BAB III METODE PENELITIAN. Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan September - Desember 2013 di

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu Dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan September - Desember 2013 di Laboratorium Pembinaan dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) Provinsi Gorontalo. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan untuk analisis histamin dengan spektrofluorometri (SNI ) adalah labu erlenmeyer, gelas ukur, pisau, homogenizer (blender), water bath, labu ukur, kertas saring Whattmann, spektrofluorometer tipe Varian Cary Eclipse FL0811M007, glass wool, pipet volumetrik, pipet tetes, kolom kromatografi, timbangan analitik dan buret. Alat yang digunakan untuk analisis ph adalah ph meter dan alat yang digunakan untuk uji Coliform adalah waterbath, incubator, botol pengencer, tabung durham, tabung reaksi, timbangan, pipet atau pippetor 1ml, dan blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher. Bahan yang digunakan untuk analisis histamin adalah daging ikan cakalang, metanol, aquadest, NaOH, HCL, OPT dan resin. Bahan yang digunakan untuk analisis ph adalah daging ikan cakalang, buffer, dan akuades, sedangkan bahan yang digunakan untuk uji Coliform adalah daging ikan cakalang, Lauryl Tryptose Broth (LTB), larutan butterfield s phosphate buffered dan Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) broth 2%. 30

2 3.3 Prosedur Penelitian Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui waktu pelelehan es. Tahapan penelitian pendahuluan dapat diuraikan sebagi berikut : 1. Sampel ikan cakalang (K. pelamis) yang akan digunakan dibeli dari TPI Tenda Kota Gorontalo. 2. Ikan cakalang (K. pelamis) yang dibeli, disimpan dalam sterofom dan diberi es curai dengan perbandingan 2 : 1 (Ilyas,1983) 3. Mengamati proses terjadinya perubahan suhu hingga mencapai 5 0 C. Penelitian utama yaitu melakukan pengujian tingkat kesegaran ikan cakalang (K. pelamis) selama penyimpanan dingin. Tahapan penelitin dapat diuraikan sebagai berikut: 1. Sampel ikan cakalang (K. pelamis) yang akan digunakan dibeli dari TPI Tenda Kota Gorontalo. 2. Ikan cakalang (K. pelamis) yang dibeli, disimpan dalam sterofom dan diberi es dengan perbandingan 2 : 1 selama pengangkutan ke LPPMHP. 3. Ikan cakalang (K. pelamis) dibagi menjadi 6 bagian (1 bagian untuk kontrol, dan 5 bagian untuk perlakuan) 4. Ikan ditimbang ± 1kg. 5. Ikan dimasukan kedalam sterofom, tiap sterofom berisi es curai dan ikan dengan perbandingan 2:1. 31

3 6. Dilakukan penyimpanan selama 5 hari. Jika suhu sudah mencapai 5 0 C maka dilakukan pergantian es yang baru dengan rasio yang sama. 7. Pengujian histamin, ph, dan Coliform dilakukan setiap hari hingga hari terakhir penyimpanan. 32

4 Pengambilan sampel di TPI tenda Kota Gorontalo Penanganan dengan es 2:1 selama pengangkutan ke LPPMHP Penyimpanan dingin 5 0 C selama 5 hari Pengujian Histamin ph Coliform Hasil Keterangan : proses perlakuan analisis hasil Gambar 3. Diagram Alur Penelitian 3.4 Teknik Pengumpulan Data Data dalam penelitian ini terdiri atas data primer dan data sekunder. Data primer merupakan hasil penelitian yang diperoleh dari perhitungan analisis, dan data 33

5 sekunder merupakan literatul yang mendukung data primer yang terdiri atas data-data statistik, jurnal, buku, dan karya tulis pendukung. Metode penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental. Metode eksperimental yaitu dimana suatu penelitian yang dilakukan dengan cara mengubah suatu keadaan untuk melihat kejadian yang timbul akibat dari perubahan tersebut (Mantjoro, dkk, 1990) 3.5 Prosedur Pengujian Sampel Prosedur kerja analisis dalam pengujian sampel pada penelitian ini meliputi analisis kadar histamin, ph, dan Coliform Analisis kadar histamin (SNI ) Prinsip penentuan kadar histamin secara spektroflorometri adalah histamin diekstrak dari jaringan daging contah menggunakan methanol dan sekaligus mengkonversi histamin ke dalam bentuk OH. Zat-zat histamin selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah kebentuk derivatnya dengan senyawa OPT. Besarnya flouresensi histamin diukur secara flourometri. Prosedur kerja analisis kadar histamin terdiri atas tiga tahap, yaitu sebagai berikut : a) Tahap ekstraksi Sepuluh gram sampel ditimbang lalu ditambahkan dengan methanol sebanyak 50 ml kemudian dihomogenkan dengan homogenizer (blender) kurang lebih selama 1-2 menit. Sampel yang sudah dipanaskan dalam water bath pada suhu 60 C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan methanol sampai tanda tera lalu dikocok agar homogen. Setelah itu, larutan sampel disaring menggunakan kertas 34

6 saring dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Filtrat dari hasil penyaringan akan digunakan pada proses clean up. b) Tahap clean up atau tahap elusi Pertama-tama disiapkan kolom kromatografi (panjang 20 cm dan diameter 7 mm) kemudian ke dalam kolom tersebut dimasukkan glass wool secukupnya (tingginya 1 cm). Selanjutnya resin penukar ion ( dowex 1-x mesh) dimasukkan ke dalam kolom sampai tingginya kurang lebih 8 cm (diusahakan resin tidak sampai kering dengan cara dibilas dengan akuades karena akan mempengaruhi daya kerja penukar ion tersebut). Selanjutnya sampel filtrat hasil penyaringan pada tahap ekstraksi dilewatkan ke dalam kolom sebanyak 1 ml dan ditampung hasilnya dalam labu ukur yang telah diberi 5 ml HCl 1 N. c) Tahap pembentukan Sebanyak 10 ml HCl 0,1 N dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 5 ml sampel hasil tahap celan up/elusi, 5 ml standar histamin (sebagai larutan standar), dan 5 ml HCl 0,1 N (sebagai blanko). Setelah itu, ditambahkan 3 ml NaOH 1 N ke dalam tabung reaksi lalu dihomogenkan dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lagi ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) 1% sebanyak 1 ml lalu dihomgenkan dan didiamkan selama 4 menit. Selanjutnya ditambahkan 3 ml H 3 PO 4 3,57 N dan dihomogenkan. Setelah selesai, sampel yang telah melalui tahap pembentukan siap untuk dibaca menggunakan spektrofluorometer. 35

7 10 gr daging ikan + 50 methanol Blender hingga homegen Panaskan dalam waterbath selama 15 M Dindinkan pada suhu ruang Tepatkan hingga 10 ml dengan methanol Saring dengan kertas saring Masukan 1 ml dalam kolom resin + aquadest saat tinggi cairan Derivatisasi 5 ml flitrat contoh standar dan blanko + 10 ml Hcl 0,1 N Kocok + 3 ml Naoh 1 N Kocok + 1 ml OPT 0,1 % Kocok + 3 ml H 3 PO 4 Kocok Pembacaan dengan spektrofolometer Tampung hingga 10 ml Derivatisasi Gambar 4 : Diagram Alur Analisis Histamin 36

8 Rumus perhitungan kadar histamin (ppm) adalah sebagai berikut : Konsentrasi histamine (ppm) contoh = Histamin (ppm) contoh = A h ( ) h Keterangan : A Fp = konsentrasi (X) yang didapat dalam perhitungan (ppm) = Faktor pengencer Derajat Keasaman (ph) (Sudarmadji et al, 1984) Sebanyak 2 g sampel dilarutkan dalam 20 ml aquades. Sampel kemudian dihomogenkan. Kemudian diukur ph dengan mencelupkan ph meter. Sebelumnya ph meter dilakukan kalibrasi pada buffer ph 4. Timbang 2 g sampel Larutkan dalam 20 ml aquadest Hasil Gambar 5 : Diagram Alur Penelitian Uji ph 37

9 3.5.3 Uji Bakteri Coliform (SNI 3144:2009) 1. Persiapan contoh Timbang contoh sebanyak 25 gram, kemudian masukan dalam wadah atau plastic steril, tambahkan 225 ml larutan butterfield s phosphate buffered, homogenkan selama 2 menit. Homogeny ini merupakan larutan dengan pengenceran a. Uji pendugaan 1. Siapkan pengenceran 10-2 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 kedalam 9 ml larutan pengenceran butterfield s phosphate buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. 2. Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran kedalam 3 Lauryl Triptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. 3. Masukkan tabung-tabung tersebut kedalam incubator pada suhu 35 0 C selama (48±2)jam 4. Amati tabung-tabung tersebut pada jam ke (24± 2). Jika ada tabung yang telah mengandung gas, maka tabung tersebut dinyatakan positif. 5. Tabung-tabung yang belum mengandung gas dinyatakan negatif, lanjutkan inkubasi selama 24 jam. 38

10 6. Catat adanya pembentukan gas setelah inkubasi (48± 2) jam karena ini adalah uji pendugaan yang positif coliform untuk tabung-tabung yang negatif, dan 7. Lakukan uji penegasan terhadap semua tabung yng positif untuk uji pendugaan. b. Uji penegasan 1. Dengan menggunakan jarum ose, inokulasikan tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB broth yang berisi tabung durham. Inkubasi EC broth yang telah diinokulasi dalam waerbath sirkulasi selama (48±2) jam pada suhu 35 0 C. 2. Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama (48±2) jam pada suhu 35 0 C. 3. Catat semua tabung BGLB yang positif menghasilkan gas dengan menggunakan tabel Angka Paling Mungkin (APM), tentukan APM berdasarkan jumlah tabung BGLB yang memperlihatkan pembentukan gas dalam jumlah berapapun, selama (48±2)jam pada (35±1 ) 0 C 4. Laporkan sebagai APM bakteri coliform per gram 39

11 Pembuatan Media Uji pendugaan Timbang 25 g ml butterfild Sampel ditanam dalam media Inkubator selama 2 hari Catat adanya pembentukan gas Lakukan uji penegasan Gunakan jarum ose untuk menanam sampel Periksa tabung yang menghasilkan gas Catat tabung yang positif Hasil Gambar 6 : Diagram alur pegujian Coliform 3.6 Analsis Data Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan kehomogenan ragam satuan percobaan merupakan suatu rancangan yang sangat sederhana yaitu dengan satu faktor atau satu perlakuan yaitu lama penyimpanan (Budi Susetyo dan Aunuddin, 1992 dalam Yusnandar, 2002). Ulangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 kali ulangan. Model Rancangan Acak Lengkap sebagai berikut : Y ij = μ+ T i +I ij 40

12 dimana : Yij= Respon pada perlakuan selama penyimpanan μ= Rata-rata Umum Ti= Pengaruh perlakuan ke-i Iij= Pengaruh galat percobaan 3.7 MATRIKS PENELITIAN PERLAKUAN PENYIMPANAN (HARI) ULANGAN A Hari A1.1 A1.2 1 Hari A2.1 A2.2 2 Hari A3.1 A3.2 3 Hari A4.1 A4.2 4 Hari A5.1 A5.2 5 Hari A6.1 A6.2 41