaker glass Buncen burner Gelas ukur Batang L / Drugalsky Tabung durham Alat-alat non gelas Jarum inokulum / ose Pinset Rubber bulb ph meter universal 1

6 B. Dasar Teori Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1 mm. berikut merupakan uraian tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi. Bagian-bagian Mikroskop: 1. Eyepiece / oculars (lensa okuler) Untuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa objektif 2. Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif) Untuk memutar objektif sehingga mengubah perbesaran 3. Observation tube (tabung pengamatan / tabung okuler) 4. Stage (meja benda) Spesimen diletakkan di sini 5. Condenser (condenser) Untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa objektif 6. Objective lense (lensa objektif) Memperbesar spesimen 7. Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu) Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu 8. Main switch (tombol on-off) 9. Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter) Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri 10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar) 11. Specimen holder (penjepit spesimen) 12. Illuminator (sumber cahaya) 13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal) Untuk menaikkan atau menurunkan objectglass 14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke kanan / kiri objek glas 15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar) Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat 2

7 Fine focus knob (sekrup fokus halus) Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler) Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser) Untuk menaik-turunkan kondenser Prosedur Operasi 1. Menyalakan lampu a. tekan tombol on (8) b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7) 2. Menempatkan spesimen pada meja benda a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika meja benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15) b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan horizontal (13) dan (14) 3. Memfokuskan a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus b. Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2) pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan fokusnya c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa objektif jika okus telah didapatkan Perbesaran objektif 4x Jarak 29 A (mm) 10x 6,3 40x 60x 0,53 0,29 Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu, misal 40x, dan ingin memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak perlu diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass dengan lensa objektif (lihat tabel diatas). Tambahan a. Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan mata 3

8 b. c. Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh) Perbesaran total Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif (40x) = 400x Penggunaan minyak imersi Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang (λ) pendek. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 a. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke perbesaran objektif 100x b. tetesi minyak imersi 1 2 tetes dari sisi lensa c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x dengan kertas lensa yang dibasahi xilol Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope) Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur. Berikut merupakan uraian tentang mikroskop stereo yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi yaitu Zoom Stereo Microscope, Olimpus SZ Ocularseyepiece (lensa okuler) 2. Diopter adjustment ring (cincin pengatur diopter) 3. Zoom control knob (sekrup pengatur pembesaran) 4

9 4. Focusing knob (sekrup pengatur fokus) 5. Stage plate (pelat tempat specimen diletakkan) 6. Stage clip (penjepit spesimen / preparat) Prosedur operasi 1. Letakkan spesimen / preparat di stage plate (5), jepit jika perlu 2. Atur perbesaran pada perbesaran terkecil dengan memutar Zoom Control Knob (3) kemudian dicari fokusnya dengan memutar Focusing Knob (4) 3. Jika ingin mendapatkan bayangan yang lebih besar, putar Zoom Control Knob (3) ke perbesaran yang lebih tinggi kemudian dicari fokusnyamikroskop ini memiliki pilihan perbesaran: Okuler Objektif total 0,67 x 6,7 x 0,9 x 9x 1x 10 x 2x 20 x 4x 40 x 10 x Autoklaf (Autoclave) Diagram autoklaf vertical 1. Tombol pengaturwaktu mundur (timer) 2. Katup pengeluaran uap 3. pengukur tekanan 4. kelep pengaman 5. Tombol on-off 6. Termometer 7. Lempeng sumber panas 8. Aquades (dh2o) 9. Sekrup pengaman 10. batas penambahan air Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. Cara Penggunaan : 5

10 1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. 2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus dikendorkan. 3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. 4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. 5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. 6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hatihati. Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC.. Hot plate stirrer dan Stirre bar Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC. Colony counter Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat bergunauntuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset. Biological Safety Cabinet 6

11 Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan. Prosedur penggunaan BSC seri 36212, Purifier Biological Safety Cabinet dari LABCONCO yang dimiliki laboratorium mikrobiologi adalah sebagai berikut: 1. Hidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya matikan segera sebelum mulai bekerja 2. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah 3. Nyalakan lampu neon dan blower 4. Biarkan selama 5 menit 5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 % 6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % atau desinfektan yang cocok dan biarkan menguap 7. masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan 8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril 9. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi gunakan yang berbahan bakar gas. 10. Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja 11. setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari BSC 12. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap lalu tangan dibasuh dengan desinfektan 13. Matikan lampu neon dan blower Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. Dalam penggunaannya mikropipet memerlukan tip. 7

12 Mikropipet tip Cara Penggunaan : 1. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. 2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet. 3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam lagi. 4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm. 5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob maka cairan akan masuk ke tip. 6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan. 7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip. 8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar. Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. 8

13 Pipet Ukur (Measuring Pippete) Pipet ukur merupakan alat untuk memindahkan larutan dengan volume yang diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran kapasitas pipet ukur, diantaranya pipet berukuran 1 ml, 5 ml dan 10 ml. Cara penggunaanya adalah cairan disedot dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai dengan volume yang diingini. Volume yang dipindahkan dikeluarkan menikuti skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar. Pipet tetes (Pasteur Pippete) Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH saat mengatur ph media, penambahan reagen ada uji biokimia, dll. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar ml tiap tabung. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask) Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb. Gelas ukur (GraduatedCylinder) Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan. 9

14 ) Batang L (L rod) Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga disebut spreader. Mortar dan Pestle Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan, misal daging, roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut. Beaker Glass Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media media, menampung akuades dll.. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang 10

15 berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol. Glass Beads GlassBeads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan agar dan digoyang merata. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang fungsinya sama dengan batang L atau Spreader. Tabung Durham Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat metabolisme pada bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara). Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar untuk preprasi Heinrich s Slide Culture. Pinset Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik. ph Indikator Universal Berguna untuk mengukur/mengetahui ph suatu larutan. Hal ini sangat penting dalam pembuatan media karena ph pada media berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas ph indikator dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna acuan. Pipet Filler / Rubber Bulb Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada pangkal pipet ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari gelembung. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari 11

16 ujung pipet akan tersedot ke atas. Kemudian katup E (exhaust) berfungsi untuk mengeluarkan cairan dari pipet ukur. 12

17 MEDIA PERTUMBUHAN A. Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar dan Potato Dextrose Agar Media pertumbuhan : a. Pengertian dan fungsi b. Bahan-bahan media pertumbuhan b.1 Bahan dasar b.2 Nutrisi atau zat makanan b.3 Bahan tambahan b.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media c. Macam-macam media pertumbuhan c.1 Berdasarkan sifat fisik c.2 Berdasarkan komposisi c.3 Berdasarkan tujuan d. Pembuatan NutrientAgar dan NutrientBroth e. Pembuatan PotatoDextroseAgar Dasar Teori Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. Bahan-bahan media pertumbuhan 1. Bahan dasar air (H2O) sebagai pelarut agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45 C. gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar. Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat. 2. Nutrisi atau zat makanan 13

18 Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/trace element. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Vitamin-vitamin. 3. Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenolred (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan ph akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. 4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada ph yang asam Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya. Meatextract. Meatextract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan daging sapi. Yeastextract. Yeastextract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B complex). Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%. Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. Medium berdasarkan sifat fisik Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.. 14

19 Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (NitrogenfreeBromthymolBlue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media NitrateBroth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (NutrientBroth), LB (LactoseBroth). 2. Medium berdasarkan komposisi Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.. 3. Medium berdasarkan tujuan Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi 15

20 membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll. Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser s Citratemedium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.. Prosedur Kerja: Pembuatan Nutrient Agar dan Nutrient Broth Pembuatan Nutrient Agar Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: Beefextract 3g Peptone 5g Agar 15 g Akuades s.d 1000 ml Akuades sebanyak 100 ml dibagi menjadi dua satu bagian untuk melarutkan Beefextract dan peptone dan sebagian lagi untuk melarutkan agar. Sebaiknya air untuk melarutkan agar lebih banyak Larutkan agar pada sebagian air tersebut dengan mengaduk secara konstan dan diberi panas. Dapat menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer (jangan sampai overheat, karena akan terbentuk busa dan memuai sehingga tumpah). Sementara itu sebagian akuades digunakan untuk melarutkan peptone dan beef extract, cukup dengan pengadukan. Setelah keduanya larut, larutan dituangkan ke larutan agar dan diaduk sampai homogen. Kemudian ph media diukur 16

21 dengan mencelupkan kertas ph indikator. Jika ph tidak netral maka dapat ditambahkan HCl/NaOH. Setelah itu media dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan disterilisasi dengan autoklaf. Tuang media steril ke cawan petri steril secara aseptis. Jika diinginkan media tegak atau miring pada point ke 5, media langsung dituang ke tabung kemudian disterilisasi. Pembuatan Nutrient Broth Komposisi untuk media NB samadengan NA tetapi tidak memakai agar sebagai pemadat. Proses pembuatannyapun lebih sederhana, tinggal melarutkan peptone dan beef extract kemudian ditampung dalam labu Erlenmeyer atau tabung reaksi dan siap disterilisasi. Proses pembuatan ini tidak memerlukan panas, peptone dan beef extract akan mudah larut sempurna pada air suhu kamar jika diaduk Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA) Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: Potato/kentang 3g Peptone 5g Agar 15 g Akuades s.d 1000 ml (sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil) Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak, kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas saring lalu ditampung di Beakerglass baru. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades lalu setelah ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi. 17

22 Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agardekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur ph media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi. 18

23 STERILISASI Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi, tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis Sterilisasi : 1. Pengertian sterilisasi 2. Macam-macam sterilisasi a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) b. Sterilisasi secara fisik Pemanasan - Dengan api langsung - Panas kering - Uap air panas - Uap air panas bertekanan Penyinaran UV c. Sterilisasi secara kimia dengan larutan disinfektan 3. Prosedur/Teknik aseptis a. Mensterilkan meja kerja b. Memindahkan biakan (streak) c. Menuang media d. Pipetting 4. Prinsip cara kerja autoklaf 5. Sterilisasi dengan cara penyaringan 6. Tyndalisasi 7. Sterilisasi dengan udara panas 8. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet Dasar Teori Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Macam-macam sterilisasi Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. 1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik. 2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Pemanasan 19

24 a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll. c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV 3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. 20

25 Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik aseptis Desinfeksi meja kerja 21

26 22

27 23

28 24

29 Saran-saran kerja aseptis : 1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu. 2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar. 3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. 4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api. 5. Jika kerja di SafetyCabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki 25

30 endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah : Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim Paelarut organik, seperti fenol Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb : Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar Media yang memiliki ph > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf Jangan mensterilisasi larutan agar dengan ph < 6,0 Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara : Non-disposable filtration apparatus Disedot dengan pompa vakum - Volume ml Disposable filter cup unit - Disedot dengan pompa vakum - Volume ml Disposable filtration unit dengan botol penyimpan - Disedot dengan pompa vakum - Volume ml Syringe filters - Ditekan seperti jarum suntik - Volume 1-20 ml 26

31 Spin filters - Ditekan dengan gaya setrifugasi - Volume kurang dari 1 ml - Cara kerja menggunakan nondisposable filtration apparatus Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz), membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung. Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong dengan larutan yang akan disterilkan. Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa. setelah semua larutan melewati membran filter dantertampung dierlenmeyer, maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril. Tyndalisasi Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi ph asam akan terhidrolisis. 27

32 Cara kerja : Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil. Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang). Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba). Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan. Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh. Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization) Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas. Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam. Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter. BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. Berbagai kelas Biological Safety Cabinet. 28

33 BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih. 29

34 ISOLASI MIKROBA Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Isolasi Mikroorganisme: a. Pengertian b. Teknik Pengambilan sample c. Isolasi dengan cara pengenceran 1) Teknik preparasi suspensi Swab Rinse Maserasi 2) Teknik pengenceran bertingkat 3) Teknik penanaman Dari suspensi (spread dan pour plate) Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation) d. Prosedur isolasi bakteri dari sampel e. Prosedur isolasi jamur dari sampel A. Dasar Teori Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. B. Alat dan Bahan Tabung reaksi Cawan Petri Oven Inkubator Vortex Tanah gembur Air sungai/air danau/air kanal Media NA Media PDA Aqauades Streptomicyn/penicillin/kloramfenikol 30

35 C. Cara Kerja Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel. 1. Sampel tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.. 2. Sampel air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution) 1. Teknik Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel : a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water. b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan 31

36 mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beakerglass. c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi 2. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengencera bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi Jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara Kerja : Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping) Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang 32

37 perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama. 3. Teknik Penanaman a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir. a.1. Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas. ( ) a.2 Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC) Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong 33

38 Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawanuntuk menghomogenkan suspense bakteri dan medium, kemudian diinkubasi Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0.1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate. b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. b.1 Goresan Sinambung Cara kerja : Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. b.2 Goresan T Cara kerja : Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna 34

39 Lakukan hal yang sama pada daerah 3 B.3 Goresan kuadran ) Quadrant Streak) Cara kerja : Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah : Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8 Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran Inkubasi 1x24 jam. 35

40 Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah : Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru, Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari. 36

41 ISOLASI BAKTERI DARI MAKRO ALGAE 1. Preparasi Sampel Sampel alga yang telah dikumpulkan kemudian dibersihkan dari kotoran yang menempel dan disimpan dalam cool box. Selanjutnya sampel disegarkan dalam media Nutrient Broth. a. Bagian permukaan alga Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 ml NaCl fisiologis. Selanjutnya air bilasan dimasukkan ke dalam 30 ml media nutrient broth lalu dikocok menggunakan shaker pada suhu kamar selama jam. b. Bagian dalam alga Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 ml NaCl fisiologis. Selanjutnya, alga yang telah dibilas dihaluskan dengan menggunakan blender dan ditambahkan NaCl fisiologis. Suspensi kemudian dimasukkan ke dalam 30 ml media nutrient broth lalu dikocok menggunakan shaker pada suhu kamar selama jam. Masing-masing sampel pada bagian permukaan dan bagian dalam alga diambil sebanyak 1 ml dan dilakukan pengenceran bertingkat untuk memperoleh pengenceran yang sesuai. Selanjutnya sebanyak 0,1 ml dari pengenceran tersebut disebarkan ke dalam medium agar dan ditumbuhkan selama 24 jam. Pemurnian bakteri dilakukan dengan menumbuhkan koloni bakteri yang berbeda-beda dari kultur sebelumnya ke dalam cawan petri yang mengandung media selektif M-9 produksi L Aspraginase yang telah dimodifikasi dengan komposisi KH2PO4 0,75 g/l, L Asparagin 10 g/l, NaCl 0,5 /L, MgSO4.7H2O 1,0 g/l, CaCl2.2H2O 1,0 g/l, gukosa 3 g/l, agar 20 g/l, dan indikator fenol merah 0,05 g/l. (Moorthy, 2010, dan Ghasemi, 2008). Larutan stok fenol merah dibuat 2,5 % dalam etanol ph 7 lalu ditambahkan ke dalam medium. Medium disterilkan dalam autoclave selama 15 menit pada suhu 1210C tekanan 1 atm. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oc. Pada medium ini L Asparagin digunakan sebagai sumber nitrogen. Produksi L Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak sehingga meningkatkan ph medium pembiakan. Perubahan ph membentuk warna pink disekitar koloni yang memproduksi L Asparaginase (Gashemi, dkk., 2008). 37

42 MORFOLOGI MIKROBA Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni mikroorganisme a. Bakteri a.1 mengamati morfologi koloni bakteri a.1.1 pada media cawan a.1.2 pada agar miring a.1.3 pada agar tegak a.1.4 pada media cair a.2 mengamati morfologi sel bakteri a.2.1 dengan pewarnaan sederhana a.2.2 dengan pewarnaan negatif a.2.3 dengan pewarnaan gram a.2.4 dengan pewarnaan endospora a.3 mengamati motilitas bakteri a.3.1 pengamatan langsung a.3.2 pengamatan tidak langsung b. Yeast b.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan) b.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana) c. Kapang c.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan) c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slideculture) A. Dasar Teori Pengamatan Morfologi mikroba merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Ciri koloni yang diamati berupa ukuran, pigmentasi, bentuk tepi, elevasi dan pertumbuhan pada media cair. B. Alat dan Bahan Isolat Bakteri Media Nutrient Agar miring dan tegak Media Nutrient Broth Reagen Pewarnaan Gram Malachite Green Mikroskop Jarum Inokulas Kaca Preparat Pipet Tetes 38

43 C. Prosedur Kerja 1. Pengamatan Morfologi koloni Bakteri Cara Kerja : Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation Tumbuhkan biakan pada media NB Amati ciri-ciri pertumbuhan koloni yang tumbuh. Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut : Pertumbuhan pada Cawan Petri Ukuran: pinpoint/punctiform (titik) Small (kecil) Moderate (sedang) Large (besar) Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian), Transparant (bening) Bentuk : Elevasi Circular : Flat Irregular Raised Spindle Convex Filamentous Umbonate Rhizoid 39

44 Permukaan : Halus mengkilap Kasar Berkerut Kering seperti bubuk Margin Pertumbuhan pada Agar Miring Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus Ciri koloni berdasarkan bentuk: Ciri-ciri koloni berdasar bentuk : koloni berdasar O2 Ciri Pertumbuhan padakebutuhan Agar Tegak dengan needle Cara penanaman adalah menusukkan jarum inokulum ke dalam media agar tegak. 40

45 Pertumbuhan pada Media Cair Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2 2. Mengamati Morfologi Sel Bakteri Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa 41

46 pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll. Pewarnaan Pewarnaan sederhana pewarnaan positif pewarnaan negatif Pewarnaan diferensial Pewarnaa Gram pewarnaan acid fast dll. Pewarnaan khusus pewarnaan endospora pewarnaan flagella dll. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Cara Kerja : Bersihkan object glass dengan kapas Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata. Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali) Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, CrystalViolet) dan tunggu kurang lebih 30 detik. 42

47 Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10). Pewarnaan Negatif Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Cara Kerja: Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api. 43

48 Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Neisseria, Veillonella, Enterococcus Coccobacilli Moraxella, Acinetobacter Bacilli, (rod), rounded ends Escherichia, Lactobacilus, clostridium Vibrio (curved) Vibrio, Bdellovibrio, Ancylobacter dll Bacilli (Rod), blunt end Bacillus Helical (spirillum) Spirochaeta, Spirillum, campylobacter Diplococcus Neisseria, Moraxela Streptococcus Streptococcus Streptobacillus Bacillus, Mycobacterium Staphylococcus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Deinococci, pediococcus, micrococcus Sarcina (cuboidpackets) Sarcina 44

49 Pewarnaan Gram Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.berikut merupakan prosedur pewarnaan Gram: Cara Kerja : Dampak/Hasil 1.Buat preparat ulas (smear) yang telah Sel bakteri tertempel pada permukaan kaca difiksasi dari bakteri gram positif (object glas) misal Bacillus subtilis dan gram negatif misal Escherichia coli 2.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh permukaan pewarna utama pada kedua preparat, sel bakteri gram positif dan negatif usahakan semua ulasan terwarnai dan tunggu selama ± 1 menit 3.Cuci dengan akuades mengalir 4.Teteskan mordant (lugol,s iodine) Adanya lugol s iodine menyebabkan adanya ikatan CV dengan iodine yang akan lalu tunggu ± 1 menit meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri. Pada gram positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat pada dinding sel 5.Cuci dengan akuades mengalir 45

50 6.Beri larutan pemucat (ethanol 96%/ aseton) setetes demi setetes hingga etanol yang jatuh berwarna jernih. Jangan sampai terlalu banyak (overdecolorize) Penetesan etanol absolut menyebabkan terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam etanol), sehingga komplek CV-iodine akan lepas dari permukaan sel gram negatif, sedangkan pada gram positif CV-iodine tetap menempel di dinding sel, sel gram negatif menjadi bening 7.Cuci dengan akuades mengalir 8.Teteskan counterstain (safranin) dan Safranin akan mewarnai sel gram negatif tunggu selama ± 45 detik menjadi berwarna merah, sedangkan gram positif tidak terpengaruh. Counterstain hanya berfungsi sebagai pengontras saja 9.Cuci dengan akuades mengalir 10.Keringkan preparat dengan kertas tissue yang ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai merusak ulasan) lalu biarkan mengering di udara. 46

51 Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter. Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (keduaduanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. 47

52 Cara Kerja : Dampak/Hasil 1.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis Sel bakteri menempel pada permukaan lalu tutup dengan kertas merang objectglass 2.Tetesi ulasan pada object glass dengan Malachite green di atas kertas merang. Letakan di atas air yang mendidih. Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai kering. Jika bagian pinggir mulai mengering, tambahkan lagi Malachite Green. Malachite green akan mewarnai sel vegetatif bakteri. Endospora sukar menyerap zat warna, sekali diberi zat warna, warna tersebut sulit dilunturkan. Untuk mewarnainya dilakukan pemanasan untuk mempermudah penetrasi Malachite green ke dinding endospora. 3.Setelah dingin, bilas object glass dengan Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel. akuades mengalir Setelah perlakuan di atas Malachite green tidak melekat kuat dengan sel vegetatif. Pembilasan dengan akuades akan melunturkan Malachite green pada sel vegetatif 4.Tetesi dengan safranin sebagai counter stain, diamkan selama + 45 detik Safranin akan mewarnai sel vegetatif menjadi merah, warna ini tidak mempengaruhi warna hijau endospora. 5.Cuci kering anginkan 48

53 Pemberian Malachite green Pelunturan dengan air mengalir Penambahan safranin Cuci dan keringkan 49

54 Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya : Yeast / Khamir A. Dasar Teori Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa (beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 µm. Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan bentuk hifa atau pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan diri dari induk. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan organel seperti mitkondria, grannula lemak dan glikogen. Mengamati morfologi koloni yeast Tanam biakan yeast (dapat berupa Sacharomyces cereviceae atau Candida albicans) pada PDA dengan cara streakquadrant. Inkubasi selama 2x24 jam. Setelah didapatkan koloni tunggal, pengamatan ciriciri morfologi koloni hampir sama dengan ciri morfologi bakteri. 50

55 Mengamati Morfologi Sel Yeast 1. Melihat bentuk sel east Cara Kerja : Tumbuhkan Sacharomyces cereviceae pada glukosa cair selama 24 jam. Ulaskan suspensi biakan pada object glass lalu teteskan Methilene Blue hingga rata (jangan difiksasi). Tutup preparat dengan cover glass. Amati dengan perbesaran 40x10 atau 100x Melihat bentuk spora sel Yeast Cara kerja : Buat preparat ulas dari biakan yeast pada Goodkowa Agar yang berumur 10 hari. Fiksasi dengan api bunsen. Warnai dengan cara Shager dan Fulgen yaitu: Tetesi preparat dengan MalachiteGreen dan biarkan detik. Panasi preparat dengan api bunsen selama + 30 detik (sampai timbul uap). Cuci preparat dengan air mengalir. Keringkan dengan tissue kemudian biarkan pada udara terbuka. Amati di bawah mikroskop. Perhatikan spora yang berwarna Kapang / Jamur Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Koloni kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya. 51

56 Mengamati morfologi koloni kapang Cara kerja : Tanam/pindahkan biakan kapang dengan jarum inokulum needle yang diletakan di tenganh-tengah cawan petri. Inkubasi selam beberapa hari. Amati pertumbuhan koloni (miselium) yang menyebar. A. Mengamati sel morfologi kapang dengan metode SlideCulture (Microculture) Teknik ini bertujuan untuk mengamati sel kapang dengan menumbuhkan spora pada object glass yang ditetesi media pertumbuhan. Pengamatan struktur spora dan miselium dapat juga dilakukan dengan preparat ulas seperti yang telah diuraikan di depan. Namun seringkali miselium atau susunan spora menjadi pecah atau terputus sehingga penampakan di mikroskop dapat membingungkan. Dengan teknik ini, spora dan miselium tumbuh langsung pada slide sehingga dapat mengatasi masalah tersebut. B.1 Metode Heinrich s cara kerja : Siapkan object glass, cover glass, tissue basah yang dimasukkan dalam cawan dan sterilkan dengan autoclave. Setelah selesai sterilisasi berikan lilin (parafin-petrolatum) steril pada sebelah kiri dan kanan tempat yang akan ditutup cover glass (aseptis). Tutup dengan cover glass. Teteskan suspensi spora jamur dalam media cair pada media cover glass yang tidak diberi lilin. Berikan sampai setengah luasan cover glass. Tekan cover galss secara media merata. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. Ambil preparat dan amati di bawah mikroskop. 52

57 B. 2 Metode Riddel cara kerja : Persiapan sama seperti di atas Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass. Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar. Tutup potongan agar dengan cover glass. Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam. Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop. B.3 Prosedur yang lebih sederhana carakerja : Sterilkan cawan petri yang berisi kapas yang di atasnya terdapat object glass dan cover glass. Siapkan media PDA dan dijaga supaya tetap cair. Teteskan media PDA pada object glass secara aseptis lalu tunggu memadat (teteskan jangan terlalu banyak). Belah media yang memadat dengan jarum inokulum yang berujung L. Ulaskan spora jamur yang akan diamati pada belahan tersebut. Tutup dengan cover glass tepat di atas media dan tekan hingga merata. Inkubasi selama 2x24 jam. Amati pertumbuhan miselium dan spora pada object glass dengan perbesaran sedang 53

58 54

59 FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME Kompetensi: mahasiswa mengetahui pengaruh suhu, tekanan sinar UV dan ph terhadap pertumbuhuan Mikroorganisme a. b. c. d. Faktor lingkungan : pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme pengaruh ph terhadap pertumbuhan mikroorganisme Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme A. Dasar teori Berdasarkan suhu optimum untuk pertumbuhan maka dapat dikelompokan menjadi 3 yaitu : 1. psikrofilik(0-200c), 2. mesofilik Mesofilik (20-300C), 3. termofilik ( C). Suhu merupakan faktor lingkungan yang sangat menentukan kehidupan mikroorganisme, pengaruh suhu berhubungan dengan aktivitas enzim. Suhu rendah menyebabkan aktiivtas enzim menurun dan jika suhu terlalu tinggi dapat mendenaturasi protein enzim. B. Alat dan Bahan Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp Media Nutrient Broth Tabung reaksi Inkubator C. Cara Kerja : 8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C, 250C, 370C, dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan Bacillus sp.) diberi label. Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda, diinkubasi sesuai suhu yang tertera setelah ditumbuhkan selama 48 jam, bandingkan derajat kekeruhannya. 55

60 Pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme A. Dasar Teori Keberadaan mikroorganisma dilingkungan dapat dipengaruhi kepekatan suspensi/cairan di lingkungan. Bila kepekatan suspensi di lingkungan tinggi maka isi sel akan ke luar. Sebaliknya kepekatan suspensi dilingkungan rendah maka akan terjadi pergerakan massa cair ke dalam sel B. Alat dan Bahan Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp Media Nutrient Agar NaCl Tabung reaksi Inkubator C.Cara Kerja: Buat 4 buah cawan NutrientAgar yang mengandung NaCl 0,5%, 3%, 5% dan 15%. Setiap konsentrasi, cawan dibagi menjadi 2 dengan spidol kemudian labeli dengan bakteri E.coli dan Bacillus sp. Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. dengan streak kontinyu Gunakan kontrol untuk masingmasing biakan dengan media yang tidak ditambahi NaCl. Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhannya Pengaruh sinar ultraviolet terhadap pertumbuhan mikroorganisme A. Dasar Teori Sinar UV panjang gelombang nm dapat membunuh mikroorganisme jika di paparkan. Komponen seluler yang dapat menyerap sinar UV adalah asam nukleat sehingga dapat rusak dan menyebabkan kematian. B. Alat dan Bahan Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp Aspergillus sp Media Nutrient Agar NaCl Lampu UV Inkubator 56

61 C. Cara Kerja: Inokulasikan Aspergillus sp., E.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA. Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm selama 1 menit, 5 menit, dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12 inchi Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan pada sinar UV Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya Pengaruh ph terhadap pertumbuhan mikroorgansime A. Dasar Teori ph berpengaruh terhadap sel dengan mempengaruhi metabolisme, pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada ph netral (7,0). Berdasarkan nilai ph yang dibutuhkan untuk kehidupannya dikenal 3 kelompok mikroorganisme yaitu : Acidofilik, 2 Mesofilik/Neutrofilik dan 3. Basofilik B. Alat dan Bahan Isolat bakteri E.coli dan Bacillus sp Aspergillus sp Lampu UV Media Nutrient Agar Inkubator NaCl C. Cara Kerja : Buatlah tabung reaksi berisi NB dan atur ph-nya (ph 3, 7 dan 9) masingmasing 2 tabung untuk tiap nilai ph Labeli dengan nama bakteri yang akan diinokulasikan Inokulasi tiap tabung dengan Bacillus sp dan E.coli lalu diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam Amati perbedaan kekeruhan pada tiap nilai ph 57

62 58

63 ANALISA COLIFORM BERDASARKAN NILAI MPN Kompetensi: Mengetahui kualitas sampel yang diuji berdasarkan nilai MPN coliform A. Dasar teori MPN (Most Probable Number) atau angka perkiraan terdekat merupakan suatu cara untuk menganalisa bakteri golongan coli yang memiliki kemampuan memfermentasi laktosa dan menghasilkan gas, yang merupakan parameter pencemaran suatu sampel air. Analisisi MPN coliform berlangsung dalam tiga tahap utama, yaitu uji penduga (Presumtive Test), uji penguat (Corfirmed Test) dan uji kepastian atau pelengkap (Complete Test). Uji penduga dilakukan untuk mendeteksi bakteri koliform yang teramat kecil porsinya dalam air terutama untuk air minum kemasan maupun bahan pangan lainnya. Nilai MPN yang ditunjukkan berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif tersebut tidak menunjukkan konsentrasi yang sebenarnya, namun berlaku sebagai penunjuk angka bakteri koliform dengan derajat kepercayaan (level of significant) dalam arti statistik sebesar 95%. Uji penguat atau penegas dilakukan agar uji positif pada uji penduga dapat lebih tegas menunjukkan bahwa bakteri yang mengkontaminasi sampel air merupakan bakteri coli fekal atau bakteri coli yang berasal dari tinja. Penentuan nilai MPN juga ditunjukkan berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif yang dicocokkan dengan tabel MPN. Tabung positif pada uji penguat, kemudian dilanjutkan dengan uji pelengkap atau kepastian yaitu dengan menggunakan medium Mic Concey Agar (MCA). Uji ini bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan Escherichia coli. Dapat pula langsung dilakukan dengan pengamatan bentuk sel, pengecatan spora pengecatan gram pada bakteri yang tersebut. Analisa MPN koliform berlangsung dalam 3 tahap utama yaitu: 1. Uji Penduga (Presumtive Test) a. Alat dan bahan : 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Sampel air (air minum kantin, air isi ulang dan air mineral) 9 tabung berisi 10 ml + tabung durham BTB (Bromtimol Blue) 10%. Spoit 10 ml Bunsen Rak tabung Kapas Inkubator 59

64 b. Cara kerja : 1) Siapkan medium LB steril + BTB di dalam 9 tabung reaksi yang masing-masing telah dimasukkan tabung durham. 2) Buat pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 dari sampel. 3) Masukkan masing-masing 1 ml dari setiap seri pengenceran ke dalam medium LB (sudah ditetesi larutan indikator BTB). 4) Kocok dengan hati-hati hingga sampel homogen dan tutup mulut tabung reaksi dengan kapas. 5) Inkubasi semua tabung pada suhu 37oC. 6) Pada 1 x 24 pertama, amati perubahan yang terjadi yaitu reaksi positif bila warna medium berubah dari hijau menjadi kuning dan ada gas dalam tabung durham. Jika belum terjadi perubahan inkubasi dilanjutkan sampai maksimal 2 x 24 jam. 7) Berdasarkan pengamatan tersebut, tentukan kombinasi MPN yang dihasilkan, selanjutnya hitung MPN koliform sampel dengan mencocokkan kombinasi MPN tersebut pada tabel. Misal : didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml = 1,5 x 102 sel/ml 60

65 2. Uji Penguat (Confirmed Test) a. Alat dan bahan : 1) Tabung dari uji penduga yang positif 2) Medium EMBA atau ENDO Agar 3) Jarum inokulasi (ose) 4) Cawan petri 5) Bunsen 6) Inkubator 61

66 b. Cara kerja : 1) Siapkan medium EMBA atau ENDO Agar lempeng pada cawan petri (kondisi steril). 2) Dari tabung yang memberi reaksi positif pada uji penduga di inokulasikan atau digores dengan cara goresan kuadran pada medium EMBA atau ENDO Agar yang telah disiapkan di atas. 3) Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam. 4) Uji positif bila terdapat koloni hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni pada medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar. 5) Koloni bakteri pada medium lempeng tersebut kemudian dimurnikan dan disimpan di medium agar miring. 3. Uji Pelengkap (Complete Test) a. Alat dan bahan : 1) Biakan bakteri dari uji penguat 2) Larutan gram A, B, C dan D 3) Aquades steril 4) Alkohol 70% 5) Jarum inokulasi (ose) 6) Gelas obyek 7) Mikroskop b. Cara kerja : 1) Koloni yang berwarna hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni pada medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar di inokulasikan dan disuspensikan dengan cara menginokulasikan 3 ose ke dalam 10 ml aquades steril kemudian dihomogenkan dengan dikocok perlahan. 2) Bersihkan gelas objek dengn alkohol 70 % agar bebas lemak. 3) Ambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas objek seluas + 1 cm2. 4) Biarkan mengering di udara, lalu fiksasi di atas api spritus. 5) Teteskan larutan Gram A sebanyak 2 tetes dan biarakan selama 2 menit. 6) Cuci dengan air mengalir, keringkan dengan kertas isap secara hati-hati. 62

67 7) Teteskan larutan Gram B, biarkan selama 1 2 menit. 8) Cuci dengan air mengalir, keringkan. 9) Teteskan larutan Gram C, biarkan selama 30 detik. 10) Cuci dengan air mengalir dan biarkan mengering. 11) Teteskan larutan Gram D sebanyak 2 3 tetes, biarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air mengalir. Biarkan mengering. 12) Tentukan hasil pewarnaan gram bakteri tersebut, jika gram negatif berarti positif E.coli. 13) Amati bentuk sel bakteri tersebut, jika berbentuk batang berarti positif E.coli. 63

68 ANALISA Staphylococcus aureus PADA BAHAN PANGAN Isolasi Staphylococcus aureus dengan metode cawan hitung (plate count) agar sebar Kompetensi: Mengetahui kualitas sampel yang diuji berdasarkan jumlah total bakteri Alat: 1. Autoclave 7. Gelas Ukur 2. Colony Counter 8. Gelas Preparat 3. Neraca analitik 9. Inkubator 4. Botol pengencer 10. Pipet 5. Batang Gelas Bengkok 11.Water Bath 6. Cawan Petri Bahan: 1. Ikan segar, nugget dan ayam goreng krispi 2. Baird Parker Agar 3. Buffer Posfat 4. Brain Heart Infusion Broth 5. Parafin oil steril 6. Pereaksi katalase 7. Pereaksi pewarnaan Gram 8. Purple Carbohydrate (masing-masing Broth mengandung glucose dan manitol 0.5%) 9. Trypticase Soy Agar 64

69 A. Isolasi Staphylococcus aureus 1. Timbang 1 gr sampel dan homogenkan dalam 10 ml buffer posfat sebagai pengeceran Secara aseptis pindahkan 1 ml sampel untuk membuat pengenceran 10-2, 10-3, dst. 3. Masukkan dalam sebanyak 0,1 ml ke dalam 3 cawan yang berisi media Baird Parker Agar. 4. Ratakan inokulum dengan menggunakan batang gelas bengkok dan biarkan inokulum teresap ke dalam media kira-kira 10 menit dalam media Baird Parker Agar kering. Bila belum terserap, letakkan cawan dalam inkubator Dalam posisi menghadap ke atas sekitar 1 jam. Balik cawan petri dan inkubasi jam. 5. Koloni Staphylococcus aureus pada Baird Parker Agar mempunyai ciri-ciri koloni bundar, licin/halus, cembung, diameter 2-3 mm, warna abu-abu hingga kehitaman, sekeliling tepi koloni bening (terbentuk halo). Koloni-koloni mempunyai konsistensi berlemak dan lengket bila diambil dengan jarum inokulasi. 6. Hitung jumlah koloni pada cawan yang mempunyai jumlah koloni koloni. 7. Cara perhitungan SPC terdapat pada lampiran 8. Ambil 2 atau lebih koloni terduga untuk uji koagulase dan uji tambahan B. Uji Koagulase 1. Inokulasi koloni terduga Staphylococcus aureus ke dalam 2 ml BHI broth dan inkubasi selama jam. 2. Pindahkan 0,2 ml 0,3 ml inokulum tersebut ke dalam tabung steril dan tambahkan 0,5 ml koagulasi plasma kemudian aduk. inkubasi dan amati setiap jam untuk 4 jam pertama dan lanjutkan hingga 24 jam untuk melihat terbentuknya koagulan. 3. Koagulan yang terbentuk secara padat/solid an tidak jatuh apabila tabung dibalik dinyatkan positif (reaksi 4+) Staphylococcus aureus. Koagulan yang menunjukkan reaksi 2+ dan 3+ harus dilakukan uji tambahan. 65

70 C. Uji tambahan a. Uji Katalase 1. ambil 1 ose inokulum dari BHi broth goreskan ke dalam media TSA miring dan inkubasi selama 18 jam 24 jam. 2. Stelah diinkubasi ambil 1 ose inokulum dan letakkan di atas gelas preparat, tetesi dengan H2O2 untuk melihat pembentukan gelembung-gelembung gas. b. Fermentasi glukosa secara anaerob 1. Ambil 1 ose inokulum dari BHI broth. Inokulasikan ke tabung reaksi yang berisi media karbohidrat mengandung 0,5% glukosa, tutup lapisan atas dengan paraffin oil steril setebal 25 mm. 2. Inkubasi selama 5 hari. Kondisi asam dihasilkan secara anaerob jika terjadi perunahan warna ungu media menjadi kuning, ini menunjukkan adanya Staphylococcus aureus. c. Fermentasi manitol secara anaerob Lakukan langkah seperti pada ferementasi glukosa dengan manitol sebagai karbohidrat dalam media. Staphylococcus aureus biasanya memberikan hasil positif yang ditunjukkan dengan terjadinya perubahan ungu ke kuning, tetapi beberapa strain biasanya memberikan hasil negatif. d. Uji produksi nuklease thermostabil 1. Tuang 3 ml toluidine blue-dna agar di atas permukaan preparat. Setelah media membeku, lubangi dengan diameter 2 mm. 2. Ambil 0,1 ml kultur BHI broth yang telah dipanaskan dalam waterbath mendidih pada suhu 100 C selama 15 menit 3. Letakkan gelas preparat pada kondisi yang lembab dan inkubasi selama 4 jam. Apabila terbentuk lingkaran berwarna merah muda cerah di sekeliling lubang sekurang-kurangnya 1 mm, menunjukkan reaksi positif. 66

71 UJI BIOKIMIA (UJI IMVIC) Kompetensi: Mahasiswa biokimianya mampu mengidentifikasi mikroba berdasarkan kemampuan A. Dasar Teori Uji IMVIC merupakan cara untuk membedakan sesama mikroba yang termasuk dalam kelompok enterobacteriaceae, dengan sasarannya adalah Escherichia coli. Pembedaan anggota kelompok tersebut didasarkan proses biokimia dan reaksi enzimatis dari bakteri yang menghasilkan suatu substrat spesifik. Sebagai contoh E. coli sebagai anggota enterobacteriaceae bersifat dapat memfermentasi laktosa mengahsilkan asam. Uji IMViC terdiri dari serangkaian uji biokimia yaitu: Uji Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer dan Citrate. Suatu bakteri yang diisolasi dari bahan pangan diidentifikassi sebagai E.coli jika hasil uji IMVic = Aktivitas enzimatik tryptophanase dari bakteri yang dapat mengoksidasi asam amino tryptophan dikonversi menjadi produk metabolik berupa indol. Indol adalah suatu persenyawaan nitrogen yang kompleks yang dihasilkan bakteri sebagai hasil dari penguraian protein. Indol hanya terbentuk dari asam amino tryptophan, dan triptopan tersebut berasal dari pepton dalam komposisi medium. Indol dapat dideteksi dengan penambahan pereaksi Kovac s yang mengandung p-dimetil amino bensaldehid, butanol dan HCl. Reaksi ini menghasilkan lapisan warna merah Chery pada permukaan biakan. Tryptophan Tryptopha Indol + asam piruvat + NH3 nase Indol + p-dimetil amino bensadehid b ut Lapisan warna merah + Uji Methyl Red dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri untuk memfermentasi glukosa menghasilkan asam yang dapat dideteksi dengan penambahan pereaksi methyl Red sehingga warna biakan menjadi merah. E.coli bersifat dapat memfermentasi glukosa. Uji Voges-Proskauer dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa dengan hasil akhir berupa senyawa non asam atau senyawa netral misalnya asetil metil karbinol. Senyawa ini, dengan penambahan KOH 40% dan larutan αnaftol sebagai katalisator akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna merah muda 67

72 (menunjukkan reaksi positif). E.coli tidak mampu menghansilkan senyawa tersebut, sehingga hasil reaksinya negatif. Uji Citrat dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri memanfaatkan citrat sebagai sumber karbon tanpa adanya glukosa maupun laktosa. E.coli tidak dapat tumbuh pada media ini, karena tidak mampu menggunakan citrat sebagai sumber karbon, sehingga warna media tidak berubah. A. Uji Indol 1. Tujuan: Untuk menunjukkan ada tidaknya senyawa indol yang dihasilkan oleh suatu biakan bakteri. 2. Alat dan Bahan a. Jarum ose b. Biakan E.coli dan Staphylococcus c. Medium sim (sulfit indol motility) atau tripton 1% broth d. Reagen kovac s 3. Prosedur kerja : a. Inokulasikan secara tusuk tegak(stab) biakan bakteri pada medium sim atau 1 ose pada medium tripton 1% broth. b. Biarkan satu tabung tidak diinokulasikan dan gunakan sebagai kontrol. c. Inkubasikan pada suhu 37oc selama 48 jam. d. Tambahkan 5 tetes (1 ml) reagen kovac s kedalam setiap tabung termasuk kontrol. e. Kocoklah perlahan-lahan dan biarkan tabung berada dalam posisi tegak. f. Amati permukaan medium. Terbentuknya cincin merah tua pada permukaan medium menunjukkan indol positif. Bandingkan dengan kontrol. 68

73 B. Uji Methyl Red 1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroba membentuk asam dari hidrolisis glukosa. 2. Alat dan bahan : a. Jarum ose b. Biakan E.coli dan Staphylococcus c. Medium MR-VP d. Biakan 3. Cara kerja: a. Inokulasikan ke dalam medium MR-VP dengan 1 jarum ose biakan bakteri. b. Inkubasi selama 72 jam pada suhu 37oc. c. Tetes 3 tetes reagen Methyl Red. d. Amati permukaan medium. Terbentuknya warna merah menunjukkan uji Methyl Red positif. Bandingkan dengan kontrol. 69

74 C. Uji Voges-proskauer 1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan senyawa acetyl carbinol atau 2,3 butandiol. 2. Alat dan bahan a. Jarum ose b. Medium MR-VP c. Biakan E.coli dan Staphylococcus d. Reagen barrit (α-naftol 50% dan KOH 40%) 3. Cara kerja : a. Inokulasikan medium MR-VP dengan 1 ose biakan yang telah disiapkan b. Inkubasi pada suhu 37oc selama 72 jam. c. Tambahkan 0,6 ml reagen α-naftol 5% dan 0,5 ml KOH 40%. Lalu kocok perlahanlahan selama beberapa menit. d. Amati permukaan medium. Terbentuknya warna merah tua menunjukkan uji VP positif. Bandingkan dengan kontrol. 70

75 D. Uji Citrat 1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroba memanfaatkan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon. 2. Alat dan bahan a. Jarum ose b. Media Simon Citrate Agar (SCA) c. Biakan E.coli dan Staphylococcus 3. Cara kerja : a. Inokulasikan biakan bakteri kedalam medium SCA miring. b. Biarkan 1 tabung tidak diinokulasikan dan gunakan sebagai kontrol c. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oc. d. Amati pertumbuhan mikroba. Perubahan medium dari hijau menjadi biru menunjukkan uji citrat positif. 71

76 DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK Kompetensi : mahasiswa mengetahui cara kerja pengujian oligodinamik dan zat antimikroba A. Dasar Teori Pengertian dan Jenis Antibiotik Antibiotik adalah bahan yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau sintetis yang dalam jumlah kecil mampu menekan menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. Antibiotik dikelompokkan berdasarkan gugus aktifnya, misal antibiotik macrolide, antimikroba peptida. Adapun penamaannya biasanya berdasarkan gugus kimiawinya ataupun mikroorganisma produsernya, misalnya: ragam antibakteria: Penicillin dan cephalosporin Erythromycine Sulfadrugs Trimethoprim dan sulfamethoxazole Polymyxin B Quinolone Tetracycline Antifungi : Nystatin Azoles Mekanisme kerja antibiotik antara lain : Menghambat sintesis dinding sel Merusak permeabilitas membran sel. Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi) Menghambat sintesis protein (proses translasi). Menghambat replikasi DNA. 72

77 Prosedur difusi-kertas cakram-agar yang distandardisasikan (metode KirbyBauer) merupakan cara untuk menentukan sensitivitas antibiotik untuk bakteri. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer : - Konsentrasi mikroba uji - Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram - Jenis antibiotik. - ph medium. 1. Pengujian Antibiotik dengan Metode Kirby-Bauer Alat dan Bahan Cawan petri Kertas cakram Biakan E.coli dan Staphylococcus Media Mueller Hilton Agar Antibiotik Ampisilin dan Kanamisin Cara kerja: Inokulasikan biakan pada Mueller-Hinton Agar dengan metode sebar Biarkan cawan selama 5 menit Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar. 73

78 Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel sempurna di permukaan agar. Inkubasi pada suhu 37 0C selama jam. Ukur diameter zona hambat (mm) kemudian bandingkan dengan tabel. sensitivitas antibiotik. Cara menginterpretasikan : Ukur diameter zona hambat (zona jernih) Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk Eryhtromycin. Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik Eryhtromycin. Resistent : tahan Intermediate : medium Susceptible : peka 2. Pengujian Pengaruh Daya Oligodinamik Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi. Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut daya oligodinamik. Alat dan Bahan Cawan petri Biakan E.coli dan Staphylococcus Kertas cakram Media Nutrient Agar(NA) Lempeng logam tembaga dan seng 74

79 Cara Kerja : Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset Inkubasi 370C selama 48 jam Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau tidak ada pertumbuhan 75

80 AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME Kompetensi : mahasiswa mengetahui beberapa teknik uji aktivitas enzimatik. Aktivitas enzimatis mikroorganisme : a.uji aktivitas eksoenzim : Uji amilolitik Uji lipolitik Uji proteolitik b. Uji aktivitas endoenzim : Uji oksidase Uji katalase Uji Triple Sugar Iron Agar 1. Uji Amilolitik A. Dasar Teori Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat pada media. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. 76

81 B. Alat dan Bahan Cawan petri Jarum inokulasi Biakan E.coli dan Staphylococcus sp Media NutrientAgar-pati lugol siodine C. Cara Kerja : Inokulasi NutrientAgar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan Staphylococcus sp. secara streak. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol siodine secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena. Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni tetap biru hitam. 2. Uji Lipolitik A. Dasar Teori Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma. Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak. Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media TrybutirinAgar, RodhamineAgar dan SpiritBlueAgar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. B. Alat dan Bahan Cawan petri Jarum inokulasi Biakan E.coli dan Staphylococcus sp Media Tributyrin Agar Neutra Red lugol siodine C. Cara Kerja : Inokulasikan Staphylococcus sp. dan E. coli pada mediatributyrin Agar dengan indikator neutral red Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. 77

82 Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan reaksi negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah. 3. Uji proteolitik A. Dasar Teori Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini disebut peptonisasi atau proteolysis. B. Alat dan Bahan Cawan petri Jarum inokulasi Biakan E.coli dan Staphylococcus sp Media Skim Milk Agar (SMA) C. Cara Kerja Inkubasi Inokulasikan Staphylococcus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA) o pada suhu 37 C selama 48 jam. Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni. 78

83 4. Uji Oksidase A. Dasar Teori Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik. Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-dphenylenediaminedihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif tertunda (warna biru muncul antara detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif. B. Alat dan Bahan Biakan cair E.coli dan Staphylococcus sp Objek gelas C. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan diinokulasikan pada Objectglass. Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas. Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara detik setelah ditetesi. 79

84 5. Uji katalase A. Dasar Teori Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif.. 80

85 B. Alat dan Bahan Biakan cair E.coli dan Staphylococcus sp Objek Gelas C. Cara Kerja : Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada Dengan menggunakan pipet tetes, 3% H2O2 diteteskan pada Objectglass secukupnya. Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif (hati-hati membedakan antara gelembung yang muncul dari sel dengan kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen). Uji Triple Sugar Iron Agar A. Dasar Teori TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri yang termasuk kelompok Enterobacteriaceae, yang bersifat gram negatif dan memfermentasikan glukosa membentuk asam sehingga dapat dibedakan dengan bakteri gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. Untuk mengamati fermentasi karbohidrat, media TSIA mengandung laktosa dan sukrosa dengan konsentrasi 1%, dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%. Konsentrasi ini akan berpengaruh terhadap penggunaan karbohidrat dan keadaan asam yang terbentuk. Indikator ph (Phenol Red) ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan ph akibat fermentasi karbohidrat. Perubahan warna menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna menjadi lebih merah menendakan media menjadi basa. Warna media mula-mula adalah merah-orange. Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S. B. Alat dan Bahan Biakan E.coli dan Staphylococcus sp media TSIA 6. C. Cara kerja : Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar). Inkubasi pada 37oC selama jam. Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini. 81

86 = slantdan butt merah (alkali) atau tidak terjadi perubahan warna tidakterjadi fermentasi karbohidrat, sedangkan pepton yang ada digunakan untuk sumber energi dalam keadaan aerob atau anaerob sehingga meningkatkan ph karena produksi amonia meningkat sebagai hasil samping metabolisme. Jika kemerahan lebih pekat pada slant maka terjadi degradasi protein aerobik peptone, sedangkan warna merah pekat tampak di semua media maka interpretasinya adalah degradasi peptone secara aerob maupun anaerob. = slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant) hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah. = slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna kuning setelah 24 jam. = butt berwarna kehitaman adanya H2S yang bereaksi dengan senyawa besi FeSO4 pada media menghasilkan FeS yang berwarna kehitam-hitaman. H2S ini merupakan hasil dari metabolisme = media pecah atau terangkat timbul gas sebagai hasil samping fermentasi 82

87 PENGUKURAN KADAR PROTEIN MIKROBA DENGAN METODE BRADFORD DAN LOWRY Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan pengukuran kadar protein mikroba A. Dasar Teori Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert Beer) pada panjang gelombang nm (cahaya tampak). B. Alat dan Bahan Spektrofotometer Coomasie brilian blue (CBB) G 250 Etanol 95% Asam fosfor 85% BSA (bovine serum albumin) Biakan bakteri C. Cara Kerja PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD 1. PembuatanReagen Bradford Reagen Bradforddibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G 250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan.. 2. Pembuatan Larutan standar protein Standar proteindibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang selama menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut. 3. Pengukuran protein terlarut Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis. umur 18 jam dalam larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 4 C. diperoleh supernatant yang kemudian disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK). Pengukuran sampeldilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama menit. Absorbansi Larutan 83

88 sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim kasar. Penentuan kadar protein dengan Metode Lowry Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi Lowry dkk., menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin. Disiapkan reagen Lowry A (larutan asam phosphor-tungstic-phospho- molibdic),kemudian ditambahkan foolindan akuades dengan perbandingan 1:1 sedangkan Lowry B dibuat dari campuran antara 100 ml larutan Na2CO3 2 % dalam larutan NaOH 0,1 N dengan 1 ml CuSO4.5H2O 1 % dan 1,0 ml natrium-kalium tartrat 2 %. Prosedur Pembuatan Kurva Standar a) Dimasukkan ke dalam deret tabung reaksi : 0 (blanko); 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 ml protein standar BSA. b) Ditambahkan aquadest sampai volume total masing-masing 2 ml. sehingga diperoleh protein standar BSA dengan konsentrasi 0,10; 0,15; 0,20; 0,25, 0,30 mg/ml. c) Selanjutnya dipipet masing-masing 1 ml ke dalam deret tabung reaksi lalu ditambahkan masing-masing 8 ml pereaksi Lowry B, dihomogenkan lalu dibiarkan selama menit. d) Ditambahkan 1 ml pereaksi Lowry A ke dalam tabung reaksi yang telah berisi Lowry B, dikocok merata dengan cepat sesudah penambahan. e) Dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Diukur pada gelombang maksimum lalu dibuat kurva standarnya. Penentuan Kadar Protein sampel : a) Dipipet 1 ml larutan enzim tiap fraksi kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. b) Diberi perlakuan yang sama dengan larutan standar dan blanko(ahmad, A., Patta, A. M., and Natsir, H., 2013). 84

89 ISOLASI BAKTERIOFAGE Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan isolasi bakteriofaga dari limbah cair A. Dasar Teori Bakteriofage adalah virus yang menginfeksi bakteri dan dapat menghancurkan secara langsung sel bakteri, atau memadukan DNA-nya ke dalam kromosom bakteri. DNA fage yang terintegrasi ke dalam kromosom sel inang dan tinggal di dalamnya tanpa membahayakan inang dinamakan siklus lisogeni. Disisi lain fage juga dapat melisis sel inang setelah bereproduksi dan keluar dengan sejumlah progeni melalui siklus litik. fage umum ditemukan di lingkungan, terutama pada sampel limbah cair. Limbah merupakan habitat bakteri fekal (coliform) dan diduga di dalam limbah mengandung banyak galur fage bakteri koliform yang beragam. Keberadaan fage pada media agar dapat dilihat dengan terbentunya plak pada media tersebut. Plak menandakan bakteri yang ada pada area tersebut mengalami lisis. B. Alat dan Bahan Water bath Limbah cair Kultur cair E. coli umur 3-5 jam Nutrient Agar semi padat (agar 0.7%) Nutrient Agar Buffer Salin C. Cara Kerja Lakukan pengenceran sampel limbah cair 10-1 dan 10-2 dengan menggunakan buffer salin. Siapkan media agar semi padat (suhu 50 C) dalam 4 tabung reaksi, beri label masing-masing tabung dengan 1, 2, 3, dan4. Inokulasikan 1 ml limbah cair yang tidak diencerkan dam 1 ml kultur E. coli pada tabung 1. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8. Inokulasikan 1 ml limbah cair yang telah diencerkan (10-1 dan 10-2) pada tabung 2 dan 3. Buat control pada tabung 4 dengan buffer salin tanpa limbah cair. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8. Biarkan media memadat. Inkubasi selama 48 jam. Hitung jumlah plak yang terbentuk pada setiap cawan, catat ukuran dan bentuk plak.. 85