disterilisasi kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum.

Transkripsi

1 METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioproses Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI), jalan Taman Kencana No 1 Bogor. Penelitian dilaksanakan selama 8 bulan yang dimulai pada bulan November 2007 sampai dengan bulan Juli Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: bejana Erlenmeyer, tabung reaksi, shaker, vortex, syringe, chamber KLT (kromatografi Lapis Tipis), autoklaf, terrnometer, ph meter, stirrer, magnetic stirrer, kolom kromatografi, statip, buret, gelas piala, corong Buchner, spatula, pengaduk gelas, gelas ukur, cawan petri, pipet tetes, labu ukur, neraca analitik, oven, dan lemari es. Bahan yang dibutuhkan yaitu: Potato Dextrose Agar (PDA) (Difco), MgS04.7H20 (E- Merck), Bacto pepton (Difco), asam sitrat (E-Merck), polivinil alkohol (E-Merck), kalium dihidrogen fosfat (E-Merck), dikalium hidrogen fosfat (E-Merck), aseton (E-Merck), tris hidroksiarninometan (E-Merck), gliserol (E-Merck), petroleum benzene (E-Merck), asam asetat glasial (E-Merck), dietileter (E-Merck), asam klorida (E-Merck), natrium hidroksida (E-Merck), etil asetat (E-Merck), heksana (E-Merck), iodine (E-Merck), lempeng KLT silika gel G-60 (E-Merck), silika gel serbuk G-60 F254 (E-Merck), kertas saring Whatman No 40, glass wool, kertas HVS 80 g, fenolftalein, lipase komersial Rhizomucor miehei (Sigma), 1,3 diasilgliserol (Sigma), 1,2 diasilgliserol (Sigma), tripalmitin (Sigma), fungi yang digunakan yaitu Rhizopus sp dan Monilia sitophila koleksi dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, dan CPO yang didapat dari PT Perkebunan Nusantara VIII. Metode Kerja Pembuatan Media Padat Media padat yang digunakan adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Media PDA dibuat dengan cara melarutkan 39 g PDA (Difco) ke dalarn 1L akuades lalu

2 disterilisasi kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum. Pembuatan Media Fermentasi Media fermentasi terdiri dari 1 gram MgS04, 1 gram K&P04, 50 gram pepton, dan 30 ml CPO kemudian dilarutkan ke dalam 1 L akuades. Medium fermentasi yang telah homogen dibagi masing-masing 50 ml dan dituang ke dalam Erlenmeyer 250 ml kemudian disterilisasi (Christakopoulos et al. 1992). Pembuatan Medium Gliserolisis Medium gliserolisis mengandung 0,8 g gliserol, 40 ml heksana, 50 ml buffer tris HC150 rnmol ph 7, dan 2 g CPO (Mappiratu 1999). Pemilihan Isolat Penghasil Lipase Terbaik Percobaan pendahuluan dilakukan untuk memilih satu buah isolat yang menghasilkan aktivitas lipase tertinggi. Isolat pertama yaitu Neurospora sitophila, isolat ini merupakan koleksi dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Mikroba kedua yang digunakan yaitu Rhizopus sp. Rhizopus yang digunakan ada tiga buah isolat yang berbeda. Rhizopus pertama (Rl) merupakan isolat koleksi dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Laboratorium Mikroba. Isolat ini mulanya hasil isolasi dari tempe. Isolat Rhizopus kedua (R2) didapat dari isolasi mikroba dari tanah koleksi Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Laboratorium Mikroba. Sedangkan isolat Rhizopus ketiga (R3) didapat dari isolasi jamur tempe yang berasal dari Bogor dan koleksi Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Laboratorium Bioproses. Pertama kali isolat ditumbuhkan ke dalam media agar kentang (PDA). Setelah itu isolat yang telah tumbuh di PDA diambil satu ose, kemudian dimasukkan ke dalam medium fermentasi. Kemudian kultur dikocok dengan kecepatan 120 rpm selama 7 hari, setiap hari sampel diambil untuk dihitung biomassa sel kering dan kadar asam lemak bebas untuk menentukan aktivitas katalitik dari lipasenya. Pemanenan dilakukan dengan cara sampel disaring

3 dengan vakurn menggunakan kertas saring Whatman No. 40 yang telah diketahui bobotnya (Price & Stevens 1996). Biomassa sel dikeringkan dalam oven dengan suhu 60 OC hingga bobotnya konstan dan filtrat digunakan untuk menghitung aktivitas lipase. Uj i Aktivitas Lipase Penentuan kadar asam lemak bebas (Ibrahim 1991) dilakukan dengan melarutkan 3 g CPO dan 1 g polivinil alkohol ke dalam 40 ml buffer fosfat-sitrat ph 5 dan ditambah dengan 1 ml larutan enzim. Sampel diinkubasi pada suhu 37 OC selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 20 ml campuran aseton : etanol (1:l vlv). Kemudian sampel dititrasi menggunakan NaOH 0,05 N menggunakan indikator fenolhlein hingga titik akhir berwarna merah muda. Kemudian kadar asam lemak bebas dihitung menggunakan persamaan: i I V X N NaOH X BM NaOH Kadar asam lemak bebas = Bobot sampel Keterangan: V = Volume NaOH yang dipakai untuk titrasi N NaOH = Normalitas NaOH BM = Berat molekul NaOH Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah enzim untuk membebaskan 1 mol asam lemak bebas per menit pada kondisi percobaan. Setelah isolat terbaik didapat yaitu isolat yang menghasilkan aktivitas lipase tertinggi dan waktu optimumnya, maka isolat tersebut digunakan sebagai penghasil lipase yang akan digunakan selanjutnya dalam proses hidrolisis enzimatik. Isolat tersebut ditanam dalam medium fermentasi kemudian enzimnya dipanen berdasarkan waktu optimum yang telah diperoleh.

4 Isolasi Enzim Lipase Pemanenan enzim dilakukan dengan menyaring kultur agar sel fungi terpisah dari medium. Penyaringan dilakukan dengan vakum menggunakan corong Buchner, kertas saring yang digunakan yaitu kertas saring Whatman No 40. Filtrat diekstraksi menggunakan aseton dingin dengan perbandingan filtrat dan aseton 1 :2. Endapan kemudian dicuci menggunakan bder tris HC1 ph 7, setelah larut lalu disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 15 menit (Muderhwa & Ratomahenina 1985). Ekstrak enzim kasar disimpan dalam lemari pendingin sampai siap digunakan dalam produksi DAG (penyimpanan tidak lebih dari dua hari). Metode lain untuk mendapatkan ekstrak enzim kasar yaitu cairan fermentasi yang telah dipisahkan biomassanya langsung dikeringbekukan Weeze dried). Serbuk yang didapat disimpan di dalamfieezer untuk kemudian dipakai dalam produksi DAG. Sampel kemudian diuji aktivitas enzimnya. Sampel dengan aktivitas enzim tertinggi akan digunakan dalam reaksi gliserolisis. Optimasi Produksi DAG Penentuan kondisi optimum produksi DAG meliputi empat parameter yaitu: ph optimum, suhu optimum, konsentrasi substrat optimum, dan waktu optimum (Wilson & Walker 1994). Produksi DAG dilakukan dengan cara menambahkan ekstrak enzim kasar yang telah diperoleh ke dalam medium gliserolisis. Penetapan kondisi optimum yang pertarna kali yaitu penetapan waktu optimum. Ekstrak enzim kasar dimasukkan ke dalam medium gliserolisis lalu medium diinkubasi pada suhu ruang. Sampel diambil setiap hari untuk dihitung kadar TAG, DAG, dan MAG-nya. Reaksi gliserolisis dihentikan hingga didapat waktu optimum dalam memproduksi DAG. Setelah waktu optimum produksi DAG didapat, percobaan dilanjutkan dengan penentuan substrat optimum. Ekstrak enzim dimasukkan ke dalam media gliserolisis, hanya saja substrat CPO konsentrasinya divariasi (lg, 2 g, dan 3 g). Kemudian medium diinkubasi pada suhu ruang dan penghentian waktu gliserolisis berdasarkan pada waktu optimum yang telah didapat. Pada akhir reaksi kadar DAG dihitung dengan metode yang sama.

5 Penentuan ph optimum reaksi gliserolisis dilakukan dengan variasi ph 6, 6.5, 7, 7.5, dan 8. Dengan kondisi waktu dan konsentrasi substrat yang telah ditentukan. Kemudian komponen hasil hidrolisis dihitung dengan metode yang sama. Setelah waktu, konsentrasi substrat, dan ph optimum dari reaksi gliserolisis ditentukan, tahap selanjutnya untuk penetuan kondisi optimum yaitu variasi suhu inkubasi. Reaksi gliserolisis dilakukan di atas suhu ruang yaitu 37 "C, 42 OC, dan 50 "C. Kadar DAG yang didapat dihitung dengan metode yang sama. Reaksi gliserolisis diulang dengan menggunakan kondisi optimum kemudian sampel dipanen untuk optirnasi teknik pernisahan produk. Analisis TAG, DAG, MAG, dan FFA Fraksi masa komponen TAG, DAG, MAG, dan FFA dari reaksi gliserolisis dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) (AOAC 1995). Lempeng yang digunakan adalah lempeng silika gel G 60, sebanyak 10 pl contoh ditotolkan sedikit demi sedikit ke dalam lempeng tersebut dan dielusikan dengan campuran petroleum benzene : dietileter : asam asetat glasial(90: 10: 1). Lempeng KLT yang sudah dielusikan dibiarkan mengering terlebih dahulu, kemudian visualisasi noda dilakukan dengan menggunakan uap iodine. Kristal iodine dituangkan ke dalam cawan petri hingga rata. Lempeng KLT yang sudah kering diletakkan di atas cawan petri selama dua menit (hingga terlihat noda cokelat). Noda yang terlihat langsung diberi tanda menggunakan pensil. Noda yang terlihat dijiplak menggunakan kertas HVS 80 gr lalu ditimbang bobotnya. Fraksi masa komponen dihitung dengan persamaan:

6 Pemisahan TAG, DAG, MAG, dan FFA Hasil Hidrolisis CPO Setelah semua kondisi optimum produksi DAG didapat kemudian dicari teknik pemisahan DAG dari komponen lain yang ada di dalam medium gliserolisis. Teknik yang dicoba yaitu teknik kromatografi kolom (Watanabe 2006). Kolom kromatografi (panjang 30 cm diameter 2,5 cm) diisi dengan glass wool setinggi 1 cm dan silika gel secara perlahan hingga padat (sebelurnnya 7 gr silika gel dibuat bubur dengan menggunakan larutan heksana : etilasetat (80:20, vlv)). Contoh hail gliserolisis sebanyak 20 rnl dimasukkan ke dalam kolom lalu dielusikan dengan campuran heksana : etil asetat (80:20, vlv). Setiap fraksi dikumpulkan sebanyak 1 ml. Fraksinasi dihentikan apabila hasil fi-aksinasi sudah terlihat jernih. Komposisi hasil gliserolisis tiap-tiap fraksi dianalisis menggunakan metode KLT. Selain dari kolom kromatografi teknik pernisahan yang dicoba yaitu teknik pendinginan bertahap. Pendinginan dimulai dari suhu 20 OC, 15 OC, dan 10 OC. Contoh yang terpisahkan dengan kristalisasi dianalisis menggunakan metode KLT. Diharapkan pada 20 OC TAG mengkristal kemudian diikuti dengan kristalisasi DAG pada suhu 15 OC, dan MAG pada 10 OC. Teknik pendinginan yang lain yaitu pendinginan pelarut (modifikasi Watanabe 2006). Sampel hasil gliserolisis dilarutkan ke dalam heksana dengan perbandingan 1:4. Sampel yang telah dilarutkan disimpan dalam lemari pembeku selama 24 jam, lapisan cair yang terbentuk disentrifbgasi dengan kecepatan rpm selama 15 menit pada suhu 4 OC. Setiap produk yang terbentuk atau terpisah dianalisis menggunakan KLT. Perbesaran Skala Gliserolisis dm Pemurnian DAG Reaksi gliserolisis CPO dan teknik pemisahan komponen hail gliserolisis yang optimum digunakan untuk reaksi gliserolisis dalam skala yang lebih besar dan reaksi gliserolisis berulang. Reaksi gliserolsis berulang dilakukan dengan menggunakan substrat TAG hasil pemisahan. Reaksi gliserolisis berulang dihentikan ketika kadar TAG sudah relatif sedikit. Perhitwigan kadar TAG dihitung menggunakan metode KLT.

7 Skala gliserolisis diperbesar menjadi 10 kali lipat dari skala sebelurnnya. Besarnya medium yang digunakan menjadi 400 ml heksana, 500 ml buffer tris HCl 50 mm ph 7, 8 g gliserol, clan 30 g CPO. Suhu reaksi gliserolisis diset pada 42 OC dan diinkubasi selama 18 jam. Kemudian DAG diisolasi dengan Kromatografi kolom. Jumlah silika yang digunakan juga diperbesar menjadi 10 kali lipat. Sebanyak 70 g silika gel digunakan sebagai fasa diam pada kromatografi kolom. Hasil Msinasi yang mengandung TAG dikumpulkan kemudian pelarutnya diuapkan. Setelah sampel bebas dari pelarut TAG yang tersisa ditimbang bobotnya kemudian digliserolisis lagi dan difiaksinasi kembali.