KAJIAN RESIDU BETA LAKTAM DALAM SUSU PASTEURISASI IMPOR DARI AUSTRALIA MELALUI PELABUHAN UDARA SOEKARNO-HATTA TRIFERA MELANINGRUM

Transkripsi

1 KAJIAN RESIDU BETA LAKTAM DALAM SUSU PASTEURISASI IMPOR DARI AUSTRALIA MELALUI PELABUHAN UDARA SOEKARNO-HATTA TRIFERA MELANINGRUM SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

2

3 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Residu Beta Laktam dalam Susu Pasteurisasi Impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta adalah karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Juni 2012 Trifera Melaningrum NIM. B

4

5 ABSTRACT TRIFERA MELANINGRUM. Study on Beta-lactam Residue in Imported Pasteurized Milk from Australia through Soekarno-Hatta Airport. Under direction of MIRNAWATI SUDARWANTO and HADRI LATIF. Beta-lactam antibiotic residue occurs in pasteurization milk due to application of beta-lactam antibiotic in dairy cattle treatment. The residue does not only create problems in dairy industry but also have impact on public health. The aims of the study were to determine the presence and the amount of beta-lactam antibiotic in imported pasteurization milk. Sample size was calculated using the formula to detect disease according Canon and Roe (1982) cited by Martin et al. (1987). The sixty samples of imported pasteurized milk from Australia were used in this study. The bioassay (screening test) was used and followed by confirmation test used high performance liquid chromatography (HPLC). Both of the tests showed negative result. It means all of the samples did not contain betalactam antibiotic. Keywords: pasteurized milk, beta-lactam antibiotics, residue, bioassay, HPLC

6

7 RINGKASAN TRIFERA MELANINGRUM. Kajian Residu Beta Laktam dalam Susu Pasteurisasi Impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Dibimbing oleh MIRNAWATI SUDARWANTO dan HADRI LATIF. Susu merupakan bahan pangan asal hewan yang mempunyai nilai gizi baik dan seimbang. Konsumsi susu di Indonesia semakin meningkat seiring dengan kenaikan jumlah penduduk, peningkatan kesejahteraan, dan kesadaran masyarakat akan pentingnya sumber protein hewani. Susu berkualitas baik haruslah aman, dan layak dikonsumsi. Keberadaan residu antibiotika dalam susu menjadikan susu tidak aman dikonsumsi karena dapat menimbulkan gangguan kesehatan. Antibiotika telah digunakan secara luas, baik dalam lingkup kesehatan manusia maupun kesehatan hewan. Masalah residu antibiotika dalam pangan asal hewan berkaitan dengan praktek yang kurang baik dalam penggunaan di lapangan. Penggunaan antibiotika di peternakan antara lain untuk pengobatan penyakit, pencegahan dan sebagai pemacu pertumbuhan (feed additive). Beta laktam adalah antibiotika yang sering digunakan pada hewan karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dengan cara merusak dinding sel bakteri serta dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi pakan dan pertumbuhan hewan ternak. Beta laktam sangat umum digunakan di peternakan sapi perah, terutama untuk pengobatan mastitis. Penggunaan antibiotika, termasuk beta laktam yang tidak memperhatikan waktu henti obat (withdrawal time) akan menimbulkan residu antibiotika pada produk hewan (Donkor et al. 2011). Produk susu olahan, temasuk susu pasteurisasi dapat beresiko mengandung residu antibiotika. Menurut hasil penelitian Sudarwanto et al. (1992) bahwa 32.52% susu pasteurisasi dan 31.10% susu segar di wilayah Jakarta, Bogor, dan Bandung mengandung residu antibiotika dalam jumlah yang cukup tinggi. Oleh karena itu perlu dilakukan pengujian adanya residu antibiotika untuk memperoleh susu pasteurisasi yang aman dikonsumsi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat residu beta laktam dalam susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta dan menyediakan data bagi Karantina Pertanian dalam upaya penetapan kebijakan terkait pentingnya pengujian residu beta laktam sebagai tindakan karantina di tempat pemasukan. Penelitian ini dilakukan terhadap 60 sampel susu pasteurisasi impor setelah dilakukan penghitungan dengan rumus deteksi penyakit menurut Canon dan Roe (1982) yang dikutip Martin et. al. (1987). Pengambilan sampel dilakukan secara bertahap dengan menggunakan random sampling sebanyak 12 kemasan/ kedatangan. Seluruh sampel diuji dengan menggunakan metode bioassay secara triplo. Sampel yang menunjukkan hasil positif pada bioassay dikonfirmasi dengan metode HPLC. Penyajian data pada kedua uji dilakukan secara diskriptif. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa susu pasteurisasi impor dari Australia yang melalui pelabuhan udara Soekarno-Hatta tidak mengandung residu antibiotika beta laktam. Hasil ini diperoleh melalui uji bioassay yang

8 memperlihatkan tidak ditemukannya zona terang disekitar cakram steril yang telah diteteskan sampel susu pasteurisasi. Pada grafik kromatogram HPLC, pada menit ke-5.94 tidak terdapat puncak yang sesuai dengan kromatogram pada kontrol. Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa susu pasteurisasi impor dari Australia yang melalui pelabuhan udara Soekarno Hatta tidak mengandung residu antibiotika beta laktam. Penelitian ini dapat dipergunakan sebagai bahan pertimbangan dalam melakukan tindakan karantina bagi petugas karantina dan Badan Karantina Pertanian untuk menetapkan aturan pemasukan produk susu. Selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap residu antibiotika dari golongan antibiotika selain beta laktam. Kata kunci : residu antibiotika, beta laktam, susu pasteurisasi, bioassay, HPLC

9 Hak cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

10

11 KAJIAN RESIDU BETA LAKTAM DALAM SUSU PASTEURISASI IMPOR DARI AUSTRALIA MELALUI PELABUHAN UDARA SOEKARNO-HATTA TRIFERA MELANINGRUM Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

12 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. drh. Trioso Purnawarman, M.Si.

13 Judul Tesis Nama NIM : Kajian Residu Beta Laktam dalam Susu Pasteurisasi Impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta : Trifera Melaningrum : B Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh. Hj. Mirnawati B Sudarwanto Ketua Dr. drh. Hadri Latif, M.Si. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr. drh. Denny Widaya Lukman, M.Si. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr. Tanggal Ujian : 07 Juni 2012 Tanggal Lulus : 23 Januari 2009

14

15 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Salawat dan salam kita sampaikan kepada Junjungan kita Nabi Besar Muhammad SAW yang membawa kita kedalam alam rahmah dan cahaya iman dan Islam. Amien. Penelitian ini berjudul Kajian Residu Beta Laktam dalam Susu Pasteurisasi Impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta yang dilaksanakan sejak bulan Januari sampai April Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Ir. Hari Priyono, M.Si. dan Ibu Ir. Banun Harpini M.Sc., yang memberikan dukungan moril dan kesempatan untuk melanjutkan pendidikan Pascasarjana. Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya juga penulis tujukan kepada Prof. Dr. drh. Hj. Mirnawati B Sudarwanto dan Dr. drh. Hadri Latif, M.Si., selaku dosen pembimbing yang dengan ketulusan dan kebesaran hati telah meluangkan waktu, tenaga dan pikirannya sebagai pembimbing, ibu/bapak, dan sekaligus sahabat dalam mendidik, mengarahkan dan memberikan masukan kepada penulis dari awal hingga selesainya tesis ini. Penghargaan dan terima kasih penulis tujukan pada Dr. drh. Denny W. Lukman, M.Si. selaku ketua program studi Kesehatan Masyarakat Veteriner dan segenap staf pengajar program studi Kesmavet FKH IPB atas bimbingan dan ilmu yang diberikan selama kami menyelesaikan pendidikan di program studi Kesehatan Masyarakat Veteriner Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Eti Riyani yang bertindak sebagai moderator pada seminar hasil penelitian dan Dr. drh. Trioso Purnawarman, MSi. yang bertindak sebagai penguji luar komisi pada ujian tesis. Ucapan yang sama penulis tujukan pada bapak Agus Haryanto, SE. yang telah membantu kelancaran selama studi, bapak Yuhendra dan bapak Rahmat yang telah membantu dalam pengujian sampel penelitian. Demikian juga atas dukungan fasilitas, kemudahan, dan sarana yang telah diberikan maka tak lupa saya juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Antarjo Dikin, M.Sc. beserta staf di Laboratorium Balai Besar Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian Bekasi yang telah membantu dalam pengujian sampel, Dr. Ir. Musyaffak Fauzi, SH, M.Si. dan segenap staf Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno Hatta yang telah membantu selama pengumpulan sampel, drh. Agus Sunanto, MP. beserta staf Laboratorium di Balai Besar Karantina Tanjung Priok atas ijin dan dukungannya kepada penulis selama masa perkuliahan, serta drh. Adi Mardin dan segenap rekan kerja di Stasiun Karantina Pertanian Kelas I Cilacap atas dukungannya kepada penulis selama masa perkuliahan. Selain itu, ucapan terima kasih juga disampaikan pada drh. Uti Ratnasari Herdiana, M.Si., drh. Arum kusnila Dewi, M.Si., drh. Anjar Maryati, drh. Nuryani Triwijayanti, Riska Desitania S.Si., Dr. R. Widyastuti, Yuningsih dan Yessi Anastasia, A.Md. yang membantu proses penelitian. Penulis juga menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada rekanrekan teman sejawat Kelas Khusus Karantina Hewan (Gatot, Ary, Ijjah, Ali, Donni, Hari, Platika, Helmi, AJ, Endah, Wulan, Fitri, Ama, dan Endang), tidak lupa terima kasih kepada rekan-rekan S2 KMV regular dan tentunya masih

16 banyak lagi rekan-rekan yang telah turut membantu tapi tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Ungkapan syukur dan hormat juga penulis sampaikan kepada Papa dan Mama di Pati, Bapak (alm) dan Ibu Mertua di Kebumen, kakakku Wati, adikku Anis, serta keluarga besar eyang Soebakri atas semua dukungan selama menyelesaikan kuliah ini. Ucapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada suamiku tercinta Amir atas dukungan, perhatian, kesabaran, cinta dan kasih sayangnya, juga kepada kedua buah hatiku Fahrun Imana dan Faros Abdillah, kalian bertiga adalah penyemangat hidupku. Atas segala kebaikan yang telah penulis terima, semoga Tuhan Yang Maha Esa melimpahkan rahmat dan karunia-nya kepada kita semua. Harapan penulis semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi Badan Karantina serta masyarakat veteriner Indonesia. Bogor, Juni i2012 Trifera Melaningrum

17 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pati Jawa Tengah pada tanggal 30 Mei 1974 sebagai anak ke-2 dari 3 (tiga) bersaudara dari ayah Sungkowo dan ibu Isniyati. Bersama kedua saudara dididik dan dibesarkan dengan penuh kehangatan dan kasih sayang. Penulis menempuh pendidikan Taman Kanak Kanak di Pertiwi Pati tahun 1980, Sekolah Dasar Negeri diselesaikan tahun 1986 di SD Pati Kidul I Pati, Sekolah Menengah Pertama Negeri 2 Pati tahun 1989, Sekolah Menengah Atas Negeri 2 Pati tahun 1992, Lulus Sarjana Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada tahun 1998 dan menjadi Dokter Hewan pada bulan Agustus 1999 di Universitas yang sama. Pada tahun 2010 mendapat kesempatan untuk melanjutkan studi S2 (Magister) di program studi Kesehatan Masyarakat Veteriner Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor dengan dukungan biaya perkuliahan dari DIPA Badan Karantina Pertanian, Kementrian Pertanian. Setelah lulus dokter hewan, penulis diterima sebagai Pegawai Negeri Sipil di Stasiun Karantina Hewan Semarang dari tahun 2000 sampai dengan Pada pertengahan tahun 2008 dipindah ke Stasiun Karantina Hewan Kelas I Cilacap hingga saat ini. Penulis menikah dengan Amir, SP, M.Sc. pada tanggal 29 Juni 2003 dan telah dikaruniai dua orang anak laki-laki bernama Fahrun Imana dan Faros Abdillah.

18

19 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... xix xxi PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan... 2 Manfaat... 2 Hipotesis... 2 TINJAUAN PUSTAKA Susu Pasteurisasi... 3 Antibiotika... 6 Penggunaan Antibiotika di Peternakan... 9 Residu Antibiotika dalam Susu Dampak Residu Antibiotika Metode Pengujian Residu Antibiotika BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan Rancangan Penelitian Metode Penelitian Pengumpulan Sampel Uji Pendahuluan Bioassay Uji Konfirmasi (HPLC) Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Pendahuluan Bioassay Metode Konfirmasi (HPLC) Gambaran Residu Beta laktam dalam Susu Pasteurisasi SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA xvii

20

21 DAFTAR TABEL Halaman 1. Suhu dan waktu pada proses pasteurisasi Perbandingan komposisi susu segar dan pasteurisasi Syarat mutu susu segar Spektrum aktifitas antibiotika Aktifitas beberapa antibiotika Waktu henti obat beberapa jenis antibiotika Batas maksimum residu antibiotika dalam susu Hasil pemeriksaan dengan metode bioassay xix

22

23 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Struktur kimia penisilin (ampisilin dan amoksilin) dan cephalosporin (cephadroxil) Uji peroksidase Uji kekeruhan Uji bioassay Kromatogram HPLC xxi

24

25 PENDAHULUAN Latar Belakang Susu merupakan bahan pangan asal hewan yang mempunyai nilai gizi baik dan seimbang. Susu berkualitas baik haruslah aman, dan layak dikonsumsi. Keberadaan residu antibiotika dalam susu menjadikan susu tidak aman dikonsumsi karena dapat menimbulkan gangguan kesehatan. Antibiotika telah digunakan secara luas, baik dalam lingkup kesehatan manusia maupun kesehatan hewan. Masalah residu antibiotika dalam pangan asal hewan berkaitan dengan penggunaan antibiotika yang tidak benar di lapangan. Penggunaan antibiotika di peternakan antara lain untuk pengobatan, pencegahan penyakit, dan sebagai pemacu pertumbuhan (growth promotor dalam pakan). Beta laktam adalah antibiotika yang sering digunakan pada hewan karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dengan cara merusak dinding sel bakteri dan dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi pakan serta pertumbuhan hewan ternak. Beta laktam sangat umum digunakan di peternakan sapi perah, terutama untuk pengobatan mastitis. Penggunaan antibiotika, termasuk beta laktam yang tidak memperhatikan waktu henti obat (withdrawal time) akan menyebabkan residu antibiotika pada produk hewan (Donkor et al. 2011). Produk susu olahan, temasuk susu pasteurisasi mempunyai resiko mengandung residu antibiotika. Resiko tersebut karena suhu pemanasan yang digunakan dalam proses pengolahan tidak/ belum cukup untuk mengurangi residu antibiotika dalam susu. Menurut hasil penelitian Sudarwanto et al. (1992) bahwa 32.52% susu pasteurisasi dan 31.10% susu segar di wilayah Jakarta, Bogor, dan Bandung mengandung residu antibiotika dalam jumlah yang cukup tinggi, oleh karena itu perlu dilakukan pengujian adanya residu antibiotika dalam susu pasteurisasi agar aman dikonsumsi. Karantina Pertanian merupakan satu diantara lembaga pemerintah yang mempunyai tugas untuk menjamin keamanan pangan produk hewan impor. Belum tersedianya data tentang keberadaan residu antibiotika dalam susu pasteurisasi

26 2 impor dari Australia menjadikan pengujian residu beta laktam perlu menjadi prioritas untuk tindakan karantina terhadap produk olahan susu tersebut. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan data keberadaan residu beta laktam dalam susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Manfaat Penelitian Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah tersedianya data keberadaan residu beta laktam pada susu pasteurisasi impor dari Australia yang dapat dijadikan informasi ilmiah yang berguna bagi institusi terkait (Badan Karantina Pertanian) dalam upaya penetapan kebijakan terkait pentingnya pengujian residu beta laktam sebagai bagian tindakan karantina di tempat pemasukan. Hipotesis Penelitian Dalam penelitian ini disusun hipotesis sebagai berikut: H 0 = Susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta mengandung residu antibiotika beta laktam. H 1 = Susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta tidak mengandung residu antibiotika beta laktam.

27 TINJAUAN PUSTAKA Susu Pasteurisasi Susu pasteurisasi merupakan minuman bergizi tinggi, khususnya karena mengandung protein tinggi serta mempunyai aroma yang spesifik susu. Aroma dan cita rasa susu sangat dipengaruhi oleh kadar laktosa susu (Syarief dan Halid 1997). Susu merupakan hasil utama pada usaha budidaya ternak perah. Hidayat (2010) menyatakan, susu yang dihasilkan harus memenuhi syarat aman, sehat, utuh, dan halal (ASUH). Untuk mendapatkan susu yang ASUH dibutuhkan penanganan susu yang khusus karena zat gizi yang terkandung dalam susu mendukung pertumbuhan mikroorganisme patogen dan apatogen. Akibat tercemarnya oleh mikroorganisme, maka susu mudah rusak dan menjadi sumber terjadinya foodborne disease. Foodborne disease adalah penyakit yang disebabkan karena mengkonsumsi makanan atau minuman yang tercemar oleh mikroorganisme atau bahan kimia termasuk antibiotika (Gustiani 2009). Susu pasteurisasi adalah susu yang telah mengalami proses pemanasan sehingga mempunyai daya simpan lebih lama dibanding susu mentah disertai musnahnya mikroorganisme patogen yang dapat mengganggu kesehatan konsumen. Proses pasteurisasi berdasarkan rekomendasi Public Health Services (PHS) Amerika Serikat tahun 1978 adalah proses pemanasan pada suhu dan waktu tertentu seperti terlihat pada Tabel 1. Menurut Food and Drug Assosiation (FDA 2011) susu pasteurisasi sesuai ketentuan Pasteurization Marketing Ordinance (PMO) adalah pemanasan susu dengan menggunakan suhu rendah-waktu lama (LTLT) yaitu pada suhu 63 C (145 F) selama 30 menit atau dengan menggunakan suhu tinggi-waktu singkat (HTST) yaitu pada suhu 72 C (161 F) selama 15 detik. Pasteurisasi merupakan salah satu cara pengolahan susu dengan cara pemanasan untuk mempertahankan mutu dan keamanan susu. Suhu pemanasan yang tidak terlalu tinggi menyebabkan produk tetap mempunyai komposisi dan keadaan yang hampir sama dengan susu segar namun daya tahannya lebih panjang (Silva dan Bibbs 2010).

28 4 Tabel 1 Suhu dan waktu pada proses pasteurisasi (Hubbert dan Hagstad 1991) Suhu C F Waktu (detik) long time holding Istilah umum high temperature short time (HTST) ultra high temperatur (UHT) Tujuan pasteurisasi selain untuk membunuh bakteri patogen dan non patogen (Hobbs dan Robert 1987; Fardiaz 1989; Gaman dan Sherrington 1992), juga untuk memperpanjang daya simpan susu. Kay (1962) menyatakan bahwa penggunaan panas pada pasteurisasi tidak begitu menimbulkan perubahan pada komposisi dan rasa susu sehingga masih seperti susu segar. Perbandingan komposisi antara susu segar dan susu pasteurisasi dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Perbandingan komposisi susu segar dan susu pasteurisasi (Muchtadi dan Sugiyono 1992) Komposisi Susu segar (%) Susu pasteurisasi (%) Air Protein Lemak Laktosa Mineral Proses pasteurisasi yang diikuti langsung dengan pendinginan, daya simpan produk akan lebih lama dengan mutu yang lebih baik (Frazier dan Westhoff 1988). Misalnya pada pemanasan 72 C selama 15 detik dengan suhu penyimpanan 1 sampai 2 C, daya simpannya dapat mencapai 3 minggu, sedangkan pada suhu penyimpanan 4 sampai 7 C daya simpan susu pasteurisasi hanya 1 sampai 2 minggu. Menurut Badan Standarisasi Nasional (BSN) pada SNI tahun 1995 nomor , proses pasteurisasi yang digunakan adalah minimum

29 5 pemanasan pada temperatur 63 o C 66 o C selama 30 menit atau pada pemanasan 72 o C minimum selama 15 detik, kemudian segera didinginkan sampai 10 o C, selanjutnya diperlakukan secara aseptis dan disimpan pada suhu maksimum 4 o C. Tabel 3 memperlihatkan persyaratan susu segar berdasarkan Standar Nasional Indonesia (SNI) nomor :2011. Tabel 3 Syarat mutu susu segar berdasarkan SNI :2011 No. Karakteristik Syarat Berat jenis (pada suhu 27.5 C) minimum Kadar lemak minimum Kadar bahan kering tanpa lemak minimum Kadar protein minimum Warna, bau, rasa dan kekentalan Derajat asam Uji alkohol (70%) Potensial hydrogen (ph) Cemaran mikroba maksimum: - Total kuman - Salmonella - E. coli (patogen) - Koliform Jumlah sel somatis maksimum Cemaran logam berbahaya, maksimum: - Timbal (Pb) - Merkuri (Hg) - Arsen (As) Residu antibiotika (golongan laktam, tetrasiklin, aminoglikosida, makrolida) Uji pemalsuan Titik beku Uji peroksidase % 7.8% 2.8% tidak ada perubahan SH negatif x 10 6 CFU/mL negatif negatif 1 x 10 3 CFU/mL 4 x 10 5 sel/ml 0.02 ppm 0.03 ppm 0.1 ppm negatif negatif C s/d C positif Cemaran mikroorganisme berbahaya dalam produk hewan asal ternak dapat ditularkan ke manusia. Cemaran atau residu kimia seperti residu obat (antibiotika dan hormon), residu pestisida, dan mikotoksin perlu juga diwaspadai.

30 6 Keberadaan residu antibiotika dalam produk hewan perlu mendapat perhatian karena dapat menyebabkan terjadinya resistensi antibiotika (Bahri et al. 2002). Antibiotika Antibiotika merupakan suatu bahan atau zat yang diproduksi oleh bakteri atau cendawan tertentu yang dapat digunakan untuk pengobatan terhadap infeksi mikroorganisme terutama yang disebabkan oleh bakteri. Senyawa ini mampu menghentikan proses pertumbuhan dari bakteri bahkan dapat membunuh bakteri yang secara umum dikenal sebagai efek bakteriostatik dan bakterisidal (Bezoen et al. 2000). Menurut Giguere (2006) antibiotika merupakan hasil intermediet atau hasil akhir dari metabolisme mikroba. Antibiotika dapat diklasifikasikan atas beberapa kategori. Secara umum dapat dibagi berdasarkan empat kategori yaitu berdasarkan target mikroorganisme, aktifitas bakteri, kemampuan bakterisidal atau bakteriostatik, serta waktu dan konsentrasi obat. 1) Target mikroorganisme Antibiotika digambarkan sebagai spektrum sempit jika hanya menghambat bakteri saja atau dikatakan berspektrum luas jika dapat menghambat mikoplasma, riketsia dan klamidia. Spektrum aktifitas terhadap target mikroorganisme dijelaskan pada Tabel 4. Antibiotika Aminoglikosida Beta laktam Kloramfenicol Fluoroquinolon Linkosamid Makrolida Oksazolidion Pleuromutilin Tetrasiklin Streptogramin Sulfonamid Trimetoprim Tabel 4 Spektrum aktifitas antibiotika (Giguere 2006) Kelas Mikroorganisme Bakteri Cendawan Mikoplasma Riketsia Klamidia Protozoa / / / / /- : melawan beberapa protozoa

31 7 2) Aktifitas antibakteri Beberapa antibiotika dapat menghambat bakteri Gram negatif atau Gram positif saja sehingga disebut memiliki aktifitas yang sempit, sedangkan antibiotika dengan aktifitas spektrum luas memiliki kemampuan menghambat atau bekerja pada bakteri Gram negatif dan positif. Definisi ini tidak sepenuhnya mutlak karena beberapa jenis antibiotika dapat bekerja terhadap kedua kelompok bakteri baik Gram positif maupun Gram negatif tetapi hanya menghambat beberapa jenis bakteri dari keduanya. Aktifitas beberapa jenis antibiotika terhadap kelompok dijelaskan dalam Tabel 5. Tabel 5 Aktifitas beberapa antibiotika (Giguere 2006) Spektrum Bakteri aerob Bakteri anaerob Gram + Gram - Gram + Gram - Sangat luas Cukup luas (+) Sempit /- (+) (+) (+) (+) +/- - +/- + + (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) + aktifitas sangat baik (+) aktifitas cukup +/- aktifitas terbatas - tidak ada aktifitas atau diabaikan Contoh karbapenem, kloramfenikol, generasi ke 3 fluoroquinolon, glisilsilin generasi ke 3 dan ke 4 sefalosporin generasi ke 2 sefalosporin Tetrasiklin ampisilin, amoksisilin, generasi 1 sephalosporin ampisilin, linkosamid, glikopeptida, streptogramin, oksazolidion makrolida monobaktam, aminoglikosida generasi 2 fluoroquinolon trimetroprim sulfa nitromidazol rifamisin 3) Kemampuan bakterisidal dan bakteriostatik Beberapa jenis antibiotika menghambat pertumbuhan bakteri pada suatu konsentrasi, atau disebut konsentrasi penghambatan minimun minimum inhibitory concentration (MIC), namun membutuhkan konsentrasi yang lebih tinggi untuk membunuh atau konsentrasi pembunuh minimum minimum bactericidal concentration (MBC). Pengelompokan antibiotika berdasarkan kemampuannya menghambat atau membunuh bakteri dibagi menjadi dua yaitu

32 8 bakteriostatik dan bakteriosidal. Bakteriostatik adalah antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri (kloramfenikol, tetrasiklin), sedangkan bakteriostatik adalah antibiotika yang dapat membunuh bakteri (beta laktam, aminoglikosida), hal ini tidak berlaku mutlak karena tergantung juga pada konsentrasi obat dan jenis mikroba target. Salah satu contohnya adalah bennzyl penicillin dari kelompok bakterisidal namun pada konsentrasi rendah bekerja sebagai bakteriostatik. 4) Waktu dan konsentrasi obat Antibiotika sering diklasifikasikan berdasarkan waktu aktifitas dan konsentrasi obat yang tergantung pada farmakodinamika. Farmakodinamika obat menggambarkan efek obat terhadap mikroorganisme. Farmakokinetika obat menggambarkan konsentrasi obat dalam serum setelah proses absorbsi, distribusi, metabolisme, dan eliminasi. Ketika digabungkan dengan nilai MIC dapat diprediksi kemungkinan pemusnahan bakteri dan keberhasilan pengobatan. Beberapa jenis antibiotika mampu meningkatkan efek bakterisidal jika dilakukan penambahan konsentrasi. Beberapa jenis antibiotika juga membutuhkan waktu cukup lama dan konsentrasi tinggi untuk dapat bekerja efektif seperti fluoroquinolon dan aminoglikosida. Antibiotika betalaktam Gambar 1 Struktur kimia penisilin (ampisilin dan amoksisilin) dan sefalosporin (sefadroxil).

33 9 Beta laktam adalah antibiotika tertua dan banyak digunakan di masyarakat (Ghinidi et al. 2002). Antibiotika beta laktam seperti penisilin dan sefalosporin banyak digunakan di lapangan (Shammipur et al. 2002), seperti pengobatan mastitis (Riediker et al. 2004). Gambar 1 memperlihatkan cincin beta laktam dari penisilin dan sefalosporin (Fagerquist dan Lightfield 2003). Penisillin merupakan antibiotika yang efektif untuk bakteri Gram positif. Senyawa ini sering digunakan sebagai obat pilihan utama untuk semua jenis infeksi karena tidak menimbulkan efek samping yang toksik dan bersifat bakterisidal (Olsom 2003). Menurut Gustavsson et al. (2002) walaupun terdapat banyak jenis antibiotika dan kemoterapi yang digunakan untuk pengobatan infeksi pada sapi perah, namun masalah utama industri susu adalah penisilin. Penisilin tidak beracun tetapi untuk individu yang sensitif dapat menyebabkan alergi (Grunwald dan Petz 2003). Menurut Admin (2007), absorbsi penisilin bisa melalui peroral, intramuskular, intravena, intratrakheal, intrauteri dan intramammari. Pada keadaan normal penisilin didistribusikan dengan cepat dari plasma darah ke dalam jaringan tubuh. Pengukuran presentasi volume distribusi (apparent volume distribution/ AVD) sebesar 50% memperlihatkan cepat dan mudahnya distribusi penisilin ke dalam jaringan. Melalui ginjal, penisilin diekskresikan dengan cepat yaitu mencapai 60-80% dari obat yang dikonsumsi, sedangkan ekskresi melalui kelenjar susu 16% dari yang ada di dalam plasma, hal ini menunjukkan bahwa penisilin lebih banyak dieliminasi tubuh melalui ginjal daripada melalui susu. Penggunaaan Antibiotika di Peternakan Secara umum, diperkirakan 50% dari seluruh antibiotika digunakan untuk keperluan di bidang kedokteran hewan (Teuber 2001). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan antibiotika dalam dunia peternakan berkisar antara 80% pada perunggasan, 75% pada peternakan babi, 60% pada peternakan sapi potong, dan 75% antibiotika digunakan pada peternakan sapi perah (Crawford dan Franco 1996). Aplikasi antibiotika pada sapi perah dapat dilakukan melalui berbagai rute yang berbeda yaitu mulut (peroral), intravena, intramuskular, subkutaneus, intrauteri, dan intramamamari. Semua aplikasi

34 10 tersebut dapat memicu terjadinya residu antibiotika dalam susu (Mitchell et al. 1998). Sampai sekarang masih terdapat dilema, di satu sisi penggunaan antibiotika sangat perlu akan tetapi di sisi lain berakibat buruk bagi kesehatan masyarakat (Crawford dan Franco 1996). Antibiotika sebagai obat yang paling banyak digunakan dalam peternakan, secara umum diketahui mempunyai dua target tujuan dalam penggunaannya yaitu sebagai agen terapeutik dan sebagai agen subterapeutik. Penggunaan antibiotika sebagai agen terapeutik berfungsi untuk melakukan terapi terhadap kejadian penyakit sedangkan penggunaan sebagai subterapeutik bertujuan untuk meningkatkan produksi ternak dengan cara meningkatkan efisiensi makanan untuk pertumbuhan dan melakukan modifikasi terhadap komposisi nutrisi dari produk yang dihasilkan oleh ternak tersebut (CDUFA 1999). Penggunaan antibiotika pada sapi laktasi akan menghasilkan residu di dalam susu (NRA 2000). Antibiotika secara komersial banyak digunakan dalam industri peternakan sebagai zat yang ditambahkan pada pakan hewan yang bertindak sebagai agents growth promotors (AGPs) dan juga sebagai suatu zat yang digunakan untuk kontrol dan pencegahan terjadinya penyakit. Cara kerja dari AGPs ini belum diketahui secara pasti, akan tetapi secara umum diketahui bahwa antibiotika yang berfungsi sebagai AGPs akan mengurangi keberadaan organisme patogen dan mengurangi jumlah mikroorganisme yang bersaing dengan inang dalam mendapatkan nutrisi. Fungsi lain antibiotika sebagai AGPs ialah merangsang atau menghambat secara selektif pertumbuhan dari mikroorganisme yang banyak menggunakan nutrisi inang untuk pertumbuhannya, namun menurut Bambeke et al. (2000) penggunaan antibiotika sebagai bahan tambahan pakan atau pangan akan menghasilkan masalah yang sulit dikendalikan. Penggunaan antibiotika secara rasional seharusnya didasarkan atas pengetahuan tentang struktur dan biokimia dari bakteri serta farmakodinamika dan farmakokinetika dari obat-obatan tersebut. Suatu obat yang kurang efektif apabila dipenetrasikan dengan baik dibandingkan dengan obat yang efektif tapi dengan penetrasi yang kurang baik maka keduanya akan sama-sama gagal dalam upaya pengobatan penyakit dan kemungkinan akan memicu perkembangan strain-strain yang resisten terhadap obat tersebut (Abadi dan Less 2000).

35 11 Residu Antibiotika dalam Susu Residu antibiotika adalah senyawa asal dan/atau metabolitnya yang terdapat dalam jaringan produk hewani dan termasuk residu hasil uraian lainnya dari antibiotika tersebut. Residu dalam bahan pangan meliputi senyawa asal yang tidak berubah, metabolit dan/atau konjugat lain. Beberapa metabolit obat diketahui bersifat kurang atau tidak toksik dibandingkan dengan senyawa asalnya, namun beberapa metabolit bersifat lebih toksik (Lukman 2010). Menurut Rahayu (2010), senyawa yang masuk ke dalam tubuh, akan mengalami berbagai proses yang terdiri dari penyerapan (absorbsi), distribusi, metabolisme, dan eliminasi. Kecepatan proses biologis tersebut tergantung pada jenis, bentuk, cara masuk, dan metabolisme dari senyawa tersebut. Penyerapan terjadi di dalam saluran pencernaan yang sebagian besar dilakukan oleh usus, apabila bahan tersebut masuk melalui mulut. Senyawa asli maupun hasil metabolismenya akan dibawa oleh darah dan akan didistribusikan ke seluruh bagian tubuh setelah terjadi penyerapan. Metabolisme akan terjadi di dalam organ-organ tubuh, kemudian dieliminasi oleh alat-alat ekskresi, terutama ginjal dalam bentuk urin dan usus dalam bentuk feses. Senyawa-senyawa dalam bentuk murni maupun metabolitnya akan tertinggal atau tertahan di dalam jaringan untuk waktu tertentu tergantung pada waktu henti senyawa tersebut atau metabolitnya. Kecepatan eliminasi obat pada ternak yang sehat akan jauh lebih cepat daripada pada ternak yang sakit. Saat keadaan tubuh lemah atau terdapat gangguan metabolisme, maka proses eliminasi obat akan terganggu. Timbunan senyawa atau metabolitnya di dalam tubuh akan terjadi apabila senyawa-senyawa tersebut diberikan dalam waktu yang lama (Rahayu 2010). Bishop (2005) menyatakan bahwa penggunaan obat-obatan dalam menangani berbagai permasalahan kesehatan di peternakan dapat menyebabkan terjadinya residu dalam susu dan mempengaruhi kualitas susu tersebut. Kehadiran substansi antimikrobial dalam susu seperti residu antibiotika dapat mengakibatkan masalah kesehatan yang serius. Hadirnya residu antibiotika dalam susu dapat diakibatkan tidak diperhatikannya waktu henti obat (withdrawal time) dari

36 12 antibiotika tersebut. Waktu henti obat beberapa antibiotika disajikan dalam Tabel 6. Tabel 6 Waktu henti obat beberapa jenis antibiotika (Bishop 2005) Jenis antibiotika Withdrawal time (jam) Penisilin G Eritromisin Tetrasiklin Streptomisin Dampak Residu Antibiotika Residu antibiotika yang terdapat pada produk pangan asal hewan dapat menyebabkan masalah kesehatan dalam tubuh manusia antara lain dapat menimbulkan reaksi baik yang bersifat akut atau kronis (CDUFA 1999). Residu antibiotika dalam pangan dapat menimbulkan dampak terhadap kesehatan masyarakat bila dikonsumsi dalam waktu yang lama. Dampak tersebut dapat berupa toksikologis (residu antibiotika bersifat racun terhadap hati, ginjal dan pusat pembentukan darah), mikrobiologis (residu antibiotika akan mengganggu keseimbangan mikroflora didalam saluran pencernaan sehingga dapat mengganggu metabolisme tubuh), imunopatologis (yaitu residu antibiotika dapat menjadi faktor pemicu timbulnya reaksi alergi dari yang bersifat ringan sampai dengan berat dan bersifat fatal), dan menimbulkan gangguan pada sistem syaraf serta kerusakan jaringan (Donkor et al. 2011). Batas maksimum residu antibiotika dalam susu menurut SNI (BSN 2000) disajikan dalam Tabel 7. Tabel 7 Batas maksimum residu antibiotika dalam susu (SNI ) Jenis antibiotika Batas maksimum residu Penisilin G Eritromisin Tetrasiklin Streptomisin 0.10 IU/kg 0.05 mg/kg 0.10 mg/kg 0.10 mg/kg

37 13 Metode Pengujian Residu Antibiotika Metode pengujian residu antibiotika dapat berupa uji cepat (rapid test kit), uji tapis/ screening test (bioassay dan ELISA) dan uji konfirmasi (HPLC). Begitu banyak jenis uji yang ada, namun tidak ada satupun uji yang menjamin hasilnya paling baik (Wehr dan Frank 2004). Uji cepat merupakan metode pengujian residu antibiotika yang tidak memakan waktu banyak dan mudah penggunaannya. Uji tapis pada umumnya merupakan uji kualitatif dan semi kuantitatif yang berfungsi untuk mengidentifikasi adanya residu antibiotika dengan cepat, mudah digunakan, dan relatif tidak mahal. Bioassay merupakan pengujian yang menggunakan mikroorganisme untuk mendeteksi senyawa antibiotika yang masih aktif (BSN 2008). Menurut Eenennaam et al. (1993), spesifisitas bioassay ditunjukkan dari tipe golongan antibiotika yang dapat dideteksi dengan melihat hambatan pertumbuhan bakteri. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan uji tapis yang memiliki sensitifitas tinggi, sederhana, dan mampu menguji banyak sampel hanya dengan volume sampel yang sedikit (Wang et al. 2009). High performance liquid chromatography (HPLC) adalah metode yang sangat membantu dalam konfirmasi keberadaan residu antibiotika dalam pangan asal hewan. Metode HPLC didasarkan pada reserved-phase chromatography dan multisignal UV-visiblediode array detection (UV-VAD). Spektrum UV berperan sebagai alat identifikasi tambahan (Husgen dan Schuster 2001). Metode HPLC mampu mengkonfirmasi kehadiran dan mengidentifikasi jenis antibiotika dalam susu.

38 14

39 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian diawali dengan pengambilan sampel susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Pengujian dilakukan di Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian (BUTTMKP), Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan (BPMPP), dan Balai Besar Penelitian Veteriner (BBalitvet). Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April Alat dan Bahan Pengujian Pendahuluan Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, H 2 O 2 0.5%, HCl paraphenilin diamine 2%, amonium sulfat jenuh (NH 4 ) 2 SO 4. Peralatan yang diperlukan adalah tabung reaksi, rak tabung reaksi, timbangan, tabung erlenmeyer. Pengujian Bioassay Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, mikroorganisme (Spora Bacillus stearothermophilus ATCC 7953), peptone (Difco ), yeast extract (Difco ), bacto agar (Difco ), dextrose (Difco ), natrium penisilin (Sigma P-7794), K 2 HPO 4 (Merck ), Na 2 HPO 4 (Merck ), aquadest, kertas cakram steril (diameter 8 mm). Peralatan yang diperlukan adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung sentrifus, labu ukur, gelas ukur, erlenmeyer, pipet volumetrik, pengocok tabung, magnet pengaduk, ph meter, mikro pipet, jangka sorong, ose, dan pinset. Pengujian HPLC Bahan yang digunakan adalah susu pasteurisasi impor, aquades, asetonitril, metanol, bufer fosfat (ph = 8.5), 0.05 mol/l: 8.7 g kalium fosfat dilarutkan dalam 1000 ml aquades, larutan antibiotika standar (penisilin 1 mg/ml) dalam metanol, H 2 SO M, Sodium Tungstad 5%, NaCl, bufer fosfat 0.2 M. Peralatan yang digunakan adalah sentrifus dingin, evaporator, HPLC

40 16 colum agilent ZORBAX Eclips Plus, 2.1 mm x 100 mm, 3.5 μm (p/n ), dan HPLC dengan diode array detector (Agilent Technologies, Inc, USA). Rancangan Penelitian Sampel yang diuji adalah susu pasteurisasi impor dari Australia melalui Pelabuhan Udara Soekarno-Hatta. Jumlah sampel yang diambil, dihitung dengan menggunakan rumus deteksi penyakit (detect disease) (Martin et al. 1987). n = [1- (1-a) 1/D ] [N-(D-1)/2] Keterangan : N = Jumlah populasi n = Ukuran sampel a = Tingkat kepercayaan (95%) D = Nilai dugaan populasi yang sakit (D=PxN, dengan asumsi P:5%) Seluruh sampel diuji dengan menggunakan metode bioassay secara triplo. Sampel yang menunjukkan hasil positif pada bioassay, dikonfirmasi dengan metode HPLC. Metode Penelitian Pengumpulan Sampel Pengambilan sampel untuk penelitian ini dilakukan dengan cara mengambil susu pasteurisasi secara acak sederhana. Susu pasteurisasi impor setiap kedatangan diambil sebanyak 12 sampel, hingga jumlah sampel terpenuhi. Sebelum diuji, sampel disimpan dalam lemari pendingin suhu -20 C. Uji Pendahuluan Uji Storch merupakan uji kesempurnaan proses pasteurisasi. Reaksi positif menunjukkan susu yang sudah mengalami pemanasan. Reaksi ini terjadi setelah kedalam 5 ml sampel susu ditambahan 4 tetes H 2 O 2 0.5% dan 2 tetes HCl paraphenilin diamine 2%. Reaksi positif memperlihatkan warna putih (susu pasteurisasi), sedangkan reaksi negatif memperlihatkan warna biru (susu mentah atau mengandung 5% susu mentah).

41 17 Uji Aschaffenburg atau uji kekeruhan dilakukan untuk mengetahui apakah susu telah mengalami proses pemanasan yang melebihi suhu pasteurisasi. Pada 20 ml sampel susu pasteurisasi ditambahkan 4 g amonium sulfat jenuh (NH 4 ) 2 SO 4 dan dikocok. Kemudian campuran tersebut disaring ke dalam tabung reaksi dan filtratnya dimasukkan dalam penangas air (mendidih) selama 5 menit. Filtrat yang jernih menyatakan tidak ada albumin dalam susu dan susu tersebut telah dipanaskan diatas titik didih susu (> C). Uji Bioasay Uji tapis untuk mendeteksi residu beta laktam dalam susu dilakukan dengan menggunakan metode bioassay. Uji ini untuk mendeteksi adanya residu antibiotika dengan cepat, mudah digunakan, dan relatif tidak mahal. Secara umum, tahapan pengujiannya terdiri dari persiapan, pengujian, dan pembacaan hasil. Persiapan, meliputi persiapan media agar, kultur media, larutan dapar, dan larutan baku. Persiapan media agar, sebanyak 5 g peptone, 12 g yeast extract, g bacto agar, 1 g dextrose, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, kemudian diukur pada ph 5.7±0.1 dan dididihkan. Media disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 psi (pound per square inchi) selama 15 menit. Persiapan kultur media. Bakteri Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55 C selama 1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl fisiologis steril 20 ml. Larutan kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan (lapisan atas) dibuang. Kemudian ditambahkan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4 C selama jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 C selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai suspensi spora.

42 18 Pembuatan larutan dapar fosfat. Sebanyak 7 g K 2 HPO 4, 6 g Na 2 HPO 4, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, kemudian larutan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Larutan baku untuk kontrol antibiotika. Standar penicillin ditimbang kemudian diencerkan dengan larutan dapar dari konsentrasi IU/mL hingga 0.01 IU/mL. Larutan dengan konsentrasi 0.01 IU/mL digunakan sebagai larutan standar kerja. Pengujian dengan bioassay. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan dalam tabung reaksi. Sementara itu, kultur media disiapkan dengan menuangkan 8 ml pada setiap cawan petri. Selanjutnya kertas cakram steril diletakkan di atas permukaan kultur media. Tiap cawan petri berisi 5 buah kertas cakram, yang terdiri dari 3 buah cakram yang masing-masing ditetesi 75 μl sampel yang akan dianalisa, satu kertas ditetesi 75 μl larutan baku antibiotika 0.01 IU/mL sebagai kontrol positif, dan satu kertas lagi ditetesi larutan dapar fosfat sebagai kontrol negatif. Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada suhu 55 C selama jam. Pengujian sampel dilakukan dengan tiga kali pengulangan untuk mendapatkan data yang akurat. Pembacaan hasil dilakukan dengan mengamati dan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk disekeliling kertas cakram menggunakan jangka sorong. Sampel dinyatakan positif mengandung antibiotika apabila zona hambat yang terbentuk 2 mm dari tepi kertas cakram. Sampel dinyatakan negatif apabila zona hambat yang terbentuk 0 2 mm. Karena zona hambat yang terbentuk < 2 mm dianggap akibat adanya natural inhibitor. Diameter zona hambatan pada kontrol positif sebesar 20 ± 1 mm, sedangkan kontrol negatif tidak membentuk zona hambat (SNI 2008). Uji Konfirmasi (HPLC) Uji konfirmasi untuk mendeteksi residu beta laktam dalam susu pasteurisasi dilakukan dengan menggunakan HPLC. Metode ini didasarkan pada reservedphase chromatography dan multisignal UV-visiblediode-aray detection (UV- DAD). Spektrum UV berperan sebagai alat identifikasi tambahan (Husgen dan Schuster 2001). Alat HPLC diatur pada kolom 15 cm x 3.9 mm, kecepatan aliran

43 ml/menit, fase gerak (A: aquades/10 mm amonium asetat dan B: asetonitril), run time 12 menit, jeda 3 menit, suhu 180 C, injeksi 50 μl. Tahap persiapan: 5 ml susu dimasukkan dalam tabung sentrifus yang mempunyai tutup, ditambahkan 25 ml aquadest dan 4 ml H 2 SO M serta 4 ml Sodium Tungstad 5%, dihomogenkan selama 2 menit kemudian disentrifus dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Larutan supernatant dipisahkan dari residunya kemudian ditambahkan 10 ml NaCl 20% pada filtratnya. Tahap pemurnian, yaitu ke dalam kartrid C18 dialirkan perlahan-lahan 10 ml metanol, 10 ml aquades, 10 ml NaCl 2%. Kemudian dialirkan sampel. Bilas kartrid C18 dengan mengalirkan 10 ml NaCl 2% dan 10 ml aquades. Selanjutnya sampel di-elusi dengan 3 ml bufer fosfat 0.2 M dalam asetonitril (pelarut elusi penisilin). Hasil elutan kemudian dipindahkan ke dalam aliran gas nitrogen sampai kering. Residu disuspensikan kembali dengan 10 ml fase gerak (asetonitril 0.1%), kemudian divortex selama 2 menit dan dipindahkan ke dalam vial 2 ml untuk dimasukkan dalam alat HPLC. Hasil dari pengujian dengan HPLC ditampilkan dalam bentuk kromatogram. Waktu dan volume retensi pada setiap senyawa ditunjukkan dengan munculnya beberapa puncak. Uji kualitatif dilakukan dengan mencocokkan waktu retensi masing-masing puncak pada kromatogram sampel dengan waktu retensi senyawa standar. Lebar dan tinggi puncak digunakan untuk menentukan besarnya konsentrasi diukur secara otomatis oleh alat pengolah data. Analissis Data Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis deskriptif dengan menyajikan data dalam bentuk tabel dan gambar.

44 20

45 HASIL DAN PEMBAHASAN Perhitungan sampel berdasarkan jumlah susu pasteurisasi yang diimpor dari Australia pada tahun 2011 yaitu kg, sehingga jumlah sampel yang diuji dalam penelitian ini sebanyak 59 dan digenapkan menjadi 60. Pengambilan sampel diperoleh secara bertahap yaitu 12 sampel pada setiap importasi/ kedatangan. Sebelum diuji, setiap sampel susu dibagi menjadi 3 bagian untuk selanjutnya disimpan dalam suhu beku -20 C. Pembagian sampel menjadi 3 bagian diperuntukkan 2 jenis pengujian yaitu uji bioassay dan HPLC serta 1 bagian sebagai arsip. Sebelum dilakukan pengujian residu antibiotika, sampel susu terlebih dahulu diuji kesempurnaan pasteurisasi (uji Storch) dan diuji terhadap pemanasan sterilisasi (uji Aschaffenburg). Uji pendahuluan ini untuk memastikan bahwa susu yang diperiksa adalah susu pasteurisasi dan jenis pasteurisasinya. Uji Pendahuluan Uji Storch, dimaksudkan untuk mengetahui kesempurnaan proses pasteurisasi. Menurut Rahman et al. (1992) enzim peroksidase adalah enzim yang ditemukan pada susu mentah dan mudah rusak oleh proses pemanasan. Susu yang tidak mengalami pemanasan dengan sempurna atau masih mengandung 5% susu mentah menunjukkan perubahan warna menjadi biru (Gambar 2). Pada uji ini, seluruh sampel susu menunjukkan warna putih yang artinya seluruh sampel adalah susu yang sudah dipanaskan/ pasteurisasi dengan sempurna. Reaksi ini menunjukkan bahwa kemungkinan susu pasteurisasi yang digunakan sebagai sampel dipanaskan pada suhu tinggi dalam waktu singkat (HTST) yang akan menginaktifkan enzim peroksidase. Proses pasteurisasi pada pemanasan dengan suhu 85 o C selama 8 detik (Rahman et al. 1992), suhu70 o C selama 150 menit, suhu 73 o C selama 13 menit, suhu 77 o C selama 30 detik atau selama 8 detik akan menginaktifkan enzim peroksidase (Sanjaya 1990).

46 22 A B C Gambar 2 Uji peroksidase, susu sterilisasi (A) warna putih, susu mentah (B) warna biru, dan susu pasteurisasi/ sampel (C) warna putih. Uji Aschaffenburg merupakan uji kesempurnaan pemanasan proses sterilisasi ditandai dengan adanya warna jernih pada susu sterilisasi. Pengujian ini dimaksudkan untuk mengetahui keberadaan albumin dalam susu. Susu yang sudah disterilisasi dengan sempurna tidak lagi mengandung albumin dan akan menunjukkan warna jernih. Apabila proses sterilisasinya tidak sempurna, masih mengandung albumin dan warna yang ditunjukkan adalah keruh. Pada susu yang mengalami proses pemanasan melebihi suhu 81 o C akan mengalami kerusakan albumin yang merupakan bagian dari protein whey dan terkoagulasi oleh proses pemanasan tinggi (Buckle et al. 1987). Uji ini dilakukan untuk membuktikan apnck A B C Gambar 3 Uji kekeruhan, susu sterilisasi (A) jernih, susu mentah (B) keruh, dan susu pasteurisasi/ sampel (C) keruh.

47 23 apakah sampel susu yang digunakan benar-benar susu pasteurisasi dan bukan susu sterilisasi. Hasil uji menunjukkan seluruh sampel berwarna keruh, hal ini menunjukkan bahwa susu yang digunakan tidak mengalami proses pemanasan di atas titik didih susu atau susu tersebut adalah susu pasteurisasi (Gambar 3). Susu pasteurisasi adalah susu yang telah mengalami proses pemanasan sehingga mempunyai daya simpan lebih panjang dari susu mentah disertai musnahnya mikroorganisme patogen yang dapat mengganggu kesehatan konsumen (Hubbert dan Hagstad 1991). Penggunaan panas pada pasteurisasi tidak banyak menimbulkan perubahan pada komposisi dan rasa susu sehingga masih seperti susu segar (Kay 1962). Proses pasteurisasi yang diikuti langsung dengan pendinginan menjadikan daya simpan produk akan lebih lama dengan mutu yang lebih baik (Frazier dan Westhoff 1988). Pemanasan 72 C selama 15 detik dengan suhu penyimpanan 1 sampai 2 C mempunyai daya simpan mencapai 3 minggu, sedangkan pada suhu penyimpanan 4 sampai 7 C daya simpan susu pasteurisasi hanya sampai 1 sampai 2 minggu. Kedua uji pendahuluan ini dilakukan untuk memastikan sampel susu yang digunakan dalam penelitian adalah benar-benar susu pasteurisasi dan bukan susu sterilisasi. Bioassay Bioassay adalah suatu pengujian yang menggunakan mikroorganisme untuk mendeteksi senyawa antibiotika yang masih aktif. Mikroorganisme yang digunakan untuk mendeteksi residu beta laktam adalah Bacillus stearothermophilus. Prinsip pengujian residu antibiotika beta laktam dengan menggunakan metode bioassay adalah dengan melihat dan mengukur diameter hambatan disekitar kertas cakram yang disebabkan oleh adanya residu beta laktam terhadap media agar yang mengandung B.stearothermophilus. Konsentrasi B. stearothermophilus yang digunakan sebesar 1.1 x 10 8 spora/ml. Besarnya daerah hambatan (zona terang) menunjukkan konsentrasi dari residu beta laktam. Hasil kuantitatif dari uji dapat diperoleh dengan membandingkan zona terang yang dihasilkan oleh sampel dengan zona terang yang ditunjukkan oleh kontrol. Besarnya kontrol yang digunakan adalah 0.01 IU/ ml dan diameter zona terang yang ditunjukkan antara sampai dengan mm. Pengukuran zona terang

48 24 menggunakan jangka sorong yang dilakukan dengan mengukur diameter dari lingkaran zona tersebut pada setiap kertas cakram sampel. Suatu sampel dinyatakan positif apabila menunjukkan zona terang lebih besar atau sama dengan 2 mm dari diameter kertas cakram yang digunakan (setidaknya pada 2 cawan petri). Diameter kertas cakram adalah 8 mm, sehingga sampel dinyatakan positif apabila mempunyai diameter zona terang sebesar 10 mm. b a Gambar 4 Hasil pengujian bioassay, kontrol positif (a), kontrol negatif (b), dan lainnya adalah sampel. Uji residu antibiotika beta laktam dengan menggunakan uji bioassay menunjukkan tidak terbentuknya zona terang pada semua sampel. Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya kandungan antibiotika beta laktam dalam sampel susu pasteurisasi tersebut atau paling tidak konsentrasinya dibawah dari limit deteksi uji. Hasil pengujian residu antibiotika pada sampel dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 8. Tabel 8 Hasil pemeriksaan residu antibiotika beta laktam dengan metode bioassay Jml sampel Hasil pemeriksaan 60 (-) negative Menurut Eenennaam et al. (1993), spesifitas dari metoda bioassay dapat ditunjukkan dari tipe golongan antibiotika yang dapat dideteksi dengan melihat hambatan pertumbuhan bakteri (B. stearothermophilus untuk golongan beta laktam) pada media agar. Limit deteksi bioassay terhadap golongan beta laktam