IDENTIFIKASI GENOTIPE Κ-CASEIN PADA POPULASI SAPI BALI DI PUSAT PEMBIBITAN SAPI BALI

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI GENOTIPE Κ-CASEIN PADA POPULASI SAPI BALI DI PUSAT PEMBIBITAN SAPI BALI (Identification of K-Casein Genetype in Population of Bali Cattle at Bali Cattle Breeding Center) M. A. MU IN dan A. SUPRIYANTONO Fakultas Peternakan, Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Negeri Papua, Manokwari Jl. Gunung Salju, Amban, Manokwari ABSTRACT The present study was conducted to identify of κ-casein genotypes in Bali cattle (Bos sondaicus). Genomic DNA was isolated from blood sample of 60 Bali cattle of Bali Cattle Breeding Centre in Bali province. A 780 bp specific fragment of κ-casein gene spanning from the forth exon region (517 bp) to forth intron (263 bp) was amplified. The result of the RFLP analysis with HindIII indicated that only BB genotype was found at this locus. So, the frequencies of A and B alleles were 0.00 and 1.00, respectively. Comparison with allele frequencies in other cattle breeds indicates that frequencies in Bali cattle (Bos sondaicus) are very different between those observed in Bos taurus and Bos indicus breeds. Key Words: Genotype, κ-casein, RFLP, Bali Cattle ABSTRAK Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi genotip κ-casein pada sapi Bali (Bos sondaicus). DNA genom diisolasi dari sampel darah 60 ekor sapi Bali yang berasal dari Pusat Pembibitan Sapi Bali di Propinsi Bali. Fragmen spesifik gen κ-casein berukuran 780 bp yang merentang dari exon IV (517 bp) hingga intron IV (263 bp) telah diamplifikasi. Hasil analisis RFLP dengan HindIII mengindikasikan bahwa hanya genotip BB yang ditemukan pada lokus ini. Sehingga frekuensi alel A dan B berturut-turut adalah 0,00 dan 1,00. Perbandingan dengan frekuensi allele pada breed lain mengindikasikan bahwa frekuensi pada sapi Bali (Bos sondaicus) sangat berbeda dengan bangsa Bos taurus dan Bos indicus. Kata Kunci: Genotip, κ-casein, RFLP, Sapi Bali PENDAHULUAN Kappa-casein (κ-casein) adalah salah satu protein susu dan merupakan kandidat gen untuk produksi susu, komposisi susu dan pertumbuhan pedet pra-sapih. Kappa-casein pada sapi disandi oleh gen dengan panjang 13 kb yang terbagi dalam 5 exon dan terletak pada kromosom 6 (ALEXANDER et al., 1988). Polimorfisme genetik κ-casein yang dideteksi menggunakan enzim restriksi Hind III dan Taq I, pada sapi umumnya ditemukan dua macam alel: A dan B (LEVEZIEL et al., 1988 dalam CRONIN dan COCKETT, 1993). Alel B mempunyai isoleusin dan alanin berturut-turut pada posisi 136 dan 148 urutan asam amino sebagai pengganti treonin dan aspartat pada alel A (MIRANDA et al., 1993). Alel B dilaporkan sangat menguntungkan untuk produksi susu dan bertanggung jawab untuk protein susu yang tinggi (MAO et al., 1992). Peneliti lain juga melaporkan bahwa alel B dari κ-casein berhubungan dengan tingginya kandungan casein dalam susu (MCLEAN et al., 1984; NG-KWAI-HANG et al., 1987). YAMAMOTO et. al. (1994) melaporkan bahwa sapi jepang tipe pedaging (Japanese Black) bergenotipe κ-casein AA menghasilkan susu lebih tinggi dibandingkan dengan sapi bergenotipe AB, sehingga pedet dari induk bergenotipe AA mempunyai pertambahan bobot badan lebih pesat dibandingkan dengan pedet dari induk bergenotipe AB. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi genotipe κ-casein dalam populasi sapi Bali di Pusat Pembibitan Sapi Bali, Propinsi Bali. 71

2 Genotipe-genotipe κ- casein yang umum ditemukan pada Bos taurus dan Bos indicus diharapkan dapat ditemukan pula pada sapi Bali (Bos Sondaicus), sehingga dapat dipelajari kemungkinannya untuk dimanfaatkan sebagai marka genetik pengontrol pertumbuhan pedet sapi Bali. MATERI DAN METODE Materi penelitian yang digunakan dalam penelitian ini berupa DNA genom sapi Bali, diisolasi dari sampel darah 60 sapi Bali (induk) yang berasal dari Pusat Pembibitan Sapi Bali, milik Proyek Pembibitan dan Pengembangan Sapi Bali (P3Bali), berlokasi di desa Pangyangan, kecamatan Pulukan, kabupaten Jembrana, propinsi Bali. Amplifikasi fragmen DNA spesifik (780 bp) yang merentang dari exon IV (517 bp) sampai intron IV (263 bp) dari gen κ-casein dilakukan dengan menambahkan 2 µl larutan DNA (± 100 ng), sepasang primer [M1, (forward), 5 -CGCTGTGAGAAAGATGAAA GATTC-3 ; M2 (reverse), 5 -AGATTCAAGG A GTATACCAATTGTTG-3, (CHIKUNI et al., 1991)] masing-masing sebanyak 2 µl (16 pmol), dan 19 µl dh 2 O ke dalam tabung 0,2 ml Ready-To-Go PCR Bead (Amersham Biosciences). Amplifikasi dilakukan dengan mesin thermal cycler. Kondisi PCR diprogram sebagai berikut: denaturasi awal 95 o C selama 2 menit, dilanjutkan amplifikasi sebanyak 35 siklus dengan program setiap siklus adalah denaturasi 94 o C selama 1 menit, annealing 55 o C selama 1 menit, ekstensi 72 o C selama 1 menit. Tahap terakhir adalah ekstra ekstensi pada 72 o C selama 5 menit. Produk PCR yang diperoleh didigesti dengan enzim restriksi HindIII. Proses digesti dilakukan dengan memasukkan 10 µl produk PCR, 8 µl dh 2 O dan 2 µl enzim restriksi HindIII ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml, lalu diinkubasikan pada temperatur 37 o C semalam. Produk digesti dielektroforesis pada gel agarose 2% mengandung etidium bromida dalam bufer TBE. Produk digesti setiap sampel DNA diambil 5 µl dan dicampur dengan 2 µl loading bufer, lalu dimasukkan ke dalam sumuran gel. Running gel dilakukan pada tegangan 100 volt selama ± 30 menit dengan melibatkan marker DNA (DirectLoad TM Wide Range DNA Marker, produksi Sigma). Hasil elektroforesis diperiksa dibawah sinar ultraviolet, kemudian difoto. Identifikasi genotipe κ-casein dilakukan dengan membandingkan pola pita hasil elektroforesis setiap sampel terhadap pita marker DNA berdasarkan petunjuk CHIKUNI et al. (1991): genotipe AA (ditunjukkan oleh hadirnya satu pita: 780 bp), AB (tiga pita: 780 bp, 413 bp dan 367 bp), dan BB (dua pita: 413 bp dan 367 bp). Penghitungan frekuensi alel dan genotipe κ-casein populasi sapi Bali penelitian dilakukan berdasarkan petunjuk WARWICK et al. (1990). HASIL DAN PEMBAHASAN Fragmen DNA spesifik berukuran 780 bp yang merentang dari exon IV sampai intron IV dari gen κ-casein yang mengandung daerah polimorfik (CHIKUNI et al., 1991), telah berhasil diamplifikasi dari DNA genom sapisapi Bali penelitian menggunakan primer M1 dan M2. Digesti produk PCR dengan HindIII pada seluruh sampel menghasilkan dua fragmen DNA, yaitu 413 bp dan 367 bp. Pola pemotongan demikian diidentifikasi sebagai genotipe BB (CHIKUNI et al. 1991). Dengan demikian, berdasarkan analisis PCR- RFLP/HindIII hanya ditemukan satu macam alel, yaitu alel B. Alel B κ-casein ditunjukkan oleh berhasilnya HindIII menemukan sekuen DNA yang dikenali (5..A AGCTT..3 ) disepanjang produk PCR dan berhasil memotongnya menjadi dua fragmen berukuran 413 bp dan 367 bp. Berdasarkan sekuen DNA yang tersedia pada GenBank No. EF serta hasil sekuensing asam amino yang dilakukan ALEXANDER et al. (1988) dapat dijelaskan bahwa berhasilnya HindIII menemukan sekuen yang dikenali ini disebabkan terdapat mutasi dari nukleotida A pada sekuen 5 -..AAGATT..3 menjadi nukleotida C, sehingga sekuen tersebut berubah menjadi 5 -..AAGCTT..3. Adanya mutasi nukleotida tunggal tersebut menyebabkan urutan kodon triplet yang terbentuk adalah GCT yang menyandi asam amino alanin (Ala) pada posisi 148 dari polipeptida κ-casein. Sebaliknya, alel A (tidak ditemukan dalam penelitian ini) secara teoritis 72

3 ditunjukkan dengan gagalnya HindIII menemukan sekuen DNA yang dikenali disepanjang produk PCR sehingga gagal memotongnya. Akibatnya ukuran produk PCR sebelum dan sesudah didigesti dengan HindIII tetap sama, yaitu 780 bp. Gagalnya HindIII menemukan sekuen DNA yang dikenali disebabkan sekuen DNA yang seharusnya dikenali oleh enzim tersebut tidak mengalami mutasi, sehingga urutan kodon triplet yang terbentuk adalah GAT yang menyandi asam amino asam aspartat (Asp) pada posisi 148 dari polipeptida κ-casein. Karena alel A tidak ditemukan pada sapi Bali uji, maka individu bergenotipe κ-casein AA dan AB tidak ditemukan pada sapi Bali uji. Gambar 1 memperlihatkan genotipe κ-casein yang ditemukan pada sapi Bali penelitian. Identifikasi genotipe κ-casein dari 60 sapi Bali penelitian, ditemukan seluruhnya bergenotipe BB, sehingga frekuensi alel A dan B berturut-turut 0 (nol) dan 1 (satu). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen κ- casein bangsa sapi Bali (Bos sondaicus) bersifat tidak polimorfik, dimana urutan asam amino yang ke-148 dari rantai polipeptida seluruh sapi Bali penelitian diduduki oleh alanin sebagai pengganti aspartat pada alel A (MIRANDA et al., 1993). Tabel 1 menyajikan frekuensi alel A dan B dari gen κ-casein pada bangsa sapi Bali (Bos sondaicus) yang ditemukan dalam penelitian ini dan beberapa bangsa sapi lainnya (Bos taurus dan Bos indicus) yang pernah dilaporkan, sebagai pembanding. Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa Bos taurus umumnya memiliki alel B dengan frekuensi lebih tinggi dibandingkan Bos indicus, sedangkan pada sapi Bali (Bos sondaicus), khususnya di wilayah penelitian, alel B ditemukan dengan frekuensi tertinggi dari semua bangsa-bangsa sapi, baik yang tergolong Bos taurus maupun Bos indicus. Berdasarkan frekuensi alel-alel dari κ- casein (Tabel 1) maka dapat dikatakan bahwa sapi Bali (Bos sondaicus) berbeda dengan Bos taurus maupun Bos indicus bp 750 bp 780 bp 413 bp 367 bp M P BB BB Gambar 1. PCR-RFLP/HindIII Gen κ-casein Sapi Bali Penelitian Lajur 1: M, DNA Marker (50 bp hingga bp); lajur 2: P, produk PCR (uncut; 780 bp); lajur 3 dan 4: genotipe BB (413 bp dan 367 bp) 73

4 Tabel 1. Frekuensi alel κ-casein sapi Bali (Bos sondaicus) dan beberapa bangsa Bos taurus dan Bos indicus Bangsa sapi Frekuensi alel κ-casein A B Sumber Sapi Bali (Bos sondaicus) 0,00 1,00 - Jersey (Bos taurus) 0,11 0,89 TAMBASCO (1998) Jersey (Bos taurus) 0,32 0,77 BARROSO et al. (1997) Rubia Gallega (Bos taurus) 0,52 0,48 VIANA et al. (2000) Criollo da Argentina (Bos taurus) 0,65 0,35 GOLIJOW et al. (1999) Argentine Holstein (Bos taurus) 0,66 0,34 GOLIJOW et al. (1999) Frisien Holstein (Bos taurus) 0,68 0,32 BARROSO et al. (1997) Japanese Black (Bos taurus) 0,77 0,23 YAMAMOTO et al. (1994) Pantaneiro (Bos taurus) 0,78 0,22 LARA et al. (2002) Sahiwal (Bos indicus) 0,84 0,16 MITRA et al. (1998) Nellore (Bos indicus) 0,91 0,09 KEMENES et al. (1999) Gyr (Bos indicus) 0,93 0,07 KEMENES et al. (1999) Alel κ-casein sapi Bali selain yang ditemukan pada sapi Bali dalam wilayah penelitian ini mungkin saja dapat ditemukan pada wilayah lain, mengingat penyebaran sapi Bali cukup luas tidak hanya di Indonesia melainkan sampai di luar negeri. Apabila di luar pulau Bali ditemukan alel lain disamping alel B pada sapi Bali (gen κ-casein sapi Bali bersifat polimorfik), maka hubunganya dengan aspek pertumbuhan dapat dipelajari. Namun, apakah alel lain selain alel B yang mungkin ditemukan pada sapi Bali di luar pulau Bali merupakan tipe alel yang memang seharusnya terdapat pada sapi Bali atau merupakan hasil migrasi dari bangsa sapi lain, hal ini patut dipertanyakan, mengingat akhir-akhir ini beberapa persilangan sapi Bali dengan bangsa sapi lain (Bos taurus) telah dipraktekkan di beberapa wilayah di Indonesia. Beberapa informasi menyebutkan bahwa pulau Bali merupakan pusat distribusi sapi Bali di Indonesia (PAYNE dan ROLLINSON, 1973), pusat gen asli sapi Bali (NOZAWA, 1979), dan pusat bibit sapi Bali (DARMADJA, 1980). Pemerintah juga telah mencanangkan program pemurnian dan peningkatan mutu sapi Bali, melalui Proyek Pembibitan dan Pengembangan Sapi Bali (P3Bali) sejak tahun 1976, dimana propinsi Bali ditetapkan sebagai wilayah untuk pelaksanaan program tersebut. Pada wilayah ini tidak dibenarkan adanya persilangan sapi Bali dengan bangsa sapi lain agar terjaga kemurniannya, dan seleksi merupakan sistem yang diterapkan dalam program peningkatan mutu sapi Bali. Oleh karena itu, gen κ-casein yang ditemukan tidak polimorfik pada sapi Bali penelitian ini menunjukkan bahwa selama ini dalam populasi sapi Bali di wilayah penelitian (Pulau Bali) tidak terjadi mutasi gen maupun migrasi gen dari bangsa lain. Dengan mengabaikan kemungkinan mutasi gen dimasa yang akan datang, genotipe BB κ-casein pada sapi Bali di pulau Bali ini mungkin dapat dimanfaatkan sebagai salah satu indikator untuk menilai kemurnian populasi sapi Bali di suatu wilayah tertentu. KESIMPULAN Genotipe κ-casein pada populasi sapi Bali di Pusat Pembibitan Sapi Bali di Propinsi Bali hanya ditemukan BB, genotipe AA dan AB tidak ditemukan sehingga tidak dapat dihubungkan dengan aspek pertumbuhannya. Genotipe BB dari κ-casein sapi Bali ini dapat dimanfaatkan sebagai salah satu indikator untuk menilai kemurnian populasi sapi Bali di suatu wilayah tertentu. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menyampaikan terimakasih kepada Direktur P3M, Ditjen DIKTI Depdiknas R.I., 74

5 atas pendanaan penelitian ini melalui Penelitian Hibah Bersaing XV Tahun 2007; dan juga kepada Pimpinan beserta staf Pusat Pembibitan Sapi Bali, P3Bali atas ijin dan bantuannya dalam koleksi sampel darah sapi Bali. DAFTAR PUSTAKA ALEXANDER, L., A.F. STEWART, A.G. MACKINLAY, T.V. KAPELINSKAYA, T.N. TKACH and S.I. GORODETSKY Isolation and characterization of the bovine κ-casein gene. Eur. J. Biochem. 178: CHIKUNI K., S. KAGEYAMA, T. KOISHIKAWA, S. KATO and K. OZUTSUMI Identification of ovine κ-casein genotype using polymerase chain reaction method. Anim. Sci. Technol. (Jpn). 62: CRONIN, M.A. and N. COCKETT Kappa-casein polymorphism among cattle breeds and bison herds. Animal Genetics 24: DARMADJA, D Setengah Abad Peternakan Sapi Tradisional dalam Ekosistem Pertanian di Bali. Disertasi. Universitas Padjadjaran, Bandung. MAO, I.L., L.G. BUTTAZZONI and R. ALEANDRI Effects of Polymorphic Milk Protein Genes on Milk Yield and Composition Traits in Holstein Cattle. Journal Acta Agric. Scand Sect. A, Animal Sci. 42: 1 7. MCLEAN, D.M., E.R.B. GRAHAM, R.W. PONZONI and H.A. MCKENZIE Effects of milk protein genetic variants on milk yield and composition. J. Dairy Res. 51: 531. MIRANDA, P., P. ANGLADE, M.F. MAHE and G. ERHARDT Biochemical characterization of the bovine genetic κ-casein C dan E variants. Animal Genetic 24: NG-KWAI-HANG, K.F., J.F. HAYES, J.E. MOXLEY and H.G. MONARDES Variation in milk protein concentration associated with genetic polymorphisme and environmental factors. J. Dairy Sci. 70: 563. NOZAWA, K Phylogenetic Studies on the Native Domestic Animals in East and Southeast Asia. Proceeding Workshop Animal Genetic Resources in Asia and Oceania. Tsukuba, 3 7 September Tsukuba: Society for the Advancement of Breeding Researches in Asia and Oceania (SABRAO). p PAYNE, W.J.A. and D.H.L. ROLLINSON Bali Cattle. World Anim. Rev. 7: TAMBASCO, M.D Detecaso de Polimorfismodos Genes De Kappa-Casina E Beta-Lactoglobulina Em Animais Da Raca Jersey. Monografia: Universidade Federal de Sao Carlos, SP. WARWICK, E.J., J.M. ASTUTI and W. HARDJOSUBROTO Pemuliaan Ternak. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. YAMAMOTO, T., K. SHIMADA, M. TAKAHASHI, T. TABATA, N. TAKENOUCHI, K. OHSHIMA, A. KIKKAWA, O. NAKAYAMA and M. KOSUGIYAMA Genotype Effect of κ- Casein on Milk Performance in Japanese Black Cows. Journal Anim. Sci.Technol. (Jpn.) 65(12):